1-脫氧-D-木桐糖-5-磷酸合酶（DXS）對枯草芽孢桿菌代謝途徑的影響

李雁潔，韓 旭

1.蘇州健雄職業技術學院，江蘇 蘇州 215411；2.沈陽化工大學，遼寧 沈陽 110142

萜類化合物在自然界中廣泛存在且種類繁多，一些中草藥中的有效成分及化妝品、食品工業、汽車工業等中的一些重要原材料都是萜類化合物。同時，萜類化合物有許多重要的生理功能，例如青蒿素及其衍生物被廣泛應用于治療瘧疾[1]；紫杉醇是治療癌癥的有效藥物[2]。隨著科技的發展，社會對萜類化合物的需求日益增加，然而傳統的天然提取方法和化學合成方法逐漸顯現出多種弊端：成本高、產量有限、污染環境等。因此，利用微生物發酵法生產萜類化合物變得更有前景。

萜類化合物的生物合成依賴于代謝前體異戊烯基二磷酸（IPP）和二甲基烯丙基二磷酸（DMAPP），而這兩種物質的形成主要來源于兩種代謝途徑，一種是MVA 途徑，另一種是MEP 途徑。MVA 途徑主要存在于大多數真核生物、古細菌和少數細菌中；而MEP 途徑則主要存在于大多數細菌、植物葉綠體和藻類中[3]。MEP 途徑包括七步酶促反應[4]，DXS 是參與第一步催化反應的關鍵酶，它以丙酮酸和3-磷酸甘油醛為底物，催化生成DXP（圖1）。對細菌MEP途徑的改造會影響與MEP 途徑相關的各種產物的產量。據報道，芽孢桿菌屬是微生物中異戊二烯產量最高的菌株[5]。有研究表明，在大腸桿菌中異源表達IspS 基因，并過表達dxs 和dxr 基因，可以促進異戊二烯產量的提升[6]。番茄紅素產量的增加也可以通過改進大腸桿菌MEP 途徑實現[7]。除此之外，還有關于通過改造MEP 途徑提高青蒿素[8]、紫杉醇[9]、類胡蘿卜素[10]等萜類化合物的報道。由此可見，DXS 的研究對于MEP 途徑的改造、提高萜類化合物的產量至關重要。對MEP 途徑中關鍵酶的研究不僅可以為改造MEP 途徑奠定理論基礎，也能為合成生物學和代謝工程生產萜類化合物提供有價值的理論支持。

圖1 DXS 催化MEP 途徑中的第一步反應

枯草芽孢桿菌遺傳背景清晰，具有安全、無致病性的特點，是用來進行微生物發酵的首選宿主菌[11]。本次研究克隆了枯草芽孢桿菌MEP 途徑的關鍵酶基因dxs，并將其與表達載體pHY-P43 相連接，構建出重組表達載體pHY-P43-dxs。之后，通過原生質體轉化法將重組表達載體導入枯草芽孢桿菌中，并進行重組菌株的鑒定。最后，利用氣相色譜-質譜法檢測重組菌株相較于野生型菌株的氣體釋放成分及含量的變化。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

枯草芽孢桿菌168、大腸桿菌JM09、大腸桿菌DH5α：沈陽化工大學制藥與生物工程學院生物工程實驗室提供；T-vector PMD19：購自寶生物工程(大連)有限公司；pHY-P43 質粒：購自淼靈質粒平臺。

1.2 實驗方法

1.2.1 dxs 基因的克隆與重組表達質粒的構建

首先從枯草芽孢桿菌168 基因組文庫中找到dxs 基因的堿基序列，設計引物。然后以提取的枯草芽孢桿菌的基因組為模板，PCR 擴增dxs 目的基因。根據pHY-P43 質粒上的多克隆位點選取BamH I和Bgl Ⅱ限制性核酸內切酶位點，將目的基因dxs與pHY-P43 質粒重組，再經過篩選、基因測序鑒定，最終獲得重組表達質粒。

1.2.2 重組質粒轉入枯草芽孢桿菌

將pHY-P43-dxs 重組質粒通過原生質體法轉入枯草芽孢桿菌，并通過質粒提取與鑒定方法進行重組菌株的鑒定。

1.2.3 氣相色譜-質譜聯用分析

將野生菌株（對照菌株）與重組菌株（轉入重組質粒的菌株）進行氣相色譜-質譜分析。

2 結果與分析

2.1 實驗結果

2.1.1 dxs 基因的克隆與重組表達質粒的構建

通過對比基因的測序結果，成功克隆并構建了含有dxs 目的基因片段的重組質粒，dxs 基因由1902個堿基對構成，編碼633 個氨基酸。

2.1.2 重組質粒轉入枯草芽孢桿菌

以野生菌為對照，通過對菌株的質粒提取以及雙酶切、PCR 多項分子水平的鑒定，最終得到含有重組表達載體pHY-P43-dxs 的枯草芽孢桿菌重組菌株。

2.1.3 氣相色譜-質譜聯用分析

氣相結果顯示，野生型枯草芽孢桿菌樣品瓶中氣體的主要成分為二氧化碳和鄰苯二甲酸異丁正壬酯，分別占氣體總量的94.012%和5.988%。而含有重組表達載體pHY-P43-dxs 的枯草芽孢桿菌樣品瓶中的氣體成分全部為二氧化碳，且二氧化碳含量高于野生對照株。如圖2 所示。

圖2 氣相色譜-質譜分析

2.2 分析與討論

氣相色譜-質譜分析結果表明，野生型枯草芽孢桿菌釋放的氣體主要成分為二氧化碳和鄰苯二甲酸異丁正壬酯，而含有重組表達載體pHY-P43-dxs的重組菌株釋放的氣體僅有二氧化碳，且釋放量增加。分析產生這個結果的原因可能是：生物體內的MEP 途徑與其他反應途徑（如TCA 循環）相互交叉，互相影響，互相制約。由于重組菌株內含有導入的重組表達載體pHY-P43-dxs，會引起重組菌株中dxs基因表達增加，從而引起MEP 代謝途徑異常，會引起下游的生物合成反應的負反饋效應，不僅抑制了MEP 途徑的下行，也促進了三羧酸循環，使得相應的呼吸和代謝能力隨之增強。因此，二氧化碳排放量增加，鄰苯二甲酸異丁正壬酯因代謝增強而消失。

該實驗現象為首次發現，尚未有相關的研究報道，因此該研究可以為細菌代謝途徑的分析和改造提供一定的理論基礎和參考價值。