circPCMTD1對AML細胞惡性行為影響及機制

［摘要］ 目的

探討circPCMTD1對急性髓系白血病（AML）細胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響及其分子機制。

方法 體外培養人骨髓基質細胞系HS-5與AML細胞系HL-60、THP-1、U-937和Kasumi-1。將THP-1細胞隨機分為NC組、si-NC組、si-circPCMTD1組、miR-328 NC組、miR-328-3p組和si-circPCMTD1+anti-miR-NC/anti-miR-328-3p組。采用實時熒光定量PCR（RT-qPCR）和Western blot法分別檢測circPCMTD1、miR-328-3p表達量和相關蛋白的表達量；采用3-（4，5-二甲基噻唑-2-基）-2，5-二苯四唑溴化銨（MTT）法、Transwell實驗和流式細胞術分別檢測細胞增殖、遷移、侵襲和凋亡；并通過雙熒光素酶報告實驗評估circPCMTD1和miR-328-3p的關系。

結果 與HS-5細胞比較，circPCMTD1在AML細胞中高表達（F=66.258，P＜0.05），miR-328-3p則相反（F=101.145，P＜0.05）。下調circPCMTD1抑制了細胞的增殖、遷移、侵襲及其相關蛋白表達，并誘導了細胞的凋亡（F=38.952～290.338，P＜0.05）。上調miR-328-3p可削弱WT-circPCMTD1的熒光素酶活性，且下調miR-328-3p可減弱circPCMTD1下調對細胞增殖的抑制作用（F=42.655，P＜0.05）。

結論 沉默circPCMTD1可通過靶向miR-328-3p抑制AML細胞的生長。

［關鍵詞］ 白血病，髓樣，急性；RNA，環狀；微RNAs；細胞增殖；細胞運動；腫瘤浸潤；細胞凋亡

［中圖分類號］ R733.72

［文獻標志碼］ A

［文章編號］ 2096-5532（2024）05-0663-06

doi：10.11712/jms.2096-5532.2024.60.162

［網絡出版］ https：//link.cnki.net/urlid/37.1517.R.20241111.0913.001;2024-11-11 14：27：38

Effect of circPCMTD1 on malignant behavior of acute myeloid leukemia cells and its mechanism

LU Jingzhong， FANG Yongxiu， HUANG Meiqin， WANG Xiaohong

（Department of Hematology， Chongming Hospital Affiliated to Shanghai University of Health Sciences， Shanghai 202150， China）

［Abstract］Objective To explore the effects of circPCMTD1 on the proliferation， migration， invasion， and apoptosis of acute myeloid leukemia （AML） cells and the underlying molecular mechanism.

Methods Human bone marrow stromal cell line HS-5 and AML cell lines HL-60， THP-1， U-937， and Kasumi-1 were cultured in vitro. THP-1 cells were randomly divided into NC group， si-NC group， si-circPCMTD1 group， miR-328 NC group， miR-328-3p group， si-circPCMTD1+anti-miR-328 NC group， and si-circPCMTD1+anti-miR-328-3p group. Real-time fluorescence quantitative PCR and Western blot were used to mea-

sure the expression of circPCMTD1， miR-328-3p， and related proteins. Cell proliferation， migration， invasion， and apoptosis were assessed by 3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-2， 5-diphenyltetrazolium bromide （MTT）， Transwell and flow cytometry methods. The relationship between circPCMTD1 and miR-328-3p was analyzed by dual luciferase reporting assay.

Results Compared with HS-5 cells， circPCMTD1 was highly expressed in AML cells （F=66.258，Plt;0.05）， whereas the opposite was true for miR-328-3p （F=101.145，Plt;0.05）. Silencing circPCMTD1 inhibited the proliferation， migration， and invasion of cells and the expression of related proteins， and induced cell apoptosis （F=38.952-290.338，Plt;0.05）. Upregulation of miR-328-3p impaired the luciferase activity of WT-circPCMTD1， and downregulation of miR-328-3p attenuated the inhibitory effect of circPCMTD1 downregulation on cell proliferation （F=42.655，Plt;0.05）.

Conclusion Silencing circPCMTD1 can repress THP-1 cell growth through targeting miR-328-3p.

［Key words］ leukemia， myeloid， acute; RNA， circular; microRNAs; cell proliferation; cell movement; neoplasm invasiveness; apoptosis

急性髓系白血病（AML）是白血病的4個亞型之一。AML是成人中最常見的急性白血病，發病率和病死率都很高［1］。盡管化療、支持性治療和造血干細胞移植等治療方法取得了許多進展，但其對AML病人的療效不理想［2］。因此，深入探索新的治療靶點和闡明疾病病理機制有助于AML的治療。環狀RNA（circRNA）是一種具有共價閉合環和高穩定性的單鏈RNA分子［3］。有研究結果表明，circPCMTD1參與調控人類惡性腫瘤進展［4］。然而，circPCMTD1在白血病中的作用尚不清楚。既往研究表明，miR-328-3p 在AML中的表達明顯減少［5］，miR-328-3p低表達與AML病人的不良預后有關［6］。雖然miR-328-3p 在AML中的作用已有報道，但 circPCMTD1/miR-328-3p 在AML中的作用尚不清楚。本研究旨在探討circPCMTD1是否能通過靶向 miR-328-3p影響AML細胞的進展。現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

