DNA含量測定方法在生物制品安全控制中的應用

摘" 要：為避免宿主細胞殘留DNA可能帶來的致癌性、感染性與免疫原性等危害，有必要在生物制品生產過程中對DNA進行純化去除與含量測定，保障生物制品的安全性和有效性。該文從殘留DNA的危害性分析出發，介紹5種DNA含量測定方法在生物制品安全控制中的應用。

關鍵詞：DNA含量測定；生物制品；安全控制；宿主細胞；殘留DNA

中圖分類號：R392-33" " "文獻標志碼：A" " " " " 文章編號：2095-2945（2023）14-0144-04

Abstract： In order to avoid carcinogenicity， infectivity and immunogenicity caused by residual DNA in host cells， it is necessary to purify and remove DNA and determine its content in the production process of biological products to ensure the safety and effectiveness of biological products. Based on the harmfulness analysis of residual DNA， this paper introduces the application of five determination methods of DNA content in the safety control of biological products.

Keywords： determination of DNA content; biological product; safety control; host cell; residual DNA

生物制品是利用基因工程、細胞工程、發酵工程等現代生物技術，以微生物、細胞、動物源生物組織等作為基礎原料制成的生物活性制劑，一般常用于人類疾病預防、治療和診斷，常見的生物制品包括疫苗、診斷抗原、類毒素、干擾素和診斷蛋白等。2019年12月至今，新型冠狀病毒感染（COVID-19）已經剝奪了全球數百萬人的生命，針對這種新冠感染研發的疫苗就屬于一種特殊的生物制品，其可以幫助絕大部分人獲得免疫力，有效降低發病、重癥和死亡的風險，進而幫助社會逐步建立起免疫屏障，阻礙其流行傳播。

現代生物科學技術的突飛猛進，使得越來越多的生物制品應用到人類疾病預防、治療和診斷領域中來。為滿足社會對生物制品安全性、有效性與可及性的需求，進一步推動現代生物科學技術的健康發展與應用，國內外監管機構不斷出臺相關法定技術標準加強對生物制品質量的控制力度，我國“四個最嚴”和飛行檢查的常態化也有力推動了現代先進檢測技術的應用。如今，越來越多標準化、便捷化、科學化的針對生物制品中宿主細胞殘留DNA含量的測定方法得到應用，以滿足對生物制品安全控制的要求，減少安全隱患。

1" 宿主細胞殘留DNA的危害性

隨著生物工程技術的發展和生物信息的全球化，大量的生物制品已采用細胞生產，我國疫苗的生產就常使用非洲綠猴腎細胞（Vero細胞）和中國倉鼠卵巢（CHO）細胞[1]作為宿主細胞。宿主細胞也叫作受體細胞，是指在轉化或感染過程中接受外源基因的細胞，常用作受體細胞的有原核受體細胞（大腸桿菌等）、真核受體細胞（酵母菌等）和動物細胞等。

生物制品中的殘留DNA片段或更長的分子主要來源于作為基礎原料的宿主組織細胞[2]，因其來源的廣泛性，隨之而來的潛在風險也是多樣的，主要風險可概括為致癌性、感染性、免疫原性等[3]。

1.1" 致癌性

宿主細胞殘留DNA可攜帶顯性致癌基因，像癌基因MYC或RAS等，這些顯性致癌基因可能會導致生物制品具有致癌風險。宿主細胞殘留DNA常見的致癌機制是顯性致癌基因可直接把正常細胞轉化為瘤性細胞，如含有Ｈ-ras基因和C-myc基因的12.5 ug質粒可在成年和新生幼鼠中引發腫瘤[4]。宿主細胞殘留DNA的另外一種致癌機制可能是宿主細胞殘留DNA的插入引發突變導致原癌基因被異常激活、抑癌基因則失去活性，2類基因在細胞生長、增殖調控中的平衡被異常打破，兩者不再相互制約，正負調節信號失穩，最終引發正常細胞不斷癌變、侵襲及轉移形成癌癥[5]。

