陸地棉GHWAT1-35基因的克隆及亞細胞定位

摘 要：【目的】研究陸地棉GHWAT1-35基因在棉花纖維發育過程中的作用。

【方法】選用陸地棉系9花后不同時期的纖維為材料，克隆GHWAT1-35基因的全長cDNA序列，并進行生物信息學、實時熒光定量（qRT-PCR）分析及亞細胞定位。

【結果】該基因全長1 125 bp，編碼374個氨基酸，相對分子量為40.231 kDa，理論等電點為8.74。GHWAT1-35蛋白與亞洲棉親緣關系最近。GHWAT1-35基因在開花后15 d表達量顯著升高，亞細胞定位預測表明該蛋白定位于細胞質膜上。將GHWAT1-35基因與pCAMIA1300-35S-YFP載體重組，構建融合表達載體，利用凍融法轉化農桿菌，注射到煙草后觀察到GHWAT1-35蛋白定位在細胞質膜上。

【結論】陸地棉系9 GHWAT1-35基因在開花后15和20 DAP的表達量顯著高于其他時期，pC1300∷35S-WAT-YFP融合蛋白定位于細胞質膜上。

關鍵詞：陸地棉；WAT1；基因克??；生物信息學；亞細胞定位

中圖分類號：S562"" 文獻標志碼：A"" 文章編號：1001-4330（2024）06-1310-08

0 引 言

【研究意義】棉花纖維品質高低直接影響棉紡織品的質量［1， 2］。纖維發育是棉花生長發育過程中至關重要的環節，其中涉及了多個基因的調控和作用［3］。因此，棉花質量也成為原棉競爭力的關鍵要素。研究陸地棉GHWAT1-35基因在棉花纖維發育過程中的作用，對挖掘棉花纖維發育相關基因具有重要意義。【前人研究進展】Walls Are Thin 1（WAT1）是一種植物特異性蛋白，其功能早在擬南芥中已被揭示［4］。Ranocha等［5］研究發現，WAT1是一種液泡膜上的轉運蛋白，在擬南芥各個組織器官中均有表達，在莖和下胚軸表達量最高，這些組織均具有相對較高比例的次生壁細胞。NAC轉錄因子NST1和NST3是植物次生壁合成的關鍵調節因子，其參與轉錄級聯的激活，促進次生壁的生物合成［6］。在擬南芥WAT1突變體中轉錄因子SND1和NST1的表達下調，其靶基因KNAT7和MYB103表達量也顯著降低，該2個轉錄因子在植物纖維次生壁合成過程中發揮著至關重要的作用。擬南芥WAT1是液泡膜上的轉運蛋白，可促進生長素進入植物液泡中，從而維持植物內部生長素的平衡。擬南芥WAT1突變體植株木質素含量降低、莖纖維次生細胞壁厚度降低、生長素運輸受阻、莖中生長素含量顯著降低［7］。彭方林等［8］發現，At1g01070基因位于擬南芥的細胞質膜上，超表達該基因篩選得到純和株系，發現其參與調控擬南芥的開花時間，可促進擬南芥幼株株高增加和幼根生長。Ju等［9］發現，WAT1參與陸地棉果枝發育過程，在魯棉研28號和新陸中77號2個品種之間植株結構差異顯著，前者果枝節間距較長，株型疏松；后者果枝節間距較短，株型緊湊。RNASeq和qRT-PCR結果表明，生長素信號轉導在魯棉研28號中是正調控的，但在新陸中77號中受到負調控，魯棉研28號的生長素明顯含量高于新陸中77號。Tang等［10］在GhWAT123沉默的陸地棉中發現，水楊酸（SA）相關基因的表達顯著上調，導致水楊酸含量升高。木質部發育受到抑制，造成木質素沉積［11， 12］。Hanika等［13］利用VIGS技術瞬時沉默番茄植株中的SlWAT1基因，對經過SlWAT1基因沉默的植株進行篩選，并測試其對番茄黃萎病病原體的抗病性。結果表明，沉默后的番茄植株的萎縮程度顯著降低，SlWAT1在番茄中作為黃萎病感病因子發揮著重要作用。在鹽、干旱、低溫環境脅迫下，香蕉中MaWAT1s表達量顯著上調［14］。WAT1蛋白可通過參與生長素、水楊酸等激素的代謝過程調控植物生長發育與抗逆反應［15］?！颈狙芯壳腥朦c】由于WAT1蛋白在植物生長發育中發揮重要作用，而在陸地棉纖維發育過程中，WAT1蛋白的作用機制鮮有報道，需要進一步克隆和分析WAT1蛋白相關基因?！緮M解決的關鍵問題】以陸地棉系9的纖維組織為材料，克隆得到GHWAT1-35基因，對其進行生物信息學和亞細胞定位分析，分析GHWAT1-35的功能，為深入探究該基因在棉花纖維發育過程中的作用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

