三氯乙烯高效降解菌的篩選鑒定及降解特性研究

曹衛承

（上海市環境科學研究院，上海 200233）

鹵代烴類化合物用途非常廣泛，既能在化學實驗室用作有機溶劑，也能在化工廠用作化學試劑的原材料。其通常被用在實驗室作為有機溶劑使用，在化工廠還經常被當作原料使用。

鹵代烴在使用完成以后，如果沒有采取有效的處理，就會引起周圍環境的污染。如果它們揮發到空氣中，就會引起大氣污染。如果泄漏到土壤中，就會引起土壤和地下水的污染[1-3]。

在地下水的所有污染物中，鹵代烴是一大類，占比超過了40%。它們本身具有一定的毒性，人類接觸后會引起一系列健康問題，并且具有“三致“作用，能夠在食物鏈中傳播，在生物體內具有富集作用。

在鹵代烴中，三氯乙烯，英文簡寫TCE，是其中一大類。TCE 在美國和日本滲入到地下水中，引起了廣泛的污染[4-7]。

從1960 年起，世界上各個國家逐漸對TCE 引起的污染重視起來，逐步將其列入到自己國家的污染物控制名單中。美國環境保護總署（EPA）把TCE 列入到優先控制污染物名單中。在我們國家，國家生態環境保護部將其列入到有限監測污染物[8-9]。

TCE 的降解產物包括二氯乙烯和氯乙烯，同樣具有一定的毒性和“三致“作用。

目前，在世界上很多國家，無論是土壤還是地下水中，TCE 都引起了普遍的污染，治理的難度也非常大。

對于環境污染問題，治理的方法有很多，其中微生物方法是一種行之有效的好方法，也可以用來解決TCE 帶來的問題[10-11]。

對于TCE 引起的環境污染，最開始用厭氧微生物去治理[12-15]。可是在治理的過程中，往往生成有毒物質，于是開始用好氧微生物去治理。在好氧環境中，從外面引入的好氧毒株適宜性不如本地的好，所以首選本地環境中培養的好氧毒株。

本文研究地點選擇上海市浦東新區，試著從當地選擇好氧毒株治理TCE 污染。本文從整個降解動態出發，比較不同的降解條件，選擇最合適的，為以后TCE引起的污染修復提供數據支持。

1 材料和方法

1.1 菌種來源

菌種來源選擇上海市浦東新區的一個化工廠。首先在化工廠中選擇合適的地點打井，并用采樣工具采集井中地下水樣品。將取回來的地下水樣品，用分析儀器進行測試，分析結果表明水中含有TCE 污染物。將剩余地下水樣品裝入采樣瓶中，并充入一定量的保護氣氮氣。將沖完氮氣的樣品瓶放在冰箱里冷藏保存。

1.2 TCE 高效降解菌的馴化篩選

將取來的菌種選擇平板法進行培養，選擇TCE 作為碳源。

用50 mL 移液管移取無機鹽培養基50 mL，置于培養裝置中，用電子天平稱取10 g 樣品加入其中。

在避光條件下進行振蕩培養。培養溫度設置為30℃，轉速調節為180 rpm，培養時間設置為36 h。

用移液管移取1 mL 的培養液，將其加入到新的地下水樣品中，加完后繼續進行培養。培養溫度設置為30 ℃，轉速調節為180 rpm。培養時間設置為5 d，再用移液管移取培養液，周而復始。最后從培養液中得到純菌，數量為3 株。對菌進行編碼，分別為TCE-1、TCE-2、TCE-3。

配制質量濃度為10 mg/L 的TCE 溶液，并將溶液pH 調節為7。將調節完的溶液加入反應器中，并加入體積為180 mL 的培養基，隨后加入含菌的懸浮液，使菌的濃度保持為100 cells/mL。

配制完成后，將反應器在30 ℃下進行振蕩，將反應器轉速調節為180 rpm。將振蕩完的樣品經過儀器進行分析測試，分析結果表明1 號菌TCE-1 降解效果最好。

1.3 TCE 高效降解菌的鑒定

接下來用化學試劑十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）提取菌株的DNA。首先用SDS－蛋白酶K 進行裂解，接下來用CTAB 把多糖以及細胞碎片進行沉淀，然后再用異丙醇進行沉淀。

