豬源不動桿菌分子生物學鑒定及致病性研究

任柯昱，陶 玲

信陽職業技術學院檢驗技術學院，河南 信陽 464000

不動桿菌屬于人獸共患致病菌，在世界范圍內分布廣泛，多寄生在豬、牛、羊、駱駝等動物以及人類的腸道中。該菌可以引起人和動物的細菌性腹瀉、腸炎及腸毒血癥等疾病，其中以仔豬腹瀉最為嚴重。近年來，隨著生豬養殖規模化和集約化水平的不斷提高，生豬養殖過程中由豬腸道疾病造成的經濟損失逐年增加，尤其是由豬源不動桿菌所引起的腹瀉給養豬業帶來了嚴重的經濟損失[1]。鑒于分子生物學技術快速、簡便、無創等特點，可以將其用于豬源不動桿菌的快速診斷和監測，因此，本文采用PCR檢測法對豬源不動桿菌進行分子生物學鑒定并研究其致病性和致病機制。

1 豬源不動桿菌

1.1 豬源不動桿菌概述

豬源不動桿菌是一種可以引起豬腸炎和腹瀉的細菌，它屬于不動桿菌屬，是一類革蘭氏陰性桿狀細菌[2]。豬源不動桿菌廣泛存在于自然環境中，包括土壤和水源中等。豬源不動桿菌通常以潛伏感染的形式存在于豬體內，特別是集中在生殖器官、淋巴節點、脾臟和關節等部位。被感染的豬可能會表現出發熱、食欲不振、消瘦、流產、不育等癥狀。傳播途徑包括直接接觸被感染的動物、攝入被污染的食物或水源，以及通過胎盤和分娩過程傳染給后代。人類與感染的豬接觸、食用未經充分加熱處理的感染性動物產品或通過呼吸道都會感染豬源不動桿菌。

1.2 豬源不動桿菌的致病性

豬源不動桿菌的致病性主要與其產生的一些特定致病因子和毒力機制有關。致病因子包括細菌膠囊、細菌腺毒素、附著因子以及分泌的其他蛋白質等。這些因子可以幫助菌株抵抗宿主的免疫系統，使菌株進入宿主細胞并引發其病理反應[3]。此外，不同菌株之間的遺傳變異和基因調控也會影響其致病性，這是因為不同菌株可能具有不同的致病因子組合和毒力水平。

2 豬源不動桿菌分子生物學鑒定

2.1 鑒定準備

在對豬源不動桿菌進行分子生物學鑒定之前，需要準備以下樣品和PCR 儀器。

樣品：收集需要進行鑒定的豬源不動桿菌樣品，可以是豬體內的組織樣品（如腸道組織）、糞便樣品、尿液樣品等。設定良好的保存條件以保障樣品的新鮮度，避免樣品受到污染或降解。本研究收集的是A市Q 養殖場所養殖的豬的腸道組織及糞便。

DNA 提取試劑盒：用于從樣品中提取豬源不動桿菌的DNA。根據實驗室所選用的試劑盒，按照說明書上的步驟進行DNA 提取。

PCR 管和試劑：準備PCR 試劑盒，包括引物、酶、緩沖液等。

PCR 儀器：使用PCR 儀器進行PCR 反應。確保PCR 儀器的工作狀態正常，并設置實驗所需參數。

除了上述準備工作外，還需要注意：①實驗室操作。在開展PCR 實驗之前，要確保實驗室的整潔和衛生，避免樣品受到外源性DNA 污染。最好專門設置一個凈化區用于進行PCR 反應。②引物設計。根據豬源不動桿菌的基因序列，選擇合適的引物進行PCR 擴增，以確保引物的特異性和準確性。③PCR條件優化。根據實驗需要，優化PCR 反應的溫度、時間和循環次數等參數，以提高PCR 擴增效率和特異性。④陰性對照。在PCR 反應中設置陰性對照，檢測實驗過程中的污染情況。

2.2 鑒定方法

PCR（聚合酶鏈反應）是一種常用的分子生物學技術，可用于快速、準確地檢測和鑒定病原體。PCR鑒定方法的基本步驟可分為以下六步：第一，提取模板DNA；第二，引物設計；第三，準備PCR 反應體系；第四，設置PCR 擴增條件；第五，PCR 擴增反應；第六步，檢測擴增產物。

PCR 鑒定方法具有快速、敏感、特異性強等優點，已被廣泛應用于微生物學研究、臨床診斷、食品安全監測等領域。在豬源不動桿菌的鑒定中，PCR可以通過擴增特定基因片段或DNA 序列來確定是否存在該病原體，并且可以與其他相關方法結合使用，以進一步提高鑒定的準確性和可靠性，PCR 反應體系如表1 所示。

表1 PCR 反應體系

反應條件如下：94 ℃預變性5 min，95 ℃變性1 min，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環35 次，72℃繼續延伸10 min，4 ℃無限循環。

