RBP-J調(diào)控病理性Th17細(xì)胞在肝纖維化進(jìn)展中的作用

［摘要］ 目的

探討重組信號結(jié)合蛋白Jκ（RBP-J）對病理性Th17（pTh17）細(xì)胞的調(diào)控以及RBP-J/pTh17軸在肝纖維化進(jìn)展中的作用。

方法 收集5例正常人（供者）和5例肝纖維化病人（受者）的肝組織及外周血樣本。應(yīng)用實(shí)時熒光定量PCR（qRT-PCR）、免疫組織化學(xué)和Western blot方法，檢測肝組織RBP-J和白細(xì)胞介素23受體（IL-23R）的表達(dá)，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)方法檢測外周血中pTh17細(xì)胞的頻率。

結(jié)果 與健康對照組相比，肝纖維化病人肝組織中RBP-J和IL-23R蛋白表達(dá)量以及IL-23R基因表達(dá)水平顯著增加（t=5.70～83.34，Plt;0.05）。與健康對照組相比，肝纖維化病人外周血中pTh17細(xì)胞頻率也明顯增加（t=18.88，Plt;0.01）。

結(jié)論 肝損傷時，RBP-J可能通過驅(qū)動IL-23R表達(dá)促進(jìn)pTh17細(xì)胞分化，從而促進(jìn)肝纖維化的進(jìn)程，提示RBP-J/pTh17軸可能是治療肝纖維化的一個潛在靶點(diǎn)。

［關(guān)鍵詞］ 免疫球蛋白J重組信號序列結(jié)合蛋白質(zhì)；Th17細(xì)胞；肝纖維化

［中圖分類號］ R392.12;R563.9

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］ A

［文章編號］ 2096-5532（2024）05-0647-06

doi：10.11712/jms.2096-5532.2024.60.146

［網(wǎng)絡(luò)出版］ https：//link.cnki.net/urlid/37.1517.R.20241028.1049.005;2024-10-29 09：30：14

Effect of RBP-J regulating pathological Th17 cells in the progression of liver fibrosis

XU Shuo， SONG Meiying， JIANG Suli， DU Qiaochu， LIU Guixian， ZHANG Bei

（Department of Immunology， School of Basic Medicine， Qingdao University， Qingdao 266071， China）

［Abstract］Objective To explore the regulatory effect of recombinant signal-binding protein Jκ （RBP-J） on pathological T helper 17 （pTh17） cells and the role of the RBP-J/pTh17 axis in the progression of liver fibrosis.

Methods Liver tissues and peripheral blood samples from five normal individuals （donors） and five patients with liver fibrosis （recipients） were collected. Real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，immunohistochemistry， and Western blot were applied to measure the expression levels of RBP-J and interleukin 23 receptor （IL-23R） in the liver tissues; flow cytometry was used to determine the frequency of pTh17 cells in peripheral blood samples.

Results In the liver tissues of patients with liver fibrosis， the protein expression of RBP-J and IL-23R and the gene expression level of IL-23R were significantly increased in comparison with that of healthy controls （t=5.70-83.34，Plt;0.05）. In the peripheral blood of patients with liver fibrosis， pTh17 cell frequency was also significantly increased compared with that of healthy controls （t=18.88，Plt;0.01）.

Conclusion In liver injury， RBP-J may promote pTh17 cell differentiation by driving IL-23R expression and thus promote the progression of liver fibrosis，suggesting that the RBP-J/pTh17 axis may be a potential target for the treatment of liver fibrosis.

