不同無血清培養體系對人臍帶間充質干細胞生物學功能的影響

林惠珠?李翠平?陳曉燕?陽莉

【摘要】 目的 探討3種不同無血清培養體系對人臍帶間充質干細胞（hUC-MSC）體外培養的生物學功能的影響。方法 取3株臍帶組織，各分3組實驗組，經貼壁法分別置于3組不同無血清培養體系（A組：純化學成分合成的無血清培養體系，B組：血小板裂解物+基礎培養基的無血清培養體系，C組：纖維蛋白原包被+含重組人蛋白質的無血清培養體系）中培養至第3代，比較其細胞增殖能力、細胞表型、三系分化能力以及免疫調節功能。結果 3組實驗組細胞均呈長而扁平的梭形，貼壁生長，大小均一。其增殖曲線趨勢相似，A組和B組P2、P3代次的增殖能力優于C組（P均< 0.05）。3組實驗組細胞均符合國際干細胞協會對hUC-MSC細胞表面標志物鑒定的要求，A組和B組P3代次的CD29和CD90的表達量均高于C組（P均< 0.05），并且3組實驗組均具有三系分化能力。3組實驗組中P3代次的T淋巴細胞增殖率、Th1和Th17細胞亞群分泌的細胞因子比例均低于對照組，調節性T細胞（CD4+ CD25+ FOXP3+）比例均高于對照組，而3組實驗組之間兩兩比較差異無統計學意義（P均> 0.05）。結論 3種不同無血清培養體系的hUC-MSC均能保持其基本的生物學特性和免疫調節活性，純化學成分合成的無血清培養體系和血小板裂解物+基礎培養基的無血清培養體系的增殖能力和細胞表面標志物表達均優于纖維蛋白原包被+含重組人蛋白質的無血清培養體系。

【關鍵詞】 人臍帶間充質干細胞；無血清培養體系；生物學功能

Effects of different serum-free culture systems on the biological function of hUC-MSCs Lin Huizhu， Li Cuiping， Chen Xiaoyan， Yang Li. Biotherapy Center， the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University， Guangzhou 510630， China

Corresponding author， Yang Li， E-mail： yangli22@mail.sysu.edu.cn

【Abstract】 Objective To evaluate the effects of three different serum-free culture systems on the biological function of human umbilical cord mesenchymal stem cells （hUC-MSC） cultured in vitro. Methods Three strains of umbilical cord tissues were obtained，divided into 3 experimental groups and cultured to the 3rd generation （P3） in three different serum-free culture systems （Group A： serum-free culture system synthesized by pure chemical components，group B： serum-free culture system consisting of platelet lysate+basic culture medium，group C： serum-free culture system consisting of fibrinogen coating+recombinant human protein）. The cell proliferation，cell phenotype，three-line differentiation and immunomodulatory function were compared. Results All the cells in three groups were long and flat fusiform，adherent to the wall and uniform in size. The proliferation curve trend was similar，and the proliferation ability of P2 and P3 generations in groups A and B was better than that in group C （both P <

0.05）. The cells in three experimental groups all met the requirements of the International Stem Cell Society for identification of hUC-MSC cell surface markers. The expression levels of CD29 and CD90 in P3 generations in groups A and B were higher than those in group C （all P < 0.05），and all three experimental groups had the ability of three-line differentiation. Compared with the control group，the proliferation rate of T lymphocytes in P3 generation and the proportion of cytokines secreted by Th1 and Th17 cell subsets were significantly decreased in the three experimental groups，and the proportion of regulatory T cells （CD4+ CD25+ FOXP3+） was significantly increased in the three experimental groups，but there was no statistical significance among three experimental groups （all P > 0.05）. Conclusions The hUC-MSC in three groups can maintain basic biological characteristics and immunomodulatory activity. The proliferation ability and expression levels of cell surface markers in groups A and B are superior to those in group C.

【Key words】 Human umbilical cord mesenchymal stem cell； Serum-free culture system； Biological function

人臍帶間充質干細胞（hUC-MSC）是一類具有自我更新能力和多向分化潛能的成體干細胞，因來源廣泛、取材方便、低免疫原性、增殖能力強等優點，已被廣泛應用于基因治療等研究領域［1-3］。