選擇陸地棉系9（簡稱系9）開花后（DPA）不同發育階段（0、5、10、15、20、25和30 DPA）的棉纖維組織及本氏煙草葉片。

1.2 方 法

1.2.1 總RNA 的提取與克隆

采集陸地棉系9不同發育時期的纖維組織，并立即用液氮進行速凍后，置于-80℃冰箱保存，備用。使用RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（TIANGEN）提取纖維樣品中的總RNA，并檢測RNA的濃度以確保質量合格。以提取的總RNA作為模板，根據FastKing cDNA第一條鏈合成試劑盒說明書進行反轉錄實驗，并將反轉錄產物置于-20℃冰箱保存待用。在CottonFGD數據庫中，下載GHWAT1-35基因CDS序列。以反轉錄合成的cDNA作為PCR模板，進行PCR擴增，擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增條帶的特異性。

1.2.2 生物信息學

利用ExPAXSy-ProtParam在線工具（https：//web.expasy.org/protparam/）對目的蛋白GHWAT1-35的理化性質進行分析，并使用TMHMM-2.0（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）和SignaIP（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-6.0/）在線工具對蛋白是否存在跨膜區和信號肽進行預測。使用InterPRO（https：//www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence/）對GHWAT1-35蛋白的功能結構域進行預測。使用NCBI網站BlastP工具對GHWAT1-35進行分析，得到多個物種的WAT1同源蛋白序列，利用GeneDoc軟件進行氨基酸序列比對，利用MEGA5軟件構建系統發育進化樹。運用PSIPRED（http：//bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/）和SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/interactive）同源建模方法預測分析蛋白質的二級和三級結構。利用WoLF PSORT網站（https：//wolfpsort.hgc.jp/）進行亞細胞定位預測。使用PlantCARE（https：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）在線網站預測GHWAT1-35的啟動子順式作用元件。

1.2.3 GHWAT1-35實時熒光定量表達

以系9開花后0、5、10、15、20、25和30 DPA的纖維組織為材料，提取總RNA后反轉錄得到cDNA。以棉花GhUBQ7作為熒光定量的內參基因，設計qRT-PCR引物，根據ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix（Vazyme）說明書進行qRT-PCR。采用2-ΔΔct法計算基因相對表達量［16］，并用GraphPad Prism 9繪圖。

1.2.4 融合表達載體的構建

使用EcoRI和SpeI限制性內切酶對pC1300-35S-YFP載體進行雙酶切，并使用ClonExpress II One Step Cloning Kit同源重組試劑盒，將目的片段GHWAT1-35構建至線性化的pC1300-35S-YFP載體中，獲得的重組產物轉化至大腸桿菌（DH5α）感受態細胞［17］。挑取重組反應轉化平板上的單克隆進行菌落PCR瓊脂糖凝膠電泳檢測，將條帶大小符合的產物送至上海生工生物有限公司進行測序，獲得重組質粒pC1300∷35S-GHWAT1-35-YFP，在驗證正確的菌液中加入50%的甘油，置-80℃冰箱保存備用。

活化凍存的農桿菌（GV3101）感受態細胞，通過質粒液氮凍融法將重組質粒pC1300∷35S-GHWAT1-35-YFP轉化至農桿菌感受態細胞中［18］，將菌液涂布于含卡那和利福平霉素抗生素的LB固體培養基上，28℃暗培養，待長出單克隆后鑒定陽性克隆，在陽性菌液加入等體積50%的甘油，置于-80℃冰箱保存備用。

將含有重組融合表達載體pC1300∷35S-GHWAT1-35-YFP的農桿菌進行過夜培養后，加入提前制備的懸浮液（10 mmol/L MgCl2、10 mmol/L MES，100 μmol/L AS），室溫下避光靜置3 h，用于后續試驗侵染［19］。

