基于人類蛋白質(zhì)組微陣列數(shù)據(jù)篩選蟾毒靈抗癌作用靶點(diǎn)的生物信息學(xué)分析

［摘要］ 目的

通過生物信息學(xué)方法分析蟾毒靈人類蛋白質(zhì)組微陣列數(shù)據(jù)，探究蟾毒靈互作蛋白之間的潛在聯(lián)系，預(yù)測蟾毒靈在癌癥中的作用靶點(diǎn)。

方法 使用clusterProfiler包進(jìn)行GO、KEGG和GSEA富集分析，使用STRING數(shù)據(jù)庫及Cytoscape軟件進(jìn)行關(guān)鍵蛋白篩選。下載TCGA數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)進(jìn)行關(guān)鍵基因的泛癌分析；使用survival包繪制關(guān)鍵基因在肺癌、肝癌和胃癌中的K-M曲線，評估其預(yù)后效能。

結(jié)果 GO、KEGG和GSEA富集分析結(jié)果表明，蟾毒靈潛在互作蛋白顯著富集于細(xì)胞內(nèi)的各類囊泡的腔和膜以及核糖體等細(xì)胞組分，與鳥苷核苷酸結(jié)合、GTP結(jié)合、鈣黏蛋白結(jié)合等分子功能以及氨基酸及衍生物代謝、糖代謝、核糖體、真核細(xì)胞翻譯起始、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、DNA復(fù)制等生物學(xué)過程密切相關(guān)。篩選出前10位的核心蛋白，分別為RPL6、RPL8、RPL14、RPL24、RPL31、RPL36、RPS4X、RPS16、FAU和GNB2L1，其中除GNB2L1外均為核糖體蛋白。TCGA數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果表明，核心蛋白中的9種核糖體蛋白在大多數(shù)癌癥中差異表達(dá)且與我國死亡率前3位的癌癥肺癌、肝癌和胃癌的預(yù)后密切相關(guān)。

結(jié)論 蟾毒靈可能通過與核糖體蛋白直接相互作用調(diào)控癌細(xì)胞中核糖體的組裝與發(fā)生，阻礙其蛋白合成從而發(fā)揮抑癌作用。

［關(guān)鍵詞］ 腫瘤；蟾毒靈；蛋白質(zhì)陣列分析；計(jì)算生物學(xué)

［中圖分類號］ R394-33

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］ A

［文章編號］ 2096-5532（2024）05-0639-08

doi：10.11712/jms.2096-5532.2024.60.149

［網(wǎng)絡(luò)出版］ https：//link.cnki.net/urlid/37.1517.R.20241101.1536.001;2024-11-04 11：54：49

Bioinformatics analysis for selection of anticancer targets of bufalin based on human proteome microarray data

CHEN Guang， LIU Changying， SONG Qinghang， SUN Fulin， YANG Lina， LI Bing

（Department of Genetics and Cell Biology， Basic Medical College， Qingdao University， Qingdao 266071， China）

［Abstract］Objective To analyze the human proteome microarray data of bufalin using the bioinformatics method， to explore the potential interactions between bufalin and proteins， and to predict the targets of bufalin in cancer treatment.

Methods

ClusterProfiler package was used for GO， KEGG， and GSEA enrichment analyses. STRING database and Cytoscape software were used to screen for key proteins. Data from TCGA were used for pan-cancer analysis of key genes. The K-M curves of key genes in lung cancer， liver cancer， and gastric cancer were plotted using the survival package to evaluate the prognostic efficacy.