［Key words］ immunoglobulin J recombination signal sequence-binding protein; Th17 cells; hepatic fibrosis

肝纖維化是各種肝臟損傷的共同特征，主要表現(xiàn)為肝內(nèi)結(jié)締組織增生與沉積［1］。肝結(jié)締組織由膠原蛋白、非膠原基質(zhì)蛋白及有關(guān)細(xì)胞如肝星狀細(xì)胞（HSCs）等組成。HSCs的活化以及肝細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）合成增多而降解不足是肝纖維化病理變化的中心環(huán)節(jié)［2-4］。Th17細(xì)胞分泌的白細(xì)胞介素（IL）-17A是一種促炎細(xì)胞因子，在炎癥及肝纖維化中起重要作用。IL-17A誘導(dǎo)HSCs等炎癥細(xì)胞的活化和趨化，作為纖維化因子參與ECM的重塑，導(dǎo)致纖維化［5］。Th17細(xì)胞可分為不同亞群，IL-1β、IL-6和IL-23等細(xì)胞因子交替誘導(dǎo)會使Th17細(xì)胞分化為病理性Th17（pTh17）細(xì)胞［6］。pTh17細(xì)胞的分化需要IL-23受體（IL-23R）與IL-23的結(jié)合，IL-23R的表達(dá)是pTh17細(xì)胞分化的關(guān)鍵因素。Notch信號通路中的重組信號結(jié)合蛋白Jκ（RBP-J）是Notch受體下游的轉(zhuǎn)錄因子。RBP-J可通過驅(qū)動IL-23R的表達(dá)促進(jìn)pTh17細(xì)胞的分化［7］。但是RBP-J影響肝纖維化發(fā)生發(fā)展的研究相對較少。本研究旨在探討RBP-J對pTh17細(xì)胞的調(diào)控以及RBP-J/pTh17軸在肝纖維化進(jìn)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 樣本獲取

在青島大學(xué)附屬醫(yī)院器官移植中心獲取5例正常人（供者，健康對照）和5例肝纖維化病人（受者）的肝組織及外周血樣本。正常人與病人年齡均在18～63歲之間。本研究獲得青島大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 肝損傷組織學(xué)檢測

肝臟組織石蠟包埋后切片，行蘇木精-伊紅（HE）染色，用中性樹膠玻片，在高倍鏡（400倍）下查看3～5個視野，觀察肝臟組織結(jié)構(gòu)并拍照。

1.3 免疫組化檢測RBP-J和IL-23R蛋白表達(dá)

肝臟組織石蠟包埋后切片，進(jìn)行脫蠟和水化；用檸檬酸鈉緩沖液進(jìn)行熱修復(fù)，以PBS洗2～3次；滴加50 μL一抗，在室溫下放置1 h或在4 ℃過夜；滴加45～50 μL二抗，在37 ℃放置1 h；以PBS洗3次，DAB顯色，應(yīng)用蘇木精復(fù)染，自來水洗10～15 min；脫水、封片后在高倍鏡（400倍）下查看3～5個視野，觀察免疫組化結(jié)果并拍照。

1.4 Western blot檢測RBP-J蛋白表達(dá)

用RIPA Lysis Buffer蛋白提取試劑提取肝組織總蛋白，用100 g/L十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜上。將膜用羊抗人RBP-J抗體在室溫下孵育1 h，再用過氧化物酶標(biāo)記的兔抗山羊IgG在室溫下孵育1 h，

采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法觀察膜上的特異性蛋白條帶。以GAPDH為參照，計算目的蛋白的相對表達(dá)水平。

1.5 實(shí)時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測IL-23R基因表達(dá)

肝組織用TRIzol試劑溶解，提取總RNA，用翌圣試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄以及qRT-PCR。qRT-PCR 反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共進(jìn)行40個循環(huán)。使用2- △△Ct方法計算目的基因的表達(dá)水平。PCR引物及其序列見表1。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血pTh17細(xì)胞頻率

用150 μg/L佛波酯 （碧云天）和500 μg/L離子霉素（碧云天）刺激外周血單個核細(xì)胞6 h；固定和滲透細(xì)胞。用于表面染色的抗人單克隆抗體為抗人CD4（BioLegend）。用于細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色的抗體為粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF，BioLegend）、IL-17A（BioLegend）和RBP-J（愛必信）。采集數(shù)據(jù)一式兩份，使用FlowJo軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.7 免疫熒光法檢測RBP-J與IL-23R表達(dá)