在臨床、科研應用前，需要通過初步分離和體外擴增以獲得足夠數量的hUC-MSC，而影響hUC-MSC培養效率和安全性的關鍵因素在于細胞培養體系。目前，在體外選用不同培養體系培養hUC-MSC方面，無血清培養體系的安全性和培養效率優于動物血清培養體系［4-5］。無血清培養更利于細胞的生長，容易進行純化和下游加工、細胞功能的精準評估、增強生長和產量、增強細胞內中介物的檢測，可以消除來自血清的不均一性，簡化分離純化步驟和鑒定各種細胞產物的程序，避免病毒污染造成的危害。經歷了天然培養基、合成培養基后，無血清培養基成為當今細胞培養領域的一大趨勢。無血清培養基一般包括細胞因子合成物和人血小板裂解物，不同的培養基成分對細胞的生長影響較大，因此本研究采用3種不同無血清培養體系對hUC-MSC進行體外擴增培養，比較培養后細胞的形態、增殖能力、表面標志物的表達率、三系分化能力及免疫調節作用的差異，以篩選出最佳的無血清培養體系，提高hUC-MSC的細胞產量和質量。

材料與方法

一、材 料

1.臍帶組織

3株約30 cm的臍帶取自中山大學附屬第三醫院嶺南醫院產科健康供體，且供體簽署知情同意書。供體篩選標準：HBV、丙型肝炎病毒、HIV、巨細胞病毒、EB病毒、梅毒檢測均為陰性，且無家族遺傳病史，無傳染病史。本研究獲中山大學附屬第三醫院干細胞臨床研究機構倫理專家委員會批準（批件號：［2020年份］14號）。

2.試劑與儀器

間充質干細胞無血清培養基、消化酶均購自友康生物科技（背景）股份有限公司。Helios UltraGROTM購自美國AventaCell公司。MSC-T4購自珠海貝索生物技術有限公司。α-MEM培養基、RPMI 1640培養基、DMEM低糖培養基均購自美國Gibco公司。OriCell人臍帶間充質干細胞成脂、成骨、成軟骨誘導分化培養基試劑盒均購自廣州賽業生物科技有限公司。人淋巴細胞分離液購自挪威Axis-shield公司。調節性T細胞（Treg）檢測試劑盒、白細胞活化試劑盒、破膜劑和流式抗體FITC-CD3、APC-CD8、PE-cy7-IFN-γ、APC-IF-17A、FITC-CD8均購自美國BD公司。流式抗體CD29-FITC、CD31-FITC、CD34-FITC、CD44-FITC、CD45-FITC、CD73-PE、CD90-PE、CD105-PE、CD166-PE、HLA-DR-FITC均購自美國Bechman公司。CD3細胞分選磁珠購自德國Miltenyi公司。CellTrace? CFSE 細胞增殖試劑盒購自美國Thermo Scientific公司。CD3、CD28單克隆抗體和IL-2購自美國Perprotech公司。倒置顯微鏡購自德國Leica DMil公司，離心機購自德國Eppendorf公司，二氧化碳培養箱購自美國Thermo Scientific公司，流式細胞儀購自美國Bechman Coulter公司。

二、方 法

1. hUC-MSC的分離培養

將3株臍帶組織分別設為3組實驗組，A組：純化學成分合成的無血清培養體系，B組：血小板裂解物+基礎培養基的無血清培養體系，C組：纖維蛋白原包被+含重組人蛋白質的無血清培養體系。分別剔除臍帶表皮和血管，取華通氏膠，剪至3 mm3大小平均接種于9個150 mm培養皿，每組3個150 mm培養皿，分別加入3種不同無血清培養基，置37 ℃、5%二氧化碳培養箱中培養至細胞融合度達20%～30%，消化收集細胞記為P0代細胞，分別繼續傳代培養至P3代，凍存備用。

2. hUC-MSC 的增殖活性

分別將P0代次的hUC-MSC以8 000 cells/cm2

的密度接種于培養瓶中，待細胞融合度為80%～

90%，收集細胞、計數、傳代至P3代，繪制細胞生長曲線。

3. hUC-MSC表面標志物的檢測

收集P3代次hUC-MSC，用生理鹽水洗滌后將細胞濃度調整為2×106 cells/mL，按每管100 μL分別加入5 μL的CD29、CD31、CD34、CD44、CD45、CD73、CD90、CD105、CD166、人類白細胞抗原（HLA-DR）單克隆抗體，混勻、4 ℃避光孵育30 min；

用生理鹽水洗滌、重懸后，用流式細胞儀檢測hUC-MSC細胞表面標志物的表達情況。

4. hUC-MSC體外三系潛能誘導分化

收集P3代的hUC-MSC按成骨誘導分化培養試劑盒培養2～4周，用4%多聚甲醛固定細胞，行茜素紅染色，鏡檢觀察。

收集P3代的hUC-MSC按成脂誘導分化培養試劑盒培養2～4周，4%多聚甲醛固定細胞，行油紅O染色，鏡檢觀察。

收集P3代的hUC-MSC按成軟骨誘導分化培養試劑盒培養4周后，用4%多聚甲醛固定細胞團。取人軟骨組織為陽性對照、臍帶組織為陰性對照，切片，行蘇木素染色，鏡檢觀察。