1.2" 感染性

宿主細胞殘留DNA的感染性歸因于其可能攜帶傳染性病毒基因組，如HIV病毒，這些病毒基因組無論是作為染色體外組分還是整合入人體基因組，或是逆轉錄病毒的前病毒[6]，都可能會擴增并催生傳染性病毒粒子，增加宿主細胞殘留DNA的感染性風險。因此，宿主細胞殘留DNA的感染性風險可能比致癌性風險更高。Li等[7]通過體外定量測定逆轉錄病毒DNA的傳染性研究得到：微量的逆轉錄病毒的前病毒DNA在體外就具有感染性；線狀DNA具有很強的感染力，其感染力約為環狀DNA的30至100倍。

1.3" 免疫原性

宿主細胞殘留DNA也可能會引起免疫原性，這類殘留在生物制品上的雜質能夠激活模式識別受體，加速促炎性細胞因子的生成，使得抗原遞呈細胞對抗原的處理和遞呈動作更加劇烈，最終可能引起非特異性免疫反應：皮膚反應、過敏反應及血清學疾病等。人類機體對生物制品中宿主細胞殘留DNA的免疫應答不可預知，由此產生的嚴重免疫反應甚至會危及生命。單克隆抗體TNG1412的第一階段臨床試驗期間出現的臨床前安全性測試未預測到的危及生命的“細胞因子風暴”表明某些生物制品（如某些特殊生物治療劑）可能會對哺乳動物產生不可預料的嚴重傷害[8]。除此之外，人們還常見到一些高劑量的核酸樣品（DNA疫苗或CpG寡脫氧核苷酸）誘發產生不良免疫反應或產生DNA抗體的臨床研究報道[9]。

2" DNA含量測定方法在生物制品安全控制中的應用

DNA殘留量是生物制品常規的質量檢測指標，2020版《《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）》規定DNA殘留量不得超過每劑10 ng[10]，進行DNA含量的檢測是十分必要的。DNA含量的測定方法多種多樣，并不存在普遍適用性的最佳方法，2020版《中國藥典》收錄的3種DNA含量檢測方法為我國生物制品的安全控制提供了應用指導。

2.1" 熒光染色法

熒光染色法的原理就是高靈敏度的雙鏈DNA熒光染料（通常為PicoGreen）可與雙鏈DNA特異結合形成可在波長480 nm激發下產生熒光信號的復合物，在DNA含量處于一定的范圍內且熒光染料過量的情況下，熒光信號的強度與DNA的濃度成正比，進而可以利用熒光酶標儀在波長520 nm處進行檢測，根據檢測出來的熒光信號強度數值，可計算得出樣品中的DNA含量[11-12]。

熒光染色法具有操作簡單、準確性高且成本低的優點，但該方法的特異性不強，靈敏度也不高。除此之外，鹽類物質（氯化鈉、醋酸鈉等）或蛋白類物質（白蛋白等）都會對熒光染色法的測定準確性造成干擾，該方法不適用于大劑量蛋白樣品（如單克隆抗體）的檢測，多用于含小劑量蛋白（如疫苗、γ-環糊精）的生物制品中DNA含量的測定[13-14]。

2.2" 定量PCR法

定量PCR法是在PCR反應體系內加入熒光基團，參照已知濃度的核酸標準曲線，通過監測分析反應過程中的熒光信號做到對核酸的定量測定[15]。實時定量PCR技術利用熒光染料或探針保證了PCR擴增的特異性，熒光信號數值的大小與特異性擴增產物的量成正比，得以真正做到定量檢測[16]。常用的熒光基團有TapMan熒光探針和熒光染料SYBR Green，兩者的主要區別見表1。

綜合來看，定量PCR法具有操作簡便、靈敏度高、特異性強和重復性好等優點，而且所受的人為干擾因素較少，是一種在生物制品安全控制中極具可靠性的檢測手段。例如，生物制藥行業常利用定量PCR法測定門冬氨酸鳥氨酸（一種抗炎保肝藥物）中畢赤酵母菌殘留DNA的含量，以此來把控畢赤酵母菌潛在的致癌風險。

