基于一測(cè)多評(píng)法的三葉青中5個(gè)黃酮類成分含量同時(shí)測(cè)定研究

摘" 要：該文建立高效液相色譜法（HPLC）一測(cè)多評(píng)法（QAMS）同時(shí)測(cè)定三葉青中蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷、槲皮素與山柰酚的含量。以蘆丁作為內(nèi)參物，同時(shí)測(cè)定三葉青中異槲皮苷、紫云英苷、槲皮素與山柰酚4個(gè)黃酮類成分的相對(duì)校正因子（RCF），并測(cè)定含量。將一測(cè)多評(píng)法測(cè)定結(jié)果與外標(biāo)法測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較。以蘆丁為內(nèi)標(biāo)，異槲皮苷、紫云英苷、槲皮素、山柰酚的相對(duì)校正因子分別為0.644 1、0.618 5、0.243 3、0.262 3；同時(shí)采用外標(biāo)法測(cè)定這5個(gè)成分的含量，將2種方法進(jìn)行分析比較，結(jié)果沒有明顯差異。該研究建立的一測(cè)多評(píng)法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確，適用于三葉青中6種黃酮類化合物的同時(shí)測(cè)定，可用于三葉青的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞：三葉青；一測(cè)多評(píng)；高效液相色譜法；黃酮類化合物；同時(shí)測(cè)定

中圖分類號(hào)：R284.1" " " 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A" " " " " 文章編號(hào)：2095-2945（2023）12-0067-04

Abstract： In this paper， to establish a HPLC Quantitative Analysis of Multi-components by Single-marker （QAMS） method for simultaneous determination of rutin， isoquercitrin， astragalin， quercetin and kaempferol in Lespedeza BuergeriMiq. Using rutin as internal reference， simultaneous determination was conducted to detect the relative correction factors （RCFs） in four flavonoids， i.e.， isoquercitrin， astragalin， quercetin and kaempferol， in Lespedeza Buergeri. The results of the QAMS method were compared with those by the external standard method. Using rutin as the internal standard， the relative correction factors of isoquercitrin， astragalin， quercetin and kaempferol were 0.6441， 0.6185， 0.243 3 and 0.2623， respectively. Meanwhile， the external standard method was used to determine the content of these five components. The two methods were analyzed and compared， and the results were not significantly different. The Quantitative Analysis of Multi-components by Single-marker method established in this study is simple and accurate， thereby is suitable for the simultaneous determination of 6 flavonoids in Lespedeza Buergeri， and can be used for quality control of Lespedeza Buergeri.

Keywords： Lespedeza BuergeriMiq; Quantitative Analysis of Multi-components by Single-marker（QAMS）; high performance liquid chromatography; flavonoid; simultaneous determination

三葉青為葡萄科崖爬藤屬植物三葉崖爬藤（Tet- rastigma hemsleyanum Diels et Gilg）的干燥塊根，產(chǎn)于浙江、廣西、云南等省，味微苦、平，具有清熱解毒、消腫止痛、化痰的功效，臨床上用于小兒高熱驚風(fēng)、百日咳、疔瘡癰疽、淋巴結(jié)結(jié)核和毒蛇咬傷[1]。三葉青中含有黃酮、揮發(fā)油、酚類、氨基酸和多糖[2]等化合物，研究表明其中的黃酮類化合物與抗腫瘤[3]、抗炎[4]、抗氧化[5]等藥理作用密切相關(guān)。

三葉青在《中國(guó)藥典》（2020版）并無(wú)收載，在《浙江省中藥炮制規(guī)范》（2015年版）收載于根及根莖類中，但標(biāo)準(zhǔn)較為簡(jiǎn)單，僅有性狀、粉末顯微鑒別和浸出物，缺少對(duì)三葉青中有效成分含量的測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)。文獻(xiàn)報(bào)道主要采用HPLC外標(biāo)法同時(shí)測(cè)定黃酮類成分或酚酸類成分的含量，檢測(cè)方法繁瑣、對(duì)照品多、檢測(cè)成本較高。本文建立一測(cè)多評(píng)法，以價(jià)格低廉、易得的蘆丁作為內(nèi)參物，建立三葉青中5種黃酮類化合物的含量同時(shí)測(cè)定，結(jié)果準(zhǔn)確、靈敏度高、重現(xiàn)性好，為更加全面地控制三葉青的質(zhì)量提供參考。

1" 儀器與試藥

1.1" 儀器

島津LC 20高效液相色譜儀，電子天平（PL203梅特勒－托利多儀器有限公司），F(xiàn)-300型超聲波清洗機(jī)（福洋超聲儀器有限公司）。

1.2" 試藥

蘆丁對(duì)照品（批號(hào)：B20771），異槲皮苷對(duì)照品（批號(hào)：B21529），紫云英苷對(duì)照品（批號(hào)：B21704），槲皮素對(duì)照品（批號(hào)：B20527），山柰酚對(duì)照品（批號(hào)：B21126），均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司， 檢定研究院；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純；水為娃哈哈純凈水；15批不同產(chǎn)地的三葉青樣品具體來(lái)源信息見表1，經(jīng)寧波衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院張海豐副教授鑒定為葡萄科崖爬藤屬植物三葉崖爬藤（Tet-rastigma hemsleyanum Diels et Gilg）的干燥塊根。