選取4～5葉期長勢好的本氏煙草葉片，用注射器吸取懸浮液，注射到煙草葉片下表皮細胞中［20］。以轉入空載體的煙草葉片作為陰性對照，注射后培養72 h，取樣并使用激光共聚焦熒光顯微鏡觀察葉片中YFP熒光蛋白信號分布［21］。

2 結果與分析

2.1 系9 GHWAT1-35基因的克隆

研究表明，以系9總RNA反轉錄合成的cDNA為模板，利用特異性引物進行PCR擴增得到GHWAT1-35基因。獲得條帶清晰、條帶大小為1125 bp的cDNA片段，擴增產物序列與陸地棉GHWAT1-35基因序列一致，GHWAT1-35基因克隆成功。圖1

2.2 GHWAT1-35基因的生物信息學

研究表明，該蛋白質的分子式為C1842H2900N458O498S25，編碼374個氨基酸，分子量為40.23 kDa，理論等電點為8.74。其中，Gly占氨基酸總數的含量最多（10.3%），14個殘基帶負電荷（Asp+Glu）和24個殘基帶正電荷（Arg+Lys）。不穩定系數為20.03，為穩定蛋白，脂肪系數為68.47。在14位的疏水性值最強為2.367（max），在337位親水性值最強為-2.233（min），親疏水性總平均值為-0.978，屬于親水性蛋白。預測該蛋白共有22個磷酸化位點，其中絲氨酸（Ser）15個，蘇氨酸（Thr）5個，酪氨酸（Tyr）2個。在該蛋白質中存在9個跨膜區，但不存在信號肽。圖2～5

與亞洲棉、雷蒙德氏棉、海島棉、橡膠樹、榴蓮、可可、黃麻的相似性分別為99.73%、98.67%、88.50%、84.2%、82.38%和74.18%。系9 GHWAT1-35蛋白與亞洲棉和雷蒙德氏棉的親緣關系較近，與黃麻、可可親緣關系較遠。該蛋白質序列中存在2個EamA保守結構域，分別位于第16～第148和第184～第322氨基酸處，屬于EamA like轉運蛋白家族。在二級結構中，α螺旋占52.14%，β轉角占3.74%，無規則卷曲占25.13%，延伸鏈占18.98%。圖6～10

GHWAT1-35擁有CGTCA-motif（參與MeJA反應的順式調節元件）、MBS（MYB結合位點，干旱誘導響應元件）、GT1-motif（光響應元件）、P-box（赤霉素響應元件）、ARE（厭氧誘導所必需的順式調節元件、O2-site（玉米醇溶蛋白代謝調節的順式作用元件）等順式作用元件。表1

2.3 "GHWAT1-35基因表達

研究表明，檢測基因在開花后0、5、10、15、20、25和30 DPA的纖維組織的表達水平。在開花后不同時期的纖維組織中，該基因均有表達，并且在第15、20 DPA的表達量相對較高，具有顯著差異。GHWAT1-35基因可能在棉花胚珠及纖維發育中發揮重要作用。圖11

2.4 亞細胞定位

研究表明，推測GHWAT1-35蛋白定位于細胞質膜。將構建的GHWAT1-35基因與pC1300-35S-YFP載體重組，并將其瞬時轉化到煙草細胞中，該基因在細胞核中無表達，呈現光滑的連續信號，可能定位于細胞膜。加膜marker共同注射后觀察，加入膜marker并進行質壁分離后，35S∷GhWAT1-35-YFP信號和mCherry的紅色信號一樣質壁分離后內縮進胞內；而未質壁分離時35S∷GhWAT1-35-YFP信號和mCherry信號基本吻合。GhWAT1-35定位于細胞質膜。圖12