Results

GO， KEGG， and GSEA enrichment analyses showed that the proteins interacting with bufalin were significantly enriched in the cellular components such as lumen and membrane of various vesicles and in ribosome. These proteins were closely related to mole-

cular functions such as guanosine nucleotide binding， GTP binding， and cadherin binding as well as biological processes such as amino acid and derivative metabolism， glucose metabolism， ribosome， eukaryotic translation initiation， cell cycle， apoptosis， and DNA replication. The top ten core proteins were RPL6， RPL8， RPL14， RPL24， RPL31， RPL36， RPS4X， RPS16， FAU， and GNB2L1， which were ribosomal proteins except GNB2L1. Analysis using TCGA database showed that the nine ribosomal core proteins were differentially expressed in most cancers and were closely related to the prognosis of the top three cancers for mortality in China （lung cancer， liver cancer， and gastric cancer）.

Conclusion Bufalin may regulate the assembly and occurrence of ribosomes in cancer cells through direct interaction with ribosomal proteins， which hinders the protein synthesis in cancer cells and thus cancer growth.

［Key words］ neoplasms; bufalin; protein array analysis; computational biology

惡性腫瘤作為全球第二大死亡原因，對人類的健康造成嚴(yán)重威脅。在中國，2020年癌癥相關(guān)新發(fā)病例457萬例，死亡300萬例，分別占全球癌癥發(fā)病和死亡的23.7%和30.0%，居世界首位［1］。盡管近

年來癌癥治療手段有所改善，但晚期癌癥的治療仍面臨巨大挑戰(zhàn)［2-4］。因此，國內(nèi)外學(xué)者不斷尋求副作用更小、更加有效的癌癥治療藥物。蟾毒靈是我國名貴中藥蟾酥最有效的抗癌活性成分之一［5-7］。近期研究顯示，蟾毒靈在多種癌癥中具有良好的抗癌作用［8-13］。然而，現(xiàn)已明確的蟾毒靈直接作用靶點(diǎn)仍寥寥無幾。本文使用人類蛋白質(zhì)組芯片對蟾毒靈潛在的直接作用蛋白進(jìn)行全面篩選并獲得潛在互作蛋白列表，通過生物信息學(xué)方法分析蟾毒靈潛在互作蛋白的細(xì)胞組分及參與的生物學(xué)過程，并分析其中的核心蛋白及其與癌癥進(jìn)展及預(yù)后的關(guān)系。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 人類蛋白質(zhì)組芯片數(shù)據(jù)獲取

通過含有23 145個全長人類蛋白質(zhì)的人類蛋白質(zhì)組芯片HuProtTM陣列全面篩選蟾毒靈潛在直接互作蛋白。HuProtTM陣列由美國CDI公司制造和提供。通過掃描微陣列信號獲取潛在直接互作蛋白列表，信號強(qiáng)度以信噪比（SNR）進(jìn)行量化。實(shí)驗(yàn)根據(jù)文獻(xiàn)方法進(jìn)行操作［14］。芯片數(shù)據(jù)篩選過程由廣州博翀生物科技有限公司完成，獲取SNR＞1.5的蛋白作為潛在互作蛋白。

1.2 GO和KEGG富集分析

使用R語言軟件（4.1.2版本）clusterProfiler包［15］對SNR＞1.5的蛋白進(jìn)行ID轉(zhuǎn)換。使用ID轉(zhuǎn)換包org.Hs.eg.db將SYMBOL轉(zhuǎn)換為ENTREZID，將物種選擇為Homo sapiens，進(jìn)而進(jìn)行GO和KEGG富集分析。結(jié)果篩選以調(diào)整后P值＜0.05、q值＜0.2為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果使用ggplot2包繪制氣泡圖。

1.3 GSEA富集分析

使用R語言軟件（4.1.2版本）clusterProfiler包［15］對蛋白質(zhì)組學(xué)獲得的所有蛋白進(jìn)行GSEA富集分析［16］。其中物種選擇為Homo sapiens，參考基因集為Msigdb數(shù)據(jù)庫中的Hallmarks基因集和C2基因集，均來源于msigdbr包。篩選出標(biāo)準(zhǔn)化富集分?jǐn)?shù)（NES）絕對值＞2、q值＜0.2且P值＜0.05的結(jié)果，使用ggplot2包繪制山巒圖和GSEA分析經(jīng)典圖。