5. hUC-MSC免疫調節功能

5.1單個核細胞的提取

通過密度梯度離心法分離30 mL健康人外周血提取單個核細胞，加入磷酸鹽緩沖溶液（PBS）重懸、用CD3磁珠分選提取細胞，分選后用FITC-CD3標記，用流式細胞儀檢測T淋巴細胞的純度。

5.2羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂（CFSE）的標記

取5.1步驟分選的細胞1×106 cells/mL，加入CFSE，于37 ℃避光孵育20 min；加入預冷10%胎牛血清的RPMI1640培養液，冰浴5 min，用生理鹽水洗滌3次、重懸，細胞濃度調整為1×

106 cells/mL。

5.3 hUC-MSC對T淋巴細胞增殖的影響

將1×105 cells/well的hUC-MSC與5×105 cells/well

于5.1步驟標記的細胞置于24孔板中共培養，各加入CD3、CD28單克隆抗體和IL-2，以前一步驟分選的細胞和標記的細胞做為對照孔，共培養4 d，收集細胞，用生理鹽水洗滌、離心、重懸，用流式細胞儀檢測淋巴細胞增殖的情況。

5.4 hUC-MSC對T淋巴細胞免疫功能的調節

將hUC-MSC與5.1步驟標記的T淋巴細胞按1∶5的比例共培養4 d后，按白細胞活化試劑盒說明刺激收集細胞，用FITC-CD3、APC-CD8和FITC-CD8標記、破膜，分別進行IFN-γ（PE-Cy7）， TNF-α（PE）和IL-17A（APC）染色，用流式細胞儀檢測Th1、Th17細胞分泌細胞因子的情況，按Treg檢測試劑盒標記細胞，流式細胞儀檢測Treg（CD4+CD25+FoxP3+）的比例。

三、統計學處理

采用SPSS 25.0進行數據分析。符合正態分布的計量資料用表示，多組間比較采用方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗，P < 0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、hUC-MSC的細胞形態

3組實驗組的hUC-MSC均貼壁生長，細胞形態均為長而扁平的梭形細胞，大小均一，極性排列，集落呈渦旋狀，類似于成纖維細胞。見圖1。

二、hUC-MSC的增殖活性比較

根據P0～P3代次hUC-MSC的計數結果繪制增殖曲線。3組實驗組的細胞增殖曲線趨勢相似， P0～P1代次的hUC-MSC增殖較慢；P2代次開始，hUC-MSC進入對數增長期，增殖能力強。3組實驗組細胞總數兩兩比較，A組與B組P2、P3代次的細胞總數比較差異均無統計學意義（P均> 0.05），A組與B組P2、P3代次的增殖能力均優于C組（P均< 0.05）。見圖2。

三、hUC-MSC的細胞表面標志物

流式細胞儀分析結果顯示，3組實驗組P3代次的hUC-MSC細胞表面標志物CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD166表達率均≥95%；CD34、CD45、 CD31、HLA-DR表達率均≤2%，均符合國際干細胞協會對hUC-MSC細胞表面標志物鑒定的要求［6］。3組實驗組兩兩比較，A組與B組的細胞表面標志物表達率比較差異均無統計學意義（P均> 0.05），A組和B組的CD29、CD90表達率均高于C組（P均< 0.05）。見表1。

四、hUC-MSC的三系分化能力

3組實驗組的hUC-MSC在體外均具有成骨、成脂、成軟骨分化的功能。成骨誘導4周后經茜素紅染色，鏡下可見紅色的鈣鹽沉積，見圖3A。成脂誘導4周后經油紅O染色，鏡下可見橘紅色的脂滴，見圖3B。成軟骨誘導4周后切片觀察，可見經蘇木素染液染成紫紅色的軟骨細胞，見圖3C。

五、hUC-MSC對T淋巴細胞的免疫調節作用

1. 3組不同無血清培養體系培養的hUC-MSC對T淋巴細胞增殖的影響

hUC-MSC與經過CFSE標記的T淋巴細胞共培養4 d后，流式結果顯示，3組實驗組中T淋巴細胞增殖的比例均低于對照組（P均< 0.05），3組實驗組兩兩比較差異無統計學意義（P均> 0.05），見圖4A、F。由此表明，3組實驗組的hUC-MSC均能抑制T淋巴細胞的增殖。

