基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討菊苣抗菌作用機(jī)制

吾爾麥提汗·麥麥提明，買買提明·買合木提，麥合皮熱提罕·麥麥提明

1.新疆維吾爾醫(yī)學(xué)專科學(xué)校，新疆 和田 848000；2.和田地區(qū)人民醫(yī)院，新疆 和田 848000

菊苣為維吾爾族和蒙古族習(xí)用藥材，亦是《中華人民共和國(guó)藥典》中收載的中藥材，來(lái)源于菊科植物毛菊苣或菊苣的干燥地上部分或根，具有清肝利膽、健胃消食、利尿消腫等功效[1]，在臨床上對(duì)于濕熱型肝炎、全身性水腫等疾病的治療具有良好的效果[2]。

菊苣主要成分包括半萜類、黃酮類、香豆素類等。現(xiàn)代藥理研究結(jié)果表明，菊苣可以控制血糖、血脂水平，并且能夠有效預(yù)防心腦血管疾病，還能發(fā)揮抗癌效果。此外，有研究發(fā)現(xiàn)毛菊苣根對(duì)枯草芽孢桿菌、金色葡萄球菌、傷寒沙門氏菌和大腸桿菌均有抑制作用[3]。從以上報(bào)告可以看出菊苣具有較強(qiáng)的抗菌作用，但是菊苣抗菌作用機(jī)制還未得到詳細(xì)論證。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)指的是運(yùn)用計(jì)算機(jī)、基因組學(xué)、拓?fù)鋵W(xué)等方面的知識(shí)，通過(guò)構(gòu)建疾病-基因-靶點(diǎn)-藥物共同作用的網(wǎng)絡(luò)，深度挖掘中藥的藥物機(jī)理、作用原理、毒性等特點(diǎn)的新興學(xué)科之一，在闡明中藥綜合作用機(jī)制方面具有諸多優(yōu)勢(shì)[4]，并且其已成功地應(yīng)用于闡明中醫(yī)藥的治療機(jī)制。本文結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法分析菊苣抗菌作用機(jī)制，以期為后續(xù)進(jìn)一步開展菊苣抗菌活性研究提供一定的理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

1 方法

1.1 菊苣有效成分篩選及靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)

首先利用TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索菊苣中所有化學(xué)成分，進(jìn)而設(shè)定篩選條件：OB≥30%、DL≥0.18，據(jù)此選擇菊苣有效成分，隨后使用TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)獲取相應(yīng)的靶點(diǎn)信息，通過(guò)GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)得到有效成分靶點(diǎn)的gene symbol。

1.2 抗菌基因靶點(diǎn)分析

將“antibacterial”設(shè)定為檢索關(guān)鍵詞，然后通過(guò)GeneCards 網(wǎng)站獲取抗菌基因靶點(diǎn)。

1.3 菊苣“藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病”可視化網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

根據(jù)篩選出的菊苣活性成分所對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)和抗菌相關(guān)靶點(diǎn)，使用VENNY2.1 在線作圖軟件繪制韋恩圖。選取菊苣活性成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)基因與抗菌基因交集的部分，通過(guò)Cytoscape3.7.2 軟件的應(yīng)用，構(gòu)建菊苣網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 菊苣抗菌的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將菊苣有效成分抗菌靶點(diǎn)注釋STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)，并將“Homosapiens”設(shè)置為物種類型，其他參數(shù)只需保持默認(rèn)數(shù)據(jù)即可，以此建立蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(PPI)。把PPI 網(wǎng)絡(luò)結(jié)果輸入Cytoscape 軟件中并利用cytoNCA 插件篩選出Degree 值排名前20 的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.5 基因富集分析

將關(guān)鍵靶點(diǎn)注釋metascape，將物種設(shè)定為“Homosapiens”，完成關(guān)鍵靶點(diǎn)GO 生物學(xué)富集分析與KEGG 代謝通路富集分析，然后使用微生信在線作圖軟件完成富集結(jié)果的條形圖和氣泡圖的制作。

2 結(jié)果

2.1 菊苣有效成分及靶點(diǎn)的篩選結(jié)果

在TCMSP 中，基于DL≥0.18 且OB≥30%的條件進(jìn)行篩選，合計(jì)獲得12 個(gè)菊苣有效成分，具體情況見表1。在12 個(gè)菊苣活性組分中，共找到156 個(gè)靶點(diǎn)，將重復(fù)部分刪除后，獲得了100 個(gè)菊苣潛在靶點(diǎn)，菊苣成分ψ-taraxastero、cichoriosideB 并未匹配到合適的靶點(diǎn)。

表1 菊苣中12 種有效成分的基本信息

2.2 抗菌相關(guān)基因靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)結(jié)果

在GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)中共搜索到抗菌相關(guān)基因靶點(diǎn)884 個(gè)。