1.4 蛋白-蛋白互作分析

將SNR＞1.5的蛋白輸入STRING數(shù)據(jù)庫中（https：//string-db.org）獲得蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)。將該結(jié)果輸入cytoscape軟件（3.9.1版本），使用其中cytoHubba插件，Maximal Clique Centrality（MCC）法獲得前10位的關(guān)鍵基因。

1.5 基于TCGA數(shù)據(jù)庫對核心蛋白表達(dá)量進(jìn)行泛癌分析

從TCGA數(shù)據(jù)庫（https：//portal.gdc.cancer.gov）下載33種腫瘤的RNAseq數(shù)據(jù)并提取TPM格式的數(shù)據(jù)。使用ggplot2包、stats包及car包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，并繪制獲取的關(guān)鍵基因的泛癌表達(dá)量箱線圖。

1.6 預(yù)后分析

對獲得的關(guān)鍵基因繪制肺癌、肝癌和胃癌預(yù)后K-M曲線。使用survival包進(jìn)行比例風(fēng)險(xiǎn)假設(shè)檢驗(yàn)并進(jìn)行擬合生存回歸，結(jié)果用survminer包以及ggplot2包進(jìn)行可視化［17］。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用R軟件（4.1.2）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。Plt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) "果

2.1 GO和KEGG富集分析

GO分析結(jié)果表明，蟾毒靈潛在互作蛋白顯著富集于細(xì)胞內(nèi)的各類囊泡的腔和膜，如細(xì)胞質(zhì)囊泡腔、晚期內(nèi)含體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向高爾基體轉(zhuǎn)運(yùn)囊泡膜等，以及核糖體等細(xì)胞組分。同時(shí)，蟾毒靈潛在互作蛋白與鳥苷核苷酸結(jié)合、GTP結(jié)合、鈣黏蛋白結(jié)合等分子功能密切相關(guān)（圖1A）。KEGG分析結(jié)果表明，蟾毒靈潛在互作蛋白與氨基酸的生物合成以及吞噬體相關(guān)生物學(xué)過程關(guān)系密切（圖1B）。

2.2 GSEA基因集富集分析

GSEA分析結(jié)果表明，蟾毒靈潛在直接相互作用蛋白與氨基酸及衍生物代謝、糖代謝、核糖體、真核細(xì)胞翻譯起始、NF-κB信號通路、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡及DNA復(fù)制等生物學(xué)過程密切相關(guān)（圖2）。同時(shí)，對NES＞2的Hallmarks數(shù)據(jù)集GSEA分析結(jié)果顯示，蟾毒靈潛在直接相互作用蛋白與肌肉發(fā)生、mTORC1信號通路以及蛋白分泌等過程密切相關(guān)（圖3）。

2.3 蛋白-蛋白互作分析

通過STRING數(shù)據(jù)庫對SNR＞1.5的蛋白進(jìn)行蛋白-蛋白互作分析顯示，蟾毒靈潛在互作蛋白之間聯(lián)系密切，構(gòu)成了緊密的網(wǎng)絡(luò)（圖4A）。使用cytoscape軟件sytoHubba插件MCC方法篩選出了

前10位的核心蛋白，分別為RPL6、RPL8、RPL14、GNB2L1、RPS16、RPL31、RPL24、RPL36、RPS4X和FAU（圖4B）。通過檢索核心蛋白詳細(xì)信息，除了GNB2L1外，其余9種核心蛋白均為核糖體大小亞基的組成成分。

2.4 蟾毒靈潛在核心蛋白在泛癌中的表達(dá)

基于TCGA數(shù)據(jù)庫的核心蛋白泛癌表達(dá)分析結(jié)果顯示，與正常組織相比較，核糖體蛋白RPL6在

大多數(shù)癌癥組織中差異表達(dá)，其中RPL6在膽管癌（CHOL）、結(jié)腸癌（COAD）、食管癌（ESCA）、多形成性膠質(zhì)細(xì)胞瘤（GBM）、腎透明細(xì)胞癌（KIRC）、腎乳頭狀細(xì)胞癌（KIRP）、肝細(xì)胞肝癌（LIHC）、肺腺癌