接下來對提取的DNA 進行操作，完成16SrDNA的PCR 擴增。采用的擴增引物為通用引物。把f27：AGAGTTTGATCCTGG CTCAG 作為正向引物使用。把rl 492：TACGGCTACCTTGTTACGACTT 作為反向引物使用。該引物PCR 擴增片段約為1 500 bp。

PCR 反應體系（50 μL）：10×Buffer 5 μL，25 mmol/L MgCl24 μL，2.5 mmol/L dNTPs 4 μL，20 μmol/L 引物f27 1 μL，20 μmol/L 引物r1 492 1μL，ddH2O 34 μL，DNA 模板0.5 μL，5 U/L TaqDNA 聚合酶0.5 μL。

PCR反應條件：95℃預變性4min；94℃20s，52℃10s，72 ℃30 s，進行35 個循環；最后72 ℃延伸5 min。溴化乙錠染色后，紫外凝膠成像系統成像觀察，以DNA Marker 為參照。

接下來，對整個菌株進行測序。這項工作是由上海基康生物技術有限公司完成，

1.4 TCE 高效降解菌的降解性能探究

1.4.1 接種量

首先，研究接種量對降解性能的影響。選擇4 種TCE-1 接種量進行分析。最大接種量設定為40%，最小接種量設定為10%。中間接種量為20%和接種量30%。接下來將溶液pH 調節為7。

然后把反應液置于恒溫條件下進行培養，設定反應溫度為30 ℃。對反應液進行振蕩，振蕩速率調節為180 rpm。

隨著反應的進行，利用分析儀器對TCE 含量進行分析檢測。

1.4.2 pH

其次，研究pH 對降解性能的影響。將溶液最大pH 設定為11.0，將溶液最小pH 設定為3.0。中間設置了3 個pH 溶液5.0、7.0、9.0。將溫度環境設置為30 ℃，在搖床內采用振蕩培養，振蕩速率設定為180 rpm。

隨著反應的進行，利用分析儀器對TCE 含量進行分析檢測。

1.4.3 溫度

再次，研究反應溫度對降解性能的影響。將反應溫度最大值設置為35 ℃，將反應溫度最小值設置為15 ℃。中間插入20、25 和30 ℃。將溶液pH 調節為中性，接種量調節為30%。采用振蕩培養的方式進行，振蕩速率設定為180 rpm。

隨著反應的進行，利用分析儀器對TCE 含量進行分析檢測。

1.4.4 初始濃度

最后，研究初始濃度對降解性能的影響。配制不同濃度的TCE 溶液。將最大質量濃度設定為100 mg/L，將最小質量濃度設定為0.1 mg/L。中間質量濃度設置為1 和10 mg/L。

將反應液pH 調節為7.0，設定接種量為30%。采取恒溫振蕩方式，把溫度設定為30 ℃，把搖床的振蕩速率調節為180 rpm。

隨著反應的進行，利用分析儀器對TCE 含量進行分析檢測。

1.5 氣相色譜分析

本文研究了TCE 溶液的儀器分析條件。分析儀器采用氣相色譜，儀器型號為島津GC-2010。儀器的具體分析條件見表1。

表1 島津GC-2010 氣相色譜分析條件

2 結果與分析

2.1 TCE 高效降解菌的鑒定

2.1.1 TCE-1 菌株的形態學特征

對菌株形態學特征進行研究，在培養基上進行觀察。發現菌落成圓形，菌落的直徑約為2 mm 大小。

菌落呈現出乳白色，菌落的邊緣比較整齊。

菌落的表面比較光滑，看起來還很濕潤。發現很容易挑起。

革蘭氏染色陽性，球狀，菌體濃度為5.5×106個/mL。

2.1.2 TCE-1 菌株16S rDNA 的序列測定與系統發育分析

接下來，將TCE-1 1 123bp 的測定結果列出，如圖1 所示。

圖1 測定結果

在NVBI 網站上，利用Blast 程序進行分析。比較測得的序列與Genbank 中核酸的序列，TCE-1 同源性于Stenotrophomonas 菌株，選取與該序列相關性較高的20 個序列，用DNAstr v 軟件包Cilstal V 法，對這些細菌構建系統發育樹。對系統進化樹進行觀察。發現TCE-1 菌株與Stenotrophomonas 屬中Stenotrophomonas sp. TS23 關系最近，如圖2 所示。