人骨髓基質細胞系HS-5與AML細胞系HL-60、THP-1、U-937和Kasumi-1購自美國ATCC公司；胎牛血清和RPMI-1640培養液購自美國Gibco公司；Trizol、反轉錄和實時熒光定量PCR（RT-qPCR）試劑購自日本Takara公司；3-（4，5-二甲基-2-噻唑基）-2，5二苯基溴化四唑（MTT）和Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒分別購自上海晶抗生物工程有限公司和上海貝博生物公司；RIPA蛋白裂解液和BCA試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司；Transwell小室和Matrigel基質膠購自美國BD公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒和Lipofectamine2000分別購自美國Promega公司和Invitrogen公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞轉染與分組 THP-1細胞以80%融合度進行轉染。基于Lipofectamine2000的脂質體轉染法，將si-NC、si-circPCMTD1、miR-328 NC、miR-328-3p分別轉染至THP-1細胞中，分別標記為si-NC組、si-circPCMTD1組、miR-328 NC組和miR-328-3p組，而未轉染的細胞標記為NC組。另將si-circPCMTD1和anti-miR-328 NC、si-circPCMTD1和anti-miR-328-3p分別共轉染至THP-1細胞中，分別標記為si-circPCMTD1+anti-miR-328 NC組和si-circPCMTD1+anti-miR-328-3p組。細胞轉染48 h后，用于后續實驗。

1.2.2 RT-qPCR檢測各組circPCMTD1和miR-328-3p表達 先提取細胞總RNA并反轉錄合成cDNA，再按RT-qPCR試劑盒說明書步驟行PCR擴增，最后采用2-△△Ct方法計算各組circPCMTD1和miR-328-3p相對于GAPDH和U6的表達水平。circPCMTD1、miR-328-3p、GAPDH、U6的引物由生工生物工程公司合成。

1.2.3 MTT法檢測細胞活性 依據文獻報道的方法進行細胞活性檢測［7］。在酶標儀450 nm波長處測定THP-1細胞（2.5×107/L）的吸光度。

1.2.4 Transwell侵襲實驗檢測細胞遷移及侵襲能力 依據文獻報道的方法進行Transwell實驗［8］。下室表面遷移或侵襲的細胞經固定和染色后，在顯微鏡下觀察并分析隨機選取的5個視野內的遷移或侵襲細胞數。

1.2.5 流式細胞術檢測細胞凋亡 依據文獻報道的方法進行流式細胞術檢測［9］。收集的細胞經PBS漂洗后，添加結合緩沖液對細胞進行重懸。 隨后，將5 μL Annexin V-FITC摻入細胞內，置于5 μL碘化丙啶（PI）中15 min后檢測。用流式細胞儀檢測細胞的凋亡率。

1.2.6 Western blot法檢測細胞中蛋白的表達 依據文獻報道的方法檢測各組細胞增殖、遷移、侵襲和凋亡相關蛋白（包括PCNA、MMP-2、MMP-9、Bcl-2和Bax）的表達水平［10］。提取的細胞總蛋白經SDS-PAGE分離后轉膜，封閉后，加一抗4 ℃孵育過夜，隨后浸泡在二抗稀釋液中室溫孵育2 h。曝光顯影，應用Image J軟件分析條帶灰度值。

1.2.7 雙熒光素酶報告基因實驗驗證circPCMTD1和miR-328-3p的作用關系 將WT-circPCMTD1（野生型）和MUT-circPCMTD1（突變型）分別與miR-328 NC和miR-328-3p共轉染至THP-1細胞中，按照說明分析細胞的熒光素酶活性。

1.3 統計學處理

采用SPSS 21.0軟件進行統計學處理。計量資料數據以±s表示，兩組或多組比較采用獨立樣本t檢驗和單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 "果

2.1 AML細胞中circPCMTD1和miR-328-3p的表達

各組細胞circPCMTD1和miR-328-3p表達比較，差異均有統計學意義（F=66.258、101.145，P＜0.05）。與HS-5細胞相比較，AML細胞系HL-60、THP-1、U-937、Kasumi-1細胞circPCMTD1表達明顯升高（P＜0.05），而miR-328-3p表達明顯降低（P＜0.05）。見表1。

2.2 敲低circPCMTD1對THP-1細胞惡性行為的影響

各組circPCMTD1表達、細胞活力、遷移和侵襲細胞數目、凋亡率、相關蛋白表達比較差異均有統計學意義（F=38.952～290.338，P＜0.05）。與si-NC組比較，si-circPCMTD1組的circPCMTD1表達、細胞活力、遷移和侵襲細胞數目以及PCNA、MMP-2、MMP-9、Bcl-2蛋白表達明顯降低（P＜0.05），而凋亡率和Bax表達明顯增加（P＜0.05）。見圖1、表2。