2.3 菊苣“藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病’可視化網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將菊苣100 個(gè)潛在靶點(diǎn)和884 個(gè)抗菌基因靶點(diǎn)輸入VENNY2.1 軟件中繪制韋恩圖，結(jié)果如圖1 所示，兩者取交后獲得了46 個(gè)疾病—藥物共同潛在靶點(diǎn)。利用這46 個(gè)共同潛在靶點(diǎn)，在Cytoscape3.7.2 軟件的配合下完成“藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病”模型的建立（圖2）。對(duì)測(cè)試結(jié)果進(jìn)行分析可知：菊苣9 種有效成分在46 個(gè)抗菌靶點(diǎn)發(fā)揮抗菌功效均起到關(guān)鍵作用。其中，木犀草素、β-谷甾醇、（2R）-3-[3-（5-allyl-2-hydroxyphenyl）-4-hydroxyphenyl]propane-1,2-diol擁有最多的對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)。由此判斷，3 種成分對(duì)于抗菌具有較強(qiáng)的功效。

圖1 抗菌相關(guān)靶點(diǎn)與菊苣有效成分作用靶點(diǎn)的韋恩圖

圖2 “藥物-成分-靶點(diǎn)-抗菌”網(wǎng)絡(luò)

2.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)創(chuàng)建和核心基因篩選結(jié)果

使用STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)完成46 個(gè)共有靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)的PPI 網(wǎng)絡(luò)，具體情況如圖3 所示。該P(yáng)PI 網(wǎng)絡(luò)中共有46 個(gè)節(jié)點(diǎn)和489 條邊，其中45 個(gè)靶點(diǎn)直接進(jìn)入PPI 網(wǎng)絡(luò)，剩余1 個(gè)靶點(diǎn)（LACTB）屬于游離靶點(diǎn)蛋白，不參與PPI。將PPI 網(wǎng)絡(luò)結(jié)果輸入Cytoscape 軟件中并利用cytoNCA 插件篩選出Degree 值排名前20 的關(guān)鍵靶點(diǎn)，Degree 值排名前20 的關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白包括白細(xì)胞介素-6、RAC-α 絲氨酸/蘇氨酸-蛋白激酶、TP53 細(xì)胞腫瘤抗原、腫瘤壞死因子、胱天蛋白酶3、基質(zhì)金屬蛋白酶9、轉(zhuǎn)錄因子JUN、HSP90AA1、前列腺素G/H 合酶2、表皮生長(zhǎng)因子受體等，說(shuō)明上述蛋白之間的相互作用在網(wǎng)絡(luò)中極其關(guān)鍵。

圖3 抗菌靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)

2.5 GO 功能富集分析和KEGG 通路富集分析結(jié)果

GO 功能富集分析將Degree 值排名前20 的關(guān)鍵靶點(diǎn)輸入metascape 中，將“Homo sapiens”設(shè)置為物種類型，以P＜0.01，最低富集數(shù)設(shè)計(jì)為1.5 進(jìn)行關(guān)鍵靶點(diǎn)GO 生物學(xué)富集分析，得到生物過(guò)程為20個(gè)，細(xì)胞組分為6 條，分子功能為8 條，結(jié)果如圖4所示。

圖4 抗菌靶點(diǎn)GO 功能富集分析柱狀

KEGG 通路富集分析將Degree 值排名前20 的關(guān)鍵靶點(diǎn)輸入metascape 中，將“Homo sapiens”設(shè)置為物種類型，以P＜0.01，最低富集數(shù)設(shè)計(jì)為1.5 進(jìn)行關(guān)鍵靶點(diǎn)KEGG 代謝通路富集分析，得到12 條信號(hào)通路，結(jié)果如圖5 所示。