2" 方法與結(jié)果

2.1" 對(duì)照品溶液制備

分別精密稱取蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷、槲皮素與山柰酚對(duì)照品適量，置于50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，得到濃度分別為0.329 6、0.46、0.292、0.163 2、0.25 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.2" 供試品溶液制備

精密稱取三葉青樣品粉末（過四號(hào)篩）約1.0 g，置于具塞錐形瓶中，加80%甲醇 50 mL，稱定質(zhì)量，超聲提取30 min，放冷，用80%甲醇補(bǔ)足減失的重量，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，即得供試品溶液。

2.3" 色譜條件

采用C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱，流動(dòng)相：乙腈（A）-0.2%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～18 min，20%～25%A；18～25 min，25%～50%A），流速1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)360 nm，色譜柱柱溫30 ℃。分別吸取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液各10 μＬ，按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果如圖１所示。

2.4" 方法學(xué)考察

2.4.1" 線性關(guān)系考察

精密吸取2.1項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液1、2、4、8、10、20 μL，分別進(jìn)樣，記錄HPLC譜圖。以對(duì)照品的進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)（x），峰面積為縱坐標(biāo)（y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到各成分回歸方程，結(jié)果見表2，表明各種成分的質(zhì)量均與色譜峰面積線性關(guān)系良好。

2.4.2" 精密度試驗(yàn)

取混合對(duì)照品溶液適量，按2.3項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，計(jì)算得到蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷、槲皮素與山柰酚峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為0.23%、0.14%、0.32%、0.17%、0.22%，表明儀器精密度良好。

2.4.3" 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取三葉青供試品溶液適量，分別在0、2、4、6、12、24 h，按2.3項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算得到蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷、槲皮素和山柰酚峰面積的RSD分別0.67%、1.24%、2.53%、2.14%、0.42%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.4" 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同一批三葉青供試品適量，按2.2項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按2.3項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算得到蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷、槲皮素、山柰酚的峰面積RSD分別為1.22%、1.00%、1.67%、2.59%、2.98%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.5" 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知成分含量的三葉青供試品約1.0 g，共6份，等量加入5個(gè)對(duì)照品，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.3項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算得到蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷、槲皮素、山柰酚的平均加樣回收率分別為101.31%、100.13%、102.14%、100.20%、101.29%，RSD分別為0.57%、1.67%、1.00%、2.25%、2.11%，表明該方法準(zhǔn)確度良好。

2.5" 一測(cè)多評(píng)法的建立

2.5.1" 相對(duì)校正因子的計(jì)算

分別精密吸取２.1項(xiàng)下方法制備的混合對(duì)照品溶液，按２.3項(xiàng)下色譜條件，吸取2、4、6、8、10 μＬ注入色譜儀，平行進(jìn)樣測(cè)定２次，記錄峰面積。以蘆丁為內(nèi)參物，按照f(shuō)ｘ/r=（Cr×Ax）/（Cx×Ar）[6]，（式中Cr為參照物質(zhì)量濃度，Ar為參照物峰面積，Cx為其他對(duì)照組分質(zhì)量濃度，Ax為其他對(duì)照組分峰面積），分別計(jì)算異槲皮苷、紫云英苷、槲皮素、山柰酚的fｘ/r，結(jié)果見表3，分別為0.644 1、0.618 5、0.243 3、0.262 3，RSD分別為0.40％、0.70％、2.64％、0.51%。

2.5.2" 相對(duì)校正因子的重現(xiàn)性計(jì)算

考察不同儀器及色譜柱對(duì)相對(duì)校正因子f及相對(duì)保留時(shí)間值t的影響，結(jié)果見表4。不同儀器及色譜柱下三葉青中4個(gè)黃酮類成分的相對(duì)校正因子的RSD在0.27%～1.15%，相對(duì)保留時(shí)間的RSD在0.30%～1.75%。結(jié)果表明不同高效液相色譜儀和色譜柱對(duì)相對(duì)校正因子影響較小。

2.6" 一測(cè)多評(píng)法與外標(biāo)法結(jié)果比較

取不同產(chǎn)地和批次的三葉青樣品，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別精密吸取供試品溶液10 μL，按照2.3項(xiàng)下方法色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定峰面積。采用外標(biāo)法（EMS）和一測(cè)多評(píng)法（QAMS）分別計(jì)算樣品中5個(gè)黃酮類成分的含量，結(jié)果見表5。計(jì)算２種測(cè)定方法下的相對(duì)誤差（相對(duì)誤差＝（QAMS含量-ESM含量）÷QAMS含量×100%）[7]，比較QAMS法與ESM的相對(duì)誤差小于0.90％。說(shuō)明建立的三葉青QAMS分析方法測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確、可信。

3" 結(jié)束語(yǔ)

本實(shí)驗(yàn)建立的一測(cè)多評(píng)法，準(zhǔn)確，簡(jiǎn)便，實(shí)現(xiàn)了僅用蘆丁一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品同時(shí)對(duì)三葉青中5個(gè)黃酮類成分的含量測(cè)定，為提高三葉青的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供了科學(xué)、簡(jiǎn)便的方法，既實(shí)現(xiàn)了多成分的質(zhì)量控制，又解決了標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照品緊缺和檢測(cè)成本過高的問題，為三葉青質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定和提升提供參考。

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