肝組織石蠟切片脫蠟至水，抗原修復(fù)和血清封閉后，加RBP-J一抗及對應(yīng)的HRP標(biāo)記的二抗（愛必信），加CY3-TSA（塞維爾），微波處理后加IL-23R一抗（博奧森）及對應(yīng)的二抗（愛必信），然后用DAPI復(fù)染細(xì)胞核，抗熒光淬滅劑封片，于熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.8 生物信息學(xué)分析

從GEO數(shù)據(jù)庫GSE84044數(shù)據(jù)集中下載124例肝纖維化病人數(shù)據(jù)，使用R軟件包GSVA進(jìn)行單樣本基因富集分析（ssGSEA）和基因集變異分析，使用ComplexHeatmap軟件包繪制熱圖。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

采用Graph Pad Prism 8軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，數(shù)據(jù)間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以Plt;0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) "果

2.1 生物信息學(xué)分析

免疫浸潤分析結(jié)果顯示，Notch信號通路富集于肝纖維化程度（Degree of liver fibrosis）2、3期（圖1A），Th17細(xì)胞富集于Degree of liver fibrosis 1、2期（圖1B），IL-23R富集于Degree of liver fibrosis 1、2、4期（圖1C），GM-CSF富集于Degree of liver fibrosis 1期（圖1D）。肝纖維化病人scheuer score-s與scheuer score-g之間有明顯相關(guān)性。scheuer score-s較高的病人肝組織中炎癥細(xì)胞浸潤明顯增加（圖1E～H）。

2.2 肝纖維化病人肝組織RBP-J表達(dá)

HE染色結(jié)果顯示，肝纖維化病人肝組織有明顯的纖維化以及結(jié)締組織增生（圖2A）。免疫組化檢測結(jié)果顯示，與健康對照組相比，肝纖維化病人肝組織中RBP-J蛋白表達(dá)呈顯著陽性表達(dá)，而且在結(jié)締組織中表達(dá)尤為明顯（圖2B、C），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=83.34，Plt;0.001）。Western blot檢測結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了肝纖維化病人肝組織中RBP-J的高表達(dá)（圖2D、E），與健康對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=32.83，Plt;0.001）。

2.3 肝纖維化病人肝組織IL-23R表達(dá)

免疫組化檢測結(jié)果顯示，肝纖維化病人肝組織中IL-23R 表達(dá)水平明顯高于健康對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=9.28，Plt;0.05）。見圖3A、B。qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，肝纖維化病人肝組織中

IL-23R mRNA表達(dá)水平明顯高于健康對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=5.70，Plt;0.001）。見圖3C。

2.4 肝纖維化病人肝組織中RBP-J和IL-23R的共定位

免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，RBP-J與IL-23R共定位于同一細(xì)胞中，并且這些細(xì)胞大多數(shù)位于結(jié)締組織中（圖4）。

2.5 肝纖維化病人外周血中pTh17細(xì)胞的表達(dá)

流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，與健康對照組相比較，肝纖維化病人外周血中CD4+IL-17A+細(xì)胞和CD4+IL-17A+GM-CSF+細(xì)胞的表達(dá)頻率均顯著升高（t=12.04、18.88，Plt;0.001）。見圖5。

2.6 肝纖維化病人外周血CD4+IL-17A+細(xì)胞中RBP-J+細(xì)胞的表達(dá)

與健康對照組相比較，肝纖維化病人外周血CD4+IL-17A+細(xì)胞中RBP-J+細(xì)胞的表達(dá)頻率顯著增高（t=11.86，Plt;0.001）。見圖6。