2.3 circPCMTD1和miR-328-3p的作用關系

Starbase分析發現circPCMTD1的一段核苷酸序列與miR-328-3p結合。見圖2。上調miR-328-3p降低了WT-circPCMTD1的熒光素酶活性（t=17.830，P＜0.05）。見表3。敲減（si-circPCMTD1）和過表達circPCMTD1（pcDNA-circPCMTD1）分別上調和下調miR-328-3p，即circPCMTD1負調控miR-328-3p的表達（t=11.550～17.190，P＜0.05）。見表4。

2.4 上調miR-328-3p對THP-1細胞惡性行為的影響

各組miR-328-3p表達、細胞活力、遷移和侵襲細胞數目、凋亡率、相關蛋白表達比較差異均有統計

學意義（F=34.020～466.200，P＜0.05）。與miR-NC組比較，miR-328-3p組miR-328-3p表達、凋亡率以及Bax蛋白表達顯著增加（P＜0.05），而細胞活力、遷移和侵襲細胞數目以及PCNA、MMP-2、MMP-9、Bcl-2蛋白表達水平明顯下降（P＜0.05）。見圖3、表5。

2.5 敲低miR-328-3p對下調circPCMTD1介導的THP-1細胞生長抑制作用影響

與si-circPCMTD1+anti-miR-328 NC組比較，si-circPCMTD1+anti-miR-328-3p組的miR-328-3p表達、凋亡率以及Bax蛋白表達明顯降低（F=56.720～87.840，P＜0.05），而細胞活力、遷移和侵襲細胞數目以及PCNA、MMP-2、MMP-9、Bcl-2蛋白表達水平明顯升高（F=42.655～200.800，P＜0.05）。見圖4、表6。

3 討 "論

越來越多的證據表明，circRNA參與了白血病的發生和發展。circ_0000143在T細胞急性淋巴細胞白血病中的表達降低，其過表達可抑制T細胞急性淋巴細胞白血病細胞的存活、遷移和侵襲，并誘導細胞凋亡［11］。過表達circ_0000745可促進T細胞急性淋巴細胞白血病細胞增殖并抑制其凋亡，抑制其表達則結果相反［12］。下調circ_0009910可抑制AML細胞的球體形成和自噬，并促進其凋亡［13］。circ_0012152在AML組織和細胞中表達增加，敲減circ_0012152可抑制AML細胞增殖，并促進細胞凋亡［14］。circ_0002483在AML中表達升高，其表達下調可抑制AML細胞增殖，促進細胞周期阻滯和細胞凋亡［15］。本文結果顯示，circPCMTD1在AML細胞中表達上調，其表達下調可以抑制細胞增殖、遷移和侵襲，并增加細胞的凋亡率。提示敲低circPCMTD1可削弱THP-1細胞的生長。

既往研究表明，circPCMTD1可以作為競爭性內源RNA抑制miRNA，從而參與促進膠質瘤進展［4］。本研究Starbase分析發現，circPCMTD1的一段核苷酸序列與miR-328-3p互補。同時，miR-328-3p上調可降低WT-circPCMTD1熒光素酶活性，且上調和下調circPCMTD1分別顯著降低和升高miR-328-3p的表達，即circPCMTD1靶向負調控miR-328-3p表達。大量研究表明，miR-328-3p可抑制多種癌細胞的惡性行為。例如，上調miR-328-3p

表達可抑制乳癌細胞的生長和轉移［16］。miR-328-3p模擬物可抑制肺腺癌細胞的增殖和遷移，促進細胞凋亡［17］。上調miR-328-3p減弱了結直腸癌細胞的生長和轉移［18］。miR-328-3p可通過調控整合素α5限制膀胱癌細胞的生長，其低表達可預示膀胱癌病人預后不良［19］。本文研究結果顯示，miR-328-3p在AML細胞中表達下調，而其上調削弱了THP-1細胞的生長和轉移能力。提示miR-328-3p限制了THP-1細胞的惡性行為；此外，miR-328-3p的下調減弱了沉默circPCMTD1對THP-10細胞生長和轉移的抑制作用。提示circPCMTD1可通過靶向miR-328-3p影響THP-1細胞的惡性行為。

綜上所述，circPCMTD1在AML細胞中表達上調，其敲低可以通過靶向調控miR-328-3p抑制THP-1細胞的惡性表型，這為治療AML提供了新的潛在靶點。然而，本研究的不足之處為僅限于體外實驗，circPCMTD1在體內的作用和具體的調控機制有待進一步探討。

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（本文編輯 牛兆山）

［收稿日期］2024-05-15; ［修訂日期］2024-07-15

［基金項目］上海市崇明區“可持續發展科技創新行動計劃”項目（CKY2022-04）

［第一作者］陸靜忠（1980-），男，碩士，主治醫師。

［通信作者］王小紅（1980-），女，統計師。E-mail：ysfwxh502@163.com。