2.3" DNA探針雜交法

DNA探針雜交法的原理是樣品中的外源性DNA經變性為單鏈后吸附于固相膜上（一般為硝酸纖維素膜或NC膜），并在嚴格條件下與特異性標記的單鏈DNA復性雜交形成雙鏈DNA，且在固相膜上呈現為可測斑點，通過顯示系統檢測與計算得到樣品中DNA的殘留量[17]。

DNA探針雜交法的特異性與靈敏度都比較好，常常被用于人用狂犬病疫苗（Vero細胞）原液樣品中宿主細胞殘留DNA的檢測。但該方法的實驗周期偏長且操作程序煩瑣，容易出現假陽性或假陰性的錯誤結果，故所需檢測樣本量較大，且只能實現半定量[18]。同時，該測定方法容易受多種因素干擾，對基因組DNA的提取、純化及探針等均有較高要求。

2.4" 紫外分光光度法

紫外分光光度法是基于朗伯-比爾定律，利用吸光物質對某一波長光的吸收強度與該物質的濃度成正比進而對DNA含量進行定量分析[19]。利用DNA分子中存在的共軛雙鍵在波長260 nm處具有最大紫外吸收的特性，可通過測定樣品DNA在此波長處的吸光度值進行核酸定量分析[20]。隨著微量分光光度計的廣泛推廣和應用，利用微量樣本對DNA含量進行定量成為了生物分子、生命科學和臨床檢驗等核酸相關研究實驗室最常使用的方法[21]。

紫外分光光度法簡便快捷，在藥物分析、食品安全等領域起著重要作用。對于高純度的樣品，紫外分光光度法可以準確地測定其DNA含量。但是此法測定核酸濃度易受到其他具有紫外吸收特性物質的干擾，如蛋白質、多糖，提取試劑中苯酚、丙酮等物質，因此樣品基質中存在這些物質將會影響紫外分光光度法的準確度。

2.5" 定磷法

利用電感耦合等離子體技術（一種元素分析方法）對質荷比不同的元素進行分離，可依據元素的含量與質譜峰的面積成正比這一特性對磷含量進行定量分析。測定核酸含磷量需要采用酸消解、微波消解等方法對核酸樣品進行處理。利用已知濃度的磷標準物質建立標準曲線，從而對磷進行定量，依據磷含量來計算標準物質的濃度[22]。

基于磷元素分析的核酸定量方法已被用于多種有證標準物質的定值，其相對不確定度均低于10%。但是，此法對試劑純度要求較高 （分析純以上），樣品消解處理是定量的關鍵，前處理較為復雜，樣品消解程度將對定量結果直接產生影響。

3" 結束語

近些年，新冠疫苗、新冠口服藥等生物醫學制品作為抗擊疫情的急先鋒走進大眾視野，讓人們切身體會到生物制品是與人類生命健康息息相關的，其可以在多個領域讓人類社會享受到生物科技發展帶來的紅利。

“是藥三分毒”，生物制品中宿主細胞殘留DNA存在致癌性、感染性與免疫原性等風險，需要國家相關部門與生產廠家共同努力，嚴把質量關。合理利用科學、精確的方法對宿主細胞殘留DNA含量進行測定，高標準全流程做好生物制品的研發生產與安全控制工作，才能滿足社會對生物制品安全性、有效性的需求，進一步推動現代生物科學技術的發展與應用。

參考文獻：

[1] 杜洪橋，嚴家新.生物制品中宿主殘留蛋白的風險分析和檢測方法[J].國際生物制品學雜志，2012，35（2）：82-86.

[2] 閆璐瑤.生物制品中宿主細胞殘留DNA檢測的研究進展[J].國際生物制品學雜志，2021，44（3）：170-174.

[3] 吳浩飛，黃仕和，孟勝利.生物制品殘留DNA分析技術的研究進展[J].國際生物制品學雜志，2013，36（1）：115-118.