（LUAD）、肺鱗癌（LUSC）、前列腺癌（PRAD）以及胃癌（STAD）11種癌癥中高表達(dá)，在乳腺浸潤癌（BRCA）、宮頸鱗癌和腺癌（CESC）、子宮內(nèi)膜癌（UCEC）和甲狀腺癌（THCA）4種癌癥中低表達(dá)（圖5A）。RPL8在BRCA、CHOL、COAD、ESCA、頭頸鱗狀細(xì)胞癌（HNSC）、GBM、KIRC、KIRP、LIHC、LUAD、LUSC、PRAD、直腸腺癌（READ）、STAD和THCA 15種癌癥中高表達(dá)（圖5B）。RPL14在CHOL、COAD、GBM、KIRC、KIRP、LIHC、PRAD、READ、STAD和THCA 10種癌癥中高表達(dá)，而在BRCA、CESC、HNSC、KICH、LUSC和UCEC 6種癌癥中低表達(dá)（圖5C）。RPL24在腎上腺皮質(zhì)癌（ACC）、BRCA、CHOL、COAD、DLBC、ESCA、GBM、HNSC、KIRC、KIRP、LGG、LIHC、LUAD、LUSC、胰腺癌（PAAD）、PRAD、READ、皮膚黑色素瘤（SKCM）、STAD、

睪丸癌（TGCT）、THCA、胸腺癌（THYM）、UCEC和子宮肉瘤（UCS）24種癌癥中高表達(dá)，在

急性髓細(xì)胞樣白血病（LAML）和卵巢漿液性囊腺癌（OV）中低表達(dá)（圖5D）。

RPL31分析顯示，與正常組織相比，RPL31在CHOL、COAD、GBM、KIRC、KIRP、LIHC、LUAD、LUSC、PRAD、READ和STAD 11種癌癥中高表達(dá)，而在BRCA、CESC、KICH和UCEC 4種癌癥中低表達(dá)（圖5E）。RPL36分析結(jié)果顯示，RPL36在ACC、BLCA、BRCA、CHOL、COAD、DLBC、GBM、KICH、KIRC、KIRP、LIHC、LUAD、LUSC、腦低級別膠質(zhì)瘤（LGG）、PAAD、PRAD、READ、STAD、TGCT、THCA、THYM、UCEC和UCS 23種癌癥中高表達(dá)。同時(shí)，RPL36在ESCA、LAML、OV、嗜鉻細(xì)胞瘤和副神經(jīng)節(jié)瘤（PCPG）和SKCM 5種癌癥中低表達(dá)（圖5F）。RPS4X分析結(jié)果如圖5G所示，在ACC、BRCA、CHOL、COAD、DLBC、ESCA、GBM、KIRC、KIRP、LGG、LIHC、LUAD、LUSC、PAAD、PRAD、READ、STAD、THCA、THYM 19種癌癥中高表達(dá)；在BLCA、CESC、OV、SKCM和UCEC 5種癌癥中低表達(dá)。PRS16分析顯示，與正常組織相比較，RPS16在CHOL、COAD、ESCA、GBM、HNSC、KIRC、KIRP、LIHC、LUAD、LUSC、PRAD、READ和STAD 13種癌癥中高表達(dá)，而在KICH和UCEC中低表達(dá)（圖5H）。FAU分析顯示，與正常組織相比較，F(xiàn)AU在CHOL、COAD、ESCA、GBM、HNSC、KIRC、LIHC和PRAD 9種癌癥中高表達(dá)，而在CESC、KICH和UCEC 3種癌癥中低表達(dá)（圖5I）。