圖5 抗菌靶點(diǎn)KEGG 功能富集分析氣泡圖

3 討論

現(xiàn)代藥理學(xué)及各方面研究結(jié)果表明，大部分中藥抗菌的作用機(jī)理都是通過(guò)激活生物體內(nèi)在的其他抗菌因子[5]來(lái)激發(fā)生物體免疫力，從而降低細(xì)菌毒副作用，并提高生物體自身抵抗細(xì)菌的能力和機(jī)體自我修復(fù)的能力，以達(dá)到抗菌的目的。雖然已有關(guān)于菊苣的抗菌作用的相關(guān)報(bào)道[3-4]，但其抗菌作用機(jī)制尚未得到過(guò)詳細(xì)論證。本文采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對(duì)菊苣中與抗菌有關(guān)的有效成分、作用靶點(diǎn)及生物信號(hào)通路情況進(jìn)行研究，結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)了菊苣9 種有效成分在46 個(gè)抗菌靶點(diǎn)抗菌時(shí)起到主要作用，其中木犀草素、β-谷甾醇、MOL008539 擁有最多的對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)，由此推測(cè)，這3 種成分可能在抗菌過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。也有研究[6]發(fā)現(xiàn)，木犀草素能夠發(fā)揮抗菌、抗病毒、抗炎癥、抗氧化等作用。劉淼等[7]通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)木犀草素可破壞細(xì)菌細(xì)胞膜，在浮游狀態(tài)下導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)變動(dòng)，進(jìn)而幫助細(xì)胞內(nèi)容物產(chǎn)生滲漏效果，以此提升抗菌的作用，其通過(guò)限制生物膜形成等方式來(lái)降低抗生物被膜活性。Lokadi Pierre Luhata[8]首次發(fā)現(xiàn)，從紅樓花葉中分離出的β-谷甾醇對(duì)金黃色葡萄球菌具有抑菌效果。還有文獻(xiàn)報(bào)道[9]β-谷甾醇具有抗真菌活性。雖然缺乏關(guān)于MOL008539（別名為Magnolignan A）的抗菌作用的相關(guān)報(bào)道，但莫斯喻等[10]表示厚樸具有保護(hù)神經(jīng)、心腦血管以及抗氧化、抗菌、抗炎、抗?jié)儭⒖鼓[瘤等功效。通過(guò)這些報(bào)告可以推測(cè)出MOL008539 可能參與抗菌過(guò)程。此結(jié)果與以往文獻(xiàn)報(bào)道相一致，因此進(jìn)一步確定了菊苣通過(guò)這3 種活性成分作用于多個(gè)靶點(diǎn)發(fā)揮抗菌作用。

從PPI 網(wǎng)絡(luò)分析的結(jié)果來(lái)看，PPI 網(wǎng)絡(luò)Degree值排名前5 的關(guān)鍵靶點(diǎn)分別為白細(xì)胞介素-6、RAC-α 絲氨酸/蘇氨酸-蛋白激酶、TP53 細(xì)胞腫瘤抗原、腫瘤壞死因子、胱天蛋白酶3。AKT1 被激活后參與細(xì)胞生長(zhǎng)、代謝、增殖和凋亡等多種生物學(xué)過(guò)程，并且其屬于重要信號(hào)通路[11]；IL-6 本身屬于炎癥細(xì)胞因子，對(duì)于炎癥反應(yīng)能夠發(fā)揮重要的功能和效果，并能有效提升T 細(xì)胞、B 細(xì)胞的活性，同時(shí)刺激外援物質(zhì)的識(shí)別應(yīng)答功能，以此發(fā)揮抗菌消炎的效果[12]。腫瘤壞死因子可誘導(dǎo)某些腫瘤細(xì)胞的程序性死亡，在特定條件下能促進(jìn)細(xì)胞增殖，提升細(xì)胞分化速度，并且能持續(xù)調(diào)整患者身體免疫效果[13]。胱天蛋白酶3 作為參與細(xì)胞凋亡過(guò)程的關(guān)鍵執(zhí)行因子，廣泛參與細(xì)胞凋亡的過(guò)程[14]。TP53 細(xì)胞腫瘤抗原會(huì)主動(dòng)進(jìn)行DNA 修復(fù)、細(xì)胞死亡促進(jìn)等，對(duì)于機(jī)體免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)發(fā)揮著特定的功能[15]。因此可以得知菊苣的抗菌靶點(diǎn)通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞凋亡、刺激機(jī)體的識(shí)別應(yīng)答、免疫調(diào)節(jié)等途徑發(fā)揮抗菌作用。

從GO 功能富集結(jié)果來(lái)看，與抗菌有關(guān)的有效成分靶點(diǎn)主要集中在平滑肌細(xì)胞增殖的調(diào)控、神經(jīng)元死亡的調(diào)控、蛋白質(zhì)磷酸化的正向調(diào)控、凋亡過(guò)程的正向調(diào)控、炎癥反應(yīng)的調(diào)控上。由KEGG 通路富集結(jié)果來(lái)看，抗菌靶點(diǎn)主要富集在癌癥通路方面，其次為脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化，人巨細(xì)胞病毒感染、南美錐蟲病、卡波氏肉瘤等相關(guān)皰疹病毒感染，血流剪切力與動(dòng)脈粥樣硬化，JAK-STAT 信號(hào)通路、甲型流感等信號(hào)通路。上述結(jié)論表明，菊苣抗菌作用可通過(guò)多種生物途徑、多條信號(hào)通路共同實(shí)現(xiàn)。

綜上所述，本文在研究過(guò)程中以網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法為基礎(chǔ)，分析菊苣中發(fā)揮抗菌作用的有效成分、靶點(diǎn)和信號(hào)通路，以期為后續(xù)菊苣抗菌活性研究活動(dòng)的開展提供一定的理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。