2. 3組不同無血清培養體系培養的hUC-MSC對Th1、Th17細胞分泌的細胞因子和對Treg的

調節

hUC-MSC與T淋巴細胞共培養4 d后，流式結果顯示，3組實驗組中P3代次的Th17細胞亞群分泌的細胞因子（CD8-IL-17A+）比例和Th1細胞分泌的細胞因子（CD3+TNF-α+）均低于對照組（P均<

0.05），見圖4B、C、F。Th1細胞亞群分泌的細胞因子（CD3+IFN-γ+）比例均低于對照組，3組實驗組兩兩比較，差異無統計學意義（P均> 0.05），見圖4B～D、F。由此表明，3組不同無血清培養體系培養的hUC-MSC均能抑制Th1和Th17細胞分泌炎癥因子。

hUC-MSC與CD3分選的T淋巴細胞共培養4 d

后，流式結果顯示，3組實驗組中CD4+ CD25+ FoxP3+細胞比例均高于對照組，3組實驗組兩兩比較，差異無統計學意義（P > 0.05），見圖4E、F。由此表明，3組不同無血清培養體系培養的hUC-MSC均能誘導Treg細胞的增殖。

討 論

MSC無血清培養基，是整個間充質干細胞體外培養的核心。間充質干細胞培養基從上市到現在，已經走過了3代。第3代培養基是用成分明確的非動物來源的化學物質完全替代了血清或血小板裂解物（牛血清替代物），沒有未知組分、沒有動物源組分，人體安全性高，批次性能差別小。hUC-MSC在無血清培養體系中能實現大量擴增，然后回輸到人體，具有調節組織免疫微環境和促進組織修復的功能。無血清培養基的營養添加因子不同，可影響hUC-MSC體外擴增的效率，細胞表型、分化能力及遺傳特性等［7-8］。目前主要從3個方面進行hUC-MSC的鑒別：①細胞貼壁生長；②細胞表型高表達CD73、CD90、CD105，低表達或不表達CD34、CD45、CD11b、CD19和 HLA-DR；③具有體外分化成脂、成骨、成軟骨的潛能［6］。為了篩選出高效穩定的hUC-MSC體外無血清培養體系，本研究分別用3組不同無血清培養體系對hUC-MSC進行體外擴增培養。結果顯示，3組實驗組的hUC-MSC均符合國際干細胞協會制定的鑒定標準，各組細胞形態無明顯差異，其中純化學成分合成的無血清培養體系和血小板裂解物的無血清培養體系的hUC-MSC在細胞表面標志物及增殖活性上優于纖維蛋白原包被+含重組人蛋白質的無血清培養體系［6］。既往文獻表明，無血清培養基含有向細胞內轉運離子的轉鐵蛋白和調節葡萄糖攝取量的胰島素，以及促生長因子和一些促細胞貼壁的蛋白質等，這些添加物能夠選擇性地促進MSC體外培養中的生長和分化，進而引起hUC-MSC在增殖及表型表達方面的差異［9-11］。

hUC-MSC具有調節多種免疫細胞的功能，特別是T淋巴細胞。輔助性T細胞根據細胞因子分泌的不同分為 Th1、Th17和Treg等，通過受體介導的細胞因子，發揮不同的免疫效應。Th1分泌TNF-α、IFN-γ等，介導機體的炎性反應和組織損傷；Th17分泌 IL-17A，具有抗感染作用［12-13］。目前，CD4+ CD25+ FOXP3+ 是Treg標志物主要的檢測組合之一，而 Foxp3是控制Treg發育和功能的關鍵轉錄因子之一，需要進行破膜后檢測［14］。抑制T淋巴細胞的活化、增殖和細胞因子分泌，顯著上調Treg比例，進而影響其他免疫細胞功能，這一特性是MSC臨床療效評價最為重要的屬性之一［15-17］。

本研究3組實驗組的T淋巴細胞增殖率、Th1和Th17細胞分泌的細胞因子比例均降低，Treg比例均升高，3組不同無血清培養體系培養的hUC-MSC均保持著免疫調節功能。

綜上所述，3組不同無血清培養基培養的hUC-MSC均能保持其基本的生物學特性和免疫調節活性，純化學成分合成的無血清培養體系和血小板裂解物的無血清培養體系優于纖維蛋白原包被+含重組人蛋白質的無血清培養體系。

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（收稿日期：2023-03-16）

（本文編輯：洪悅民）