2.5 蟾毒靈潛在核心蛋白對癌癥診斷和預(yù)后影響

蟾毒靈9種潛在核心蛋白對肺癌、肝癌和胃癌預(yù)后的影響分析顯示，肺癌中RPL6和RPL8高表達(dá)預(yù)示著不良的預(yù)后（圖6）；在肝癌中，除FAU和RPL31外，其他7種核心蛋白的高表達(dá)均與肝癌的不良預(yù)后密切相關(guān)（圖7）；在胃癌中，RPL24和RPL31表達(dá)與胃癌病人的生存期呈反比（圖8）。

3 討 "論

盡管近年來癌癥治療研究突飛猛進(jìn)，治療手段逐漸多樣化，但晚期癌癥的治療仍然面臨巨大挑戰(zhàn)。蟾毒靈提取于傳統(tǒng)名貴中藥蟾酥，越來越多的研究結(jié)果表明，蟾毒靈對肝癌、肺癌和膠質(zhì)瘤等多種惡性腫瘤具有良好的抑制作用［18-23］。然而，目前對蟾毒靈抑癌作用的機(jī)制研究仍不夠深入，其主要原因之一是現(xiàn)已明確的蟾毒靈直接互作蛋白寥寥無幾。尋找蟾毒靈在癌癥中的作用靶點(diǎn)是進(jìn)一步闡明其抑癌機(jī)制的關(guān)鍵。

人類蛋白質(zhì)組微陣列也稱為人類蛋白質(zhì)組芯片，因其具有高通量、樣品用量少、靈活性強(qiáng)、靈敏度高、結(jié)果可直接讀出等諸多優(yōu)點(diǎn)，迅速發(fā)展成為藥物靶點(diǎn)及腫瘤生物標(biāo)志物篩選等領(lǐng)域的明星技術(shù)［24］。本課題組利用人類蛋白質(zhì)組微陣列全面篩選了蟾毒靈潛在直接互作蛋白，首先對人類蛋白質(zhì)組微陣列結(jié)果列表中SNR＞1.5的蛋白進(jìn)行了GO、KEGG和GSEA富集分析，結(jié)果表明蟾毒靈潛在直接互作蛋白與核糖體組裝及蛋白質(zhì)合成高度相關(guān)。這提示蟾毒靈可能靶向這些潛在直接相互作用蛋白調(diào)節(jié)核糖體組裝及蛋白質(zhì)合成過程發(fā)揮藥理作用。接著，本研究通過蛋白-蛋白互作分析篩選出排前10位的核心蛋白。通過檢索核心蛋白的信息發(fā)現(xiàn)，這10種核心蛋白中的9種（RPL6、RPL8、RPL14、RPS16、RPL31、RPL24、RPL36、RPS4X和FAU）均為核糖體蛋白，它們是核糖體大小亞基的組成部分。結(jié)合之前富集分析結(jié)果，推測蟾毒靈可能通過靶向這些直接互作蛋白參與核糖體的組裝，并影響后續(xù)細(xì)胞蛋白合成從而發(fā)揮對癌癥的抑制作用。

為了進(jìn)一步探究9種核心蛋白作為蟾毒靈作用靶點(diǎn)的可行性，本文通過TCGA數(shù)據(jù)庫對其在泛癌中的表達(dá)量進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，與正常組織相比，9種核心蛋白在多種癌癥中存在差異表達(dá)，提示這些潛在的核心蛋白在癌癥的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。同時(shí)，通過對數(shù)據(jù)庫中病人的臨床資料分析表明，RPL6、RPL8、RPL14、RPS16、RPL24、RPL36和RPS4X在肝癌中，RPL24和RPL31在胃癌中以及RPL6和RPL8在肺癌中的高表達(dá)預(yù)示著不良的預(yù)后。這表明蟾毒靈潛在直接結(jié)合蛋白的核心蛋白與癌癥的預(yù)后，尤其是肝癌的預(yù)后密切相關(guān)。

