基于一測多評法的三葉青中5個黃酮類成分含量同時測定研究

摘" 要：該文建立高效液相色譜法（HPLC）一測多評法（QAMS）同時測定三葉青中蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷、槲皮素與山柰酚的含量。以蘆丁作為內(nèi)參物，同時測定三葉青中異槲皮苷、紫云英苷、槲皮素與山柰酚4個黃酮類成分的相對校正因子（RCF），并測定含量。將一測多評法測定結(jié)果與外標法測定結(jié)果進行比較。以蘆丁為內(nèi)標，異槲皮苷、紫云英苷、槲皮素、山柰酚的相對校正因子分別為0.644 1、0.618 5、0.243 3、0.262 3；同時采用外標法測定這5個成分的含量，將2種方法進行分析比較，結(jié)果沒有明顯差異。該研究建立的一測多評法簡單、準確，適用于三葉青中6種黃酮類化合物的同時測定，可用于三葉青的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞：三葉青；一測多評；高效液相色譜法；黃酮類化合物；同時測定

中圖分類號：R284.1" " " 文獻標志碼：A" " " " " 文章編號：2095-2945（2023）12-0067-04

Abstract： In this paper， to establish a HPLC Quantitative Analysis of Multi-components by Single-marker （QAMS） method for simultaneous determination of rutin， isoquercitrin， astragalin， quercetin and kaempferol in Lespedeza BuergeriMiq. Using rutin as internal reference， simultaneous determination was conducted to detect the relative correction factors （RCFs） in four flavonoids， i.e.， isoquercitrin， astragalin， quercetin and kaempferol， in Lespedeza Buergeri. The results of the QAMS method were compared with those by the external standard method. Using rutin as the internal standard， the relative correction factors of isoquercitrin， astragalin， quercetin and kaempferol were 0.6441， 0.6185， 0.243 3 and 0.2623， respectively. Meanwhile， the external standard method was used to determine the content of these five components. The two methods were analyzed and compared， and the results were not significantly different. The Quantitative Analysis of Multi-components by Single-marker method established in this study is simple and accurate， thereby is suitable for the simultaneous determination of 6 flavonoids in Lespedeza Buergeri， and can be used for quality control of Lespedeza Buergeri.

Keywords： Lespedeza BuergeriMiq; Quantitative Analysis of Multi-components by Single-marker（QAMS）; high performance liquid chromatography; flavonoid; simultaneous determination

三葉青為葡萄科崖爬藤屬植物三葉崖爬藤（Tet- rastigma hemsleyanum Diels et Gilg）的干燥塊根，產(chǎn)于浙江、廣西、云南等省，味微苦、平，具有清熱解毒、消腫止痛、化痰的功效，臨床上用于小兒高熱驚風、百日咳、疔瘡癰疽、淋巴結(jié)結(jié)核和毒蛇咬傷[1]。三葉青中含有黃酮、揮發(fā)油、酚類、氨基酸和多糖[2]等化合物，研究表明其中的黃酮類化合物與抗腫瘤[3]、抗炎[4]、抗氧化[5]等藥理作用密切相關(guān)。

三葉青在《中國藥典》（2020版）并無收載，在《浙江省中藥炮制規(guī)范》（2015年版）收載于根及根莖類中，但標準較為簡單，僅有性狀、粉末顯微鑒別和浸出物，缺少對三葉青中有效成分含量的測定標準。文獻報道主要采用HPLC外標法同時測定黃酮類成分或酚酸類成分的含量，檢測方法繁瑣、對照品多、檢測成本較高。本文建立一測多評法，以價格低廉、易得的蘆丁作為內(nèi)參物，建立三葉青中5種黃酮類化合物的含量同時測定，結(jié)果準確、靈敏度高、重現(xiàn)性好，為更加全面地控制三葉青的質(zhì)量提供參考。

1" 儀器與試藥

1.1" 儀器

島津LC 20高效液相色譜儀，電子天平（PL203梅特勒－托利多儀器有限公司），F(xiàn)-300型超聲波清洗機（福洋超聲儀器有限公司）。

1.2" 試藥

蘆丁對照品（批號：B20771），異槲皮苷對照品（批號：B21529），紫云英苷對照品（批號：B21704），槲皮素對照品（批號：B20527），山柰酚對照品（批號：B21126），均購自上海源葉生物科技有限公司， 檢定研究院；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純；水為娃哈哈純凈水；15批不同產(chǎn)地的三葉青樣品具體來源信息見表1，經(jīng)寧波衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學院張海豐副教授鑒定為葡萄科崖爬藤屬植物三葉崖爬藤（Tet-rastigma hemsleyanum Diels et Gilg）的干燥塊根。

2" 方法與結(jié)果

2.1" 對照品溶液制備

分別精密稱取蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷、槲皮素與山柰酚對照品適量，置于50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，得到濃度分別為0.329 6、0.46、0.292、0.163 2、0.25 μg/mL的混合對照品溶液。

2.2" 供試品溶液制備

精密稱取三葉青樣品粉末（過四號篩）約1.0 g，置于具塞錐形瓶中，加80%甲醇 50 mL，稱定質(zhì)量，超聲提取30 min，放冷，用80%甲醇補足減失的重量，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，即得供試品溶液。

2.3" 色譜條件

采用C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱，流動相：乙腈（A）-0.2%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～18 min，20%～25%A；18～25 min，25%～50%A），流速1 mL/min，檢測波長360 nm，色譜柱柱溫30 ℃。分別吸取混合對照品溶液、供試品溶液各10 μＬ，按上述色譜條件進樣測定，結(jié)果如圖１所示。