3 討 "論

臨床上肝病難以治愈，關(guān)鍵在于機(jī)制不清［7］。肝纖維化期是各種肝損害的必經(jīng)階段，探索肝纖維化調(diào)控機(jī)制對肝病治療意義重大。本研究將目光聚焦于炎癥反應(yīng)后的免疫應(yīng)答，探討其在炎癥反應(yīng)進(jìn)程中的作用。近些年來的研究發(fā)現(xiàn)，Th17細(xì)胞與ECM的沉積和肝纖維化的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［8-11］。Th17細(xì)胞和IL-17A現(xiàn)在被認(rèn)為在包括自身免疫和對感染的應(yīng)答在內(nèi)的多種病理過程中扮演重要角色。事實(shí)上，IL-17A在結(jié)腸炎、癌癥、牛皮癬、實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）和多種感染模式中發(fā)揮著重要作用［12-15］。其中pTh17細(xì)胞起著不可忽視的作用，pTh17細(xì)胞和非致病性Th17細(xì)胞有不同的基因表達(dá)譜，前者特異性表達(dá)高水平的GM-CSF、IL-23R和低水平的CD5L［15-17］。Notch信號通路關(guān)鍵效應(yīng)分子RBP-J作為典型的炎癥通路因子，在肝臟炎癥發(fā)生發(fā)展時被大量激活。Th17細(xì)胞轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析表明，RBP-J是Th17細(xì)胞分化的積極調(diào)節(jié)因子，RBP-J通過驅(qū)動IL-23R的表達(dá)和抑制抗炎細(xì)胞因子IL-10的產(chǎn)生來維持Th17細(xì)胞的致病狀態(tài)［17-22］。因此，RBP-J被大量激活上調(diào)了IL-23R的表達(dá)，進(jìn)一步促進(jìn)了pTh17細(xì)胞的分化以及大量促炎因子分泌，參與肝纖維化的進(jìn)程。

本研究結(jié)果顯示，與健康對照組相比，肝纖維化病人肝組織中RBP-J和IL-23R蛋白表達(dá)量以及IL-23R基因表達(dá)水平顯著增加，并且RBP-J與IL-23R共定位于同一細(xì)胞中，大多數(shù)位于結(jié)締組織中。

與健康對照組相比，肝纖維化病人外周血中Th17細(xì)胞頻率也明顯增加。在CD4+IL-17A+細(xì)胞的分群下進(jìn)一步觀察pTh17細(xì)胞的表達(dá)頻率，結(jié)果顯示，與健康對照組相比，肝纖維化病人CD4+IL-17A+GM-CSF+細(xì)胞頻率明顯增加。對肝纖維化病人外周血CD4+IL-17A+細(xì)胞中RBP-J+細(xì)胞的表達(dá)進(jìn)行分析顯示，RBP-J+細(xì)胞頻率顯著高于健康對照組。以上結(jié)果提示，在肝纖維化中pTh17細(xì)胞被激活，促炎因子IL-17A和GM-CSF分泌量增加，且pTh17細(xì)胞被激活是受到RBP-J的調(diào)控，Notch信號通路以及pTh17細(xì)胞可能在調(diào)控肝纖維化和肝組織炎癥中發(fā)揮重要作用。

綜上所述，肝損傷時，RBP-J可能通過驅(qū)動IL-23R的表達(dá)促進(jìn)Th17細(xì)胞分化為pTh17細(xì)胞，分泌大量促炎因子，從而促進(jìn)肝纖維化的進(jìn)程，提示RBP-J/pTh17軸可能是治療肝纖維化的一個潛在靶點(diǎn)。本研究結(jié)果為明確肝纖維化調(diào)控機(jī)制做出補(bǔ)充，為臨床上肝病的治愈提供了一個新的方向。

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（本文編輯 馬偉平）

［收稿日期］2023-02-10; ［修訂日期］2023-08-01

［基金項(xiàng)目］青島市科技惠民資助項(xiàng)目（22-3-7-smjk-7-nsh）

［第一作者］徐碩（1997-），男，碩士研究生。

［通信作者］張蓓（1973-），女，博士，教授，博士生導(dǎo)師。E-mail：zhangbei124@aliyun.com。