[4] SHENG L，CAI F，ZHU Y，et al. Oncogenicity of DNA in vivo： Tumor induction with expression plasmids for activated H-ras and c-myc[J].Biologicals，2008，36（3）：184-197.

[5] LI S F， ANDREW M L， KEITH P. Issues associated with residual cell-substrate DNA in viral vaccines [J].Biologicals，2009，37（3）：190-195.

[6] 張昀，陳興.生物制劑中殘余DNA的潛在危害性及其檢測方法的研究進展[J].中國生物制品學雜志，2014，27（10）：1348-1352.

[7] LI S F，ANDREW M，LEWIS J，et al. Quantitative determination of the infectivity of the proviral DNA of a retrovirus in vitro： Evaluation of methods for DNA inactivation[J].Biologicals，2009，37（4）：259-269.

[8] EASTWOOD D，FINDLAY L，POOLE S，et al. Monoclonal antibody TGN1412 trial failure explained by species different in CD28 expression on CD4+ effector memory T-cells[J].Br J Pharmacol，2010，161（3）：512-526.

[9] VERFAILLIE T，COX E. Goddeer is BM. Immunostimulatory capacity of DNA vaccine vectors in porcine PBMC：a specific role for CpG-motifs[J].Vet ImmunolImmunopathol，2005，103（1/2）：141-151.

[10] 《中華人民共和國藥典（2020年版）》（第三部）[M].北京：中國醫藥科技出版社，2020：555-558.

[11] 張昀，陳國明，李娜，等.熒光染色法檢測重組乙型肝炎疫苗中殘留DNA含量[J].中國生物制品學，2013，26（11）：1652-1655.

[12] 陳凌，王永智，雷高新，等.熒光染色法檢測γ-環糊精DNA殘留量方法驗證研究[J].中國醫藥生物技術，2020，15（5）：532-534.

[13] 王蘭，高凱，畢華，等.熒光法和DNA雜交法檢測重組技術產品中殘余DNA的比較[J].藥物分析雜志，2009，29（7）：1063-1066.

[14] WANG X，MORGAN D M，WANG G，et al. Residual DNA analysis inbiologics development： review of measurement and quantitation technologies and future directions[J].Biotechnol Bioeng，2012，109（2）：307-317.

[15] GREGORY A，WRAY. Dating branches on the tree of life using DNA [J]. Genome Biology，2002，3（1）：0001.1-0001.7.

[16] 劉晶晶，郭瑩瑩，李艷琪，等.熒光定量PCR檢測重組新蛭素中畢赤酵母基因組DNA的殘留量[J].生物技術通訊，2014，3（25）：404-405.

[17] LAI T P，WRIGHT W E，SHAY J W. Generation of digoxi-genin-incorporated probes to enhance DNA detection sensitivity [J].Biotechniques，2016，60（6）：306-309.

[18] LEBRON J A，TROILOL P J，PACCHIONE S，et al. Adaptation of the WHO guideline for residual DNA in parenteral vaccines produced on continuous cell lines to a limit for oral vaccines[J].Dev Bid （Basel），2006，123：35-44.

[19] SOMANATH B， NATALIE C， THOMAS M， et al. Comparisonof methods for accurate quantification" of DNA mass concentration with traceability to the" international system of units[J]. Analytical Chemistry， 2010，82（17）：7185-7192.

[20] HOLDEN M J， HAYNES R J， RABB S A， et al." Factors Affecting Quantification of Total DNA by UV Spectroscopy and PicoGreen" Fluorescence[J]." J Agric Food Chem， 2009，57（16）：7221-7226.

[21] 李春，劉建濤，高運華，等.紫外分光光度法測定核酸含量的影響因素分析[J].化學試劑，2020，42（1）：53-57.

[22] 陳桂芳，歐陽艷艷，楊佳怡，等.核酸標準物質測量方法研究進展[J].計量科學與技術，2021，65（6）：25-33.