2.4" 方法學考察

2.4.1" 線性關(guān)系考察

精密吸取2.1項下混合對照品溶液1、2、4、8、10、20 μL，分別進樣，記錄HPLC譜圖。以對照品的進樣量（μg）為橫坐標（x），峰面積為縱坐標（y），繪制標準曲線，得到各成分回歸方程，結(jié)果見表2，表明各種成分的質(zhì)量均與色譜峰面積線性關(guān)系良好。

2.4.2" 精密度試驗

取混合對照品溶液適量，按2.3項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，計算得到蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷、槲皮素與山柰酚峰面積的相對標準偏差（RSD）分別為0.23%、0.14%、0.32%、0.17%、0.22%，表明儀器精密度良好。

2.4.3" 穩(wěn)定性試驗

取三葉青供試品溶液適量，分別在0、2、4、6、12、24 h，按2.3項下的色譜條件進樣測定，計算得到蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷、槲皮素和山柰酚峰面積的RSD分別0.67%、1.24%、2.53%、2.14%、0.42%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.4" 重復性試驗

精密稱取同一批三葉青供試品適量，按2.2項下方法平行制備6份供試品溶液，按2.3項下色譜條件進樣測定，計算得到蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷、槲皮素、山柰酚的峰面積RSD分別為1.22%、1.00%、1.67%、2.59%、2.98%，表明該方法重復性良好。

2.4.5" 加樣回收率試驗

精密稱取已知成分含量的三葉青供試品約1.0 g，共6份，等量加入5個對照品，按2.2項下方法制備供試品溶液，按2.3項下色譜條件進樣測定，計算得到蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷、槲皮素、山柰酚的平均加樣回收率分別為101.31%、100.13%、102.14%、100.20%、101.29%，RSD分別為0.57%、1.67%、1.00%、2.25%、2.11%，表明該方法準確度良好。

2.5" 一測多評法的建立

2.5.1" 相對校正因子的計算

分別精密吸?。?1項下方法制備的混合對照品溶液，按２.3項下色譜條件，吸取2、4、6、8、10 μＬ注入色譜儀，平行進樣測定２次，記錄峰面積。以蘆丁為內(nèi)參物，按照fｘ/r=（Cr×Ax）/（Cx×Ar）[6]，（式中Cr為參照物質(zhì)量濃度，Ar為參照物峰面積，Cx為其他對照組分質(zhì)量濃度，Ax為其他對照組分峰面積），分別計算異槲皮苷、紫云英苷、槲皮素、山柰酚的fｘ/r，結(jié)果見表3，分別為0.644 1、0.618 5、0.243 3、0.262 3，RSD分別為0.40％、0.70％、2.64％、0.51%。

2.5.2" 相對校正因子的重現(xiàn)性計算

考察不同儀器及色譜柱對相對校正因子f及相對保留時間值t的影響，結(jié)果見表4。不同儀器及色譜柱下三葉青中4個黃酮類成分的相對校正因子的RSD在0.27%～1.15%，相對保留時間的RSD在0.30%～1.75%。結(jié)果表明不同高效液相色譜儀和色譜柱對相對校正因子影響較小。

2.6" 一測多評法與外標法結(jié)果比較

取不同產(chǎn)地和批次的三葉青樣品，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，分別精密吸取供試品溶液10 μL，按照2.3項下方法色譜條件進樣，測定峰面積。采用外標法（EMS）和一測多評法（QAMS）分別計算樣品中5個黃酮類成分的含量，結(jié)果見表5。計算２種測定方法下的相對誤差（相對誤差＝（QAMS含量-ESM含量）÷QAMS含量×100%）[7]，比較QAMS法與ESM的相對誤差小于0.90％。說明建立的三葉青QAMS分析方法測定結(jié)果準確、可信。

3" 結(jié)束語

本實驗建立的一測多評法，準確，簡便，實現(xiàn)了僅用蘆丁一個標準品同時對三葉青中5個黃酮類成分的含量測定，為提高三葉青的質(zhì)量控制標準提供了科學、簡便的方法，既實現(xiàn)了多成分的質(zhì)量控制，又解決了標準品對照品緊缺和檢測成本過高的問題，為三葉青質(zhì)量標準的制定和提升提供參考。

參考文獻：

[1] 浙江省食品藥品監(jiān)督管理局.浙江省中藥炮制規(guī)范[M].杭州：中國中醫(yī)藥出版社，2015：5-6.

[2] 陳麗蕓，郭素華.三葉青的化學成分及藥理作用研究進展[J].浙江中醫(yī)藥大學學報，2012，36（12）：1368-1370．

[3] ZHONG L， ZHENG J， SUN Q， et al. Radix tetrastigma hemsleyani flavone inhibits proliferation，migration，and invasion of human lung carcinoma A549 cells[J]. Onco Targets Ther，2016，9（1）：635-641.

[4] 劉丹丹，曹綱，張琦，等.三葉青黃酮經(jīng)p38MAPK和NF-kB途徑抑制老年小鼠急性肺損傷[J].中國藥理學通報，2015，31（12）：1725-1730.

[5] 許海順．吳學謙．熊科輝．等.三葉青不同洗脫組分的抗氧化活性研究[J].中華中醫(yī)藥學刊，2015，33（8）：1968-1971，2068.

[6] 王智民，錢忠直，張啟偉，等．一測多評法建立的技術(shù)指南[J]．中國中藥雜志，2011，36（6）：657-658.

[7] 萬紅才，徐作剛，段萍，等.一測多評法測定烏蕨中５個黃酮成分含量[J]．藥物分析雜志，2021，41（12）：2211-2218.