2.3 鑒定結果

鑒定結果如表2 所示。

表2 PCR 鑒定結果

在本次樣品PCR 分子生物學鑒定中，共鑒定出3 株洛非不動桿菌、5 株Towneri 不動桿菌、1 株瓊氏不動桿菌。

3 豬源不動桿菌的致病性機制研究

3.1 豬源不動桿菌的致病因子和毒力機制研究

研究豬源不動桿菌的致病因子和毒力機制對于預防和控制該病菌的傳播具有重要意義。首先，豬源不動桿菌的致病因子包括外毒素和內毒素。其中最重要的外毒素是豬源不動桿菌外毒素1（ApxI）、豬源不動桿菌外毒素2（ApxII）和豬源不動桿菌外毒素3（ApxIII）。這些外毒素可以通過破壞宿主細胞膜的完整性，引起組織壞死、細胞溶解和炎癥反應，從而造成感染豬源不動桿菌的嚴重癥狀。其次，豬源不動桿菌的毒力機制主要包括菌體附著、菌體入侵和菌體生長。豬源不動桿菌通過其表面結構與宿主細胞的表面結構進行特異性結合，能夠實現菌體的附著，進而入侵宿主細胞。在菌體入侵過程中，豬源不動桿菌可以利用一些細菌的分泌系統和表面分子將毒力因子注入宿主細胞內部。這些毒力因子產生的外毒素會破壞宿主細胞的膜結構，導致細胞溶解和壞死。

為了研究豬源不動桿菌的致病因子和毒力機制，可以通過蛋白質分離和鑒定技術來確定豬源不動桿菌所產生的外毒素和內毒素的類型及功能；可以使用免疫組織化學或免疫熒光染色技術來觀察豬源不動桿菌與宿主細胞之間的相互作用和內毒素的分布情況；可以利用細胞培養和小鼠感染模型，來評估豬源不動桿菌的致病性與毒力；還可以通過基因敲除或突變技術，來研究豬源不動桿菌致病因子和毒力機制中重要的基因與蛋白質。

3.2 菌株間遺傳變異和基因調控對致病性的影響

豬源不動桿菌是一種具有重要致病性的病原菌，其致病性機制涉及菌株間遺傳變異和基因調控的復雜網絡。研究菌株間遺傳變異和基因調控對豬源不動桿菌的致病性有利于深入了解該菌株的致病機制。首先，菌株間遺傳變異對于豬源不動桿菌的致病性具有顯著影響。不同菌株之間存在著遺傳多樣性，導致其在毒力因子表達和傳播方面存在顯著差異。對此，相關人員可以利用分子生物學技術，如PCR 和測序等方法，比較不同菌株的基因組，找出與其致病性相關的基因差異。通過研究這些功能和調控機制的差異，可以確定菌株間遺傳變異對于豬源不動桿菌的致病性影響的潛在機制。其次，基因調控也對豬源不動桿菌的致病性具有關鍵作用。豬源不動桿菌的基因表達受多種調控機制影響，如轉錄因子、非編碼RNA 和環境響應等。相關人員可以通過基因組學和轉錄組學等方法，來識別并分析與豬源不動桿菌致病性有關的調控元件和調控因子；可以利用RNA 測序等技術，揭示豬源不動桿菌在不同環境和宿主條件下的基因表達模式與調控機制。此外，還可以通過基因敲除、基因突變和基因表達調控等技術，來驗證調控因子對豬源不動桿菌致病性的影響。

3.3 對宿主免疫系統的影響和逃逸機制

豬源不動桿菌可以通過多種途徑來影響和躲避宿主免疫系統的攻擊，從而成功感染宿主并引發疾病。第一，免疫抑制因子。豬源不動桿菌可以產生各種用于抑制宿主免疫系統的因子，如細菌素、毒素等。這些因子能夠抑制宿主免疫細胞的增殖和功能的發揮，干擾宿主的免疫應答過程，并削弱宿主免疫系統的攻擊能力。第二，細菌致病因子。豬源不動桿菌能夠通過產生多種致病因子來干擾宿主免疫系統的正常功能。例如，菌株中的一些蛋白質能夠干擾宿主免疫細胞的信號轉導通路，從而抑制免疫細胞的活化和免疫應答。第三，對抗黏液和免疫球蛋白。豬源不動桿菌表面的多糖結構和蛋白質能夠與宿主分泌的黏液和免疫球蛋白相結合，形成膜上免疫防御屏障，抵擋免疫細胞的接觸和攻擊。第四，菌株間的遺傳變異和基因調控。不同菌株之間存在遺傳變異，這些變異可能會影響到豬源不動桿菌的致病性及其對宿主免疫系統的逃逸能力。相關人員需要通過對比不同菌株的基因組和基因表達模式來探索這些差異，并揭示菌株遺傳變異和基因調控對于豬源不動桿菌致病性機制的影響。

4 結語

豬源不動桿菌是一種感染豬類的主要致病菌，可以引起布魯氏菌病。布魯氏菌病是一種廣泛分布于世界范圍內的人獸共患傳染病，對養殖業和公共衛生造成了重大威脅。研究豬源不動桿菌的分子生物學特征及其致病性對于布魯氏菌病的防控、人畜健康以及分子鑒定技術的推廣具有重要意義。本文主要采用PCR 檢測技術對豬源不動桿菌進行分子生物學鑒定并研究其致病性和致病機制，希望可以為公共衛生防控工作提供參考。