圖2 菌株16S rDNA 序列構建的系統發育樹

經過綜合形態學特征和系統發育分析，將TCE-1歸入到Stenotrophomonas 屬中，把它命名為Stenotropho monas sp.TCE-1 菌株。

該菌株為單胞菌，其屬于好氧菌類，這種菌株在土壤中經常出現。

文獻報道Stenotrophomonas 屬菌種善于降解多環芳烴。

2.2 菌株生長曲線

在液體培養基中接種TCE-1。每隔一定時間，取一定量的培養菌液進行測定。選用的測定波長為600 nm。將生長曲線列在圖3。菌株剛開始生長比較慢，在24 h后增長非常快，在60 h 后非常穩定。

圖3 TCE-1 在無機鹽培養基中的生長曲線

2.3 接種量對TCE 降解的影響

首先，研究接種量對降解性能的影響，如圖4 所示。總的來說，當接種量低的時候，降解效率也低。接種量高的時候，降解效率也高。降解效率的最大值，是在30%的時候。超過30%，氧氣會消耗得特別快。缺少氧氣，反應進行得不徹底。

圖4 接種量對TCE 降解性能的影響

2.4 pH 對TCE 降解性能的影響

其次，研究pH 對降解性能的影響。不同pH 分析結果如圖5 所示。將反應時間設定為64 h。在酸性pH為3 的溶液中降解42.8%。在酸性pH 為5 的溶液中降解了53.1%。在堿性pH 為9 的溶液中降解了79.0%。在堿性pH 為11 的溶液中降解了45.1%。在中性pH為7 的溶液中降解了86.9%。最大降解率為86.9%，是在中性pH 為7 的溶液中進行的。

圖5 pH 對TCE 降解性能的影響

不同pH 下TCE 降解動力學參數見表2。

表2 不同pH 下TCE 降解動力學參數

2.5 溫度對TCE 降解性能的影響

再次，研究溫度對降解性能的影響。一般來說，溫度越高，反應速度越大。但如果把溫度提高太多，酶的活性就會降低。一般來說總有一個適合溫度。

溫度對TCE 降解性能的影響如圖6 所示。從圖6中可觀察到TCE 降解最快的時候，發生在溫度為30 ℃。而且在這個溫度，降解最多。降解比較慢的時候發生在15 ℃及以下。一般來說微生物代謝差的時候多發生在低溫時候，以致污染物降解也慢。

圖6 溫度對TCE 降解性能的影響

不同溫度下TCE 降解動力學參數見表3。

表3 不同溫度下TCE 降解動力學參數

2.6 初始濃度對TCE 降解性能的影響

最后，研究初始質量濃度對降解性能的影響。不同初始濃度的分析結果如圖7 所示。將最大質量濃度設置為10 mg/L。將最小質量濃度設置為0.1 mg/L。觀察時間設定為72 h。結果表明，初始質量濃度增大，降解率也增大。把研究質量濃度繼續擴大到100 mg/L，濃度增大了，降解慢了下來。說明高濃度TCE 溶液產生了抑制作用。

圖7 初始質量濃度對TCE 降解性能的影響

不同初始質量濃度下TCE 降解動力學參數見表4。

表4 不同初始質量濃度下TCE 降解動力學參數

3 結論

1）好氧菌TCE-1 是能夠將TCE 礦化的。在分析圖譜中，其他氯代產物的峰并沒有出現。從圖譜分析結果中，可以觀察帶沒有出現二次污染。

2）從基于形態學觀察以及16S rDNA 序列測定和系統發育來看， 可以將TCE -1 歸入到單胞屬Stenotrophomonas sp.。在土壤中，可以經常發現這種菌。

3）Stenotrophomonas sp.TCE-1 降解TCE 的最佳條件為pH 7.0，溫度30 ℃。在這些條件下接種量大于5%時，增加接種量對提高TCE 降解速率效果明顯，在一定濃度范圍內，菌株不受基質抑制。

4）Stenotrophomonas sp.TCE-1 在上述最佳反應條件下，TCE 初始質量濃度為10 mg/L 時其降解速率常數為0.029 2 h-1，降解半衰期為23.74 h。