核糖體組裝和生物發(fā)生異常與腫瘤發(fā)生之間聯(lián)系密切［25-26］。癌細(xì)胞生長和增殖需要更多的蛋白合成，這依賴于過度活躍的核糖體生物發(fā)生［27］。越來越多的證據(jù)表明，核糖體蛋白表達(dá)的失調(diào)與癌癥進(jìn)展及治療耐藥高度相關(guān)，其中涉及多種生物學(xué)過程，包括細(xì)胞周期、DNA修復(fù)、基因組完整性的維持、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、自噬、細(xì)胞遷移和侵襲［28-30］。相關(guān)研究表明，RPL6表達(dá)水平升高提高了胃癌細(xì)胞的增殖能力和多藥耐藥性［31-32］，沉默RPL8的表達(dá)能夠促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡并抑制肝癌進(jìn)展［33］，RPS4X表達(dá)上升能夠促進(jìn)肝癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移［34］，而RPL14在鼻咽癌中被認(rèn)為是一種抑癌因子［35］。這些結(jié)果為蟾毒靈通過調(diào)節(jié)眾多生物學(xué)過程抑制癌癥進(jìn)展給出了一個合理的解釋。因此，蟾毒靈可能通過靶向核糖體蛋白抑制核糖體組裝和發(fā)生，阻礙癌細(xì)胞的蛋白合成從而發(fā)揮抑癌作用。這需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

此外，本文GO、KEGG和GSEA富集分析結(jié)果還顯示，蟾毒靈潛在結(jié)合蛋白與氨基酸及衍生物代謝、糖酵解、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、DNA復(fù)制以及鈣黏蛋白結(jié)合等生物學(xué)過程密切相關(guān)，且參與調(diào)控NF-κB和mTORC1等信號通路。提示蟾毒靈抑癌機(jī)制可能為：①蟾毒靈可能通過靶向與氨基酸合成、鳥苷核苷酸結(jié)合相關(guān)的蛋白阻礙癌細(xì)胞DNA的復(fù)制，使癌細(xì)胞周期停滯從而抑制癌細(xì)胞增殖，激活細(xì)胞程序性死亡；②高水平的糖酵解是許多癌癥的共同屬性（Warburg效應(yīng)）［36］，蟾毒靈可能通過靶向與糖酵解相關(guān)的蛋白抑制癌細(xì)胞的糖酵解從而發(fā)揮對癌癥的抑制作用；③上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）在癌癥的轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，而鈣黏蛋白的表達(dá)變化是EMT的重要標(biāo)志［37］，蟾毒靈可能靶向與鈣黏蛋白結(jié)合相關(guān)蛋白抑制癌細(xì)胞EMT的發(fā)生從而抑制癌癥的發(fā)生和發(fā)展。

綜上所述，蟾毒靈直接互作蛋白顯著富集于核糖體組裝與發(fā)生以及蛋白質(zhì)合成，直接互作蛋白中位于核心的蛋白主要為核糖體蛋白，這些核心蛋白在多種癌癥中差異表達(dá)并與預(yù)后密切相關(guān)。蟾毒靈可能通過與核糖體蛋白直接相互作用調(diào)控癌細(xì)胞中核糖體的組裝與發(fā)生，阻礙其蛋白合成從而發(fā)揮抑癌作用。本研究為蟾毒靈的作用機(jī)制研究提供了合理的思路，為其作為一種有前景的臨床抗癌藥物奠定了基礎(chǔ)。

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（本文編輯 黃建鄉(xiāng)）

［收稿日期］2023-03-23; ［修訂日期］2023-06-17

［基金項(xiàng)目］國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81803895，818712-31）；山東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（ZR2021YQ57）

［第一作者］陳光（1996-），男，碩士研究生。

［通信作者］李冰（1980-），女，博士，教授，博士生導(dǎo)師。E-mail：libing_516@qdu.edu.cn。楊麗娜（1985-），女，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師。E-mail：yanglina@qdu.edu.cn。