3 討 論

3.1

WAT1蛋白是植物生長素運輸的關鍵蛋白，生長素在促進木質素纖維分化過程中起到重要作用［7， 22，23］。研究從系9中克隆到GHWAT1-35基因，全長1 125 bp，編碼374個氨基酸。陸地棉WAT1蛋白與亞洲棉、雷蒙德氏棉中的WAT1蛋白高度同源，其與亞洲棉相似度最高。WAT1蛋白含有EamA保守結構域，含有該結構域的蛋白可能具有內在膜蛋白的生物特性［24］。擬南芥WAT1蛋白參與生長素的運輸，維持植物體內生長素的動態平衡。擬南芥WAT1突變體莖中生長素轉運受阻，生長素含量降低，莖部纖維次生細胞壁厚度降低。而噴施外源生長素后，WAT1突變體可生長素運輸和次生壁厚度恢復到正常水平。香蕉MaWAT1s基因在不同組織器官和亞細胞的表達均存在差異，在不同時期噴施生長素后的MaWATs表達量顯著高于對照組。在棉花和番茄中同時瞬時WAT1同源基因可增強植株對黃萎病的抗性［25］。說明WAT1蛋白在不同物種和組織中可能具有不同的功能［26， 27］，基因結構對基因編碼蛋白的進化和功能具有重要影響［28］。

3.2

棉花纖維發育大致可分為4個相互重疊的時期：起始、伸長、次生壁加厚、脫水成熟［29］。棉纖維的伸長始于開花期，而絨毛纖維的伸長始于開花后5～10 d，生長時間持續約20 d。棉纖維次生壁加厚階段是發育的關鍵時期，始于棉花開花后15 d，在這一階段，細胞主要合成并沉積纖維素［30］。分析發現GHWAT1-35在纖維發育的各個時期均有表達，但其在不同時期表達量具有差異性，在15、20 DAP表達量顯著高于其他時期。

GHWAT1-35基因定位于細胞質膜上，與前人研究擬南芥At1g01070基因的亞細胞定位結果一致［8］。

4 結 論

克隆陸地棉系9 GHWAT1-35基因，GHWAT1-35的CDS區序列全長為1125bp，編碼374個氨基酸，為穩定親水性蛋白。GHWAT1-35的序列上有兩個EamA保守結構域，無信號肽。系9GHWAT1-35基因在開花后15和20 DAP的表達量顯著高于其他時期，其在纖維發育中發揮重要作用。pC1300∷35S-WAT-YFP融合蛋白定位于細胞質膜上。

參考文獻（References）

［1］喻樹迅， 范術麗， 王寒濤， 等. 中國棉花高產育種研究進展［J］. 中國農業科學， 2016， 49（18）： 3465-3476.

YU Shuxun， FAN Shuli， WANG Hantao， et al. Progresses in research on cotton high yield breeding in China［J］. Scientia Agricultura Sinica， 2016， 49（18）： 3465-3476.

［2］ 丁玉， 何安華， 汪麗華. 我國棉花產業供求現狀與趨勢［J］. 重慶社會科學， 2012，（7）： 80-85.

DING Yu， HE Anhua， WANG Lihua. The current situation and trend of the supply and demand of the cotton industry［J］. Chongqing Social Sciences， 2012，（7）： 80-85.

［3］ 郭三堆， 王遠， 孫國清， 等. 中國轉基因棉花研發應用二十年［J］. 中國農業科學， 2015， 48（17）： 3372-3387.

GUO Sandui， WANG Yuan， SUN Guoqing， et al. Twenty years of research and application of transgenic cotton in China［J］. Scientia Agricultura Sinica， 2015， 48（17）： 3372-3387.

［4］ Busov V B， Johannes E， Whetten R W， et al. An auxin-inducible gene from loblolly pine （Pinus taeda L.） is differentially expressed in mature and juvenile-phase shoots and encodes a putative transmembrane protein［J］. Planta， "2004， 218（6）： 916-927.

［5］ Ranocha P， Denancé N， Vanholme R， et al. Walls are thin？1 （WAT1）， an Arabidopsis homolog of Medicago truncatula NODULIN21， is a tonoplast-localized protein required for secondary wall formation in fibers［J］. The Plant Journal， "2010， 63（3）： 469-483.

［6］ Mitsuda N， Iwase A， Yamamoto H， et al. NAC transcription factors， NST1 and NST3， are key regulators of the formation of secondary walls in woody tissues of Arabidopsis［J］. The Plant Cell， 2007， 19（1）： 270-280.

［7］ Ranocha P， Dima O， Nagy R， et al. Arabidopsis WAT1 is a vacuolar auxin transport facilitator required for auxin homoeostasis［J］. Nature Communications， 2013， 4： 2625.

［8］ 彭方林. 擬南芥類結瘤素基因At1g01070的表達模式及功能的初步研究［D］. 新鄉： 河南師范大學， 2015.

PENG Fanglin. Preliminary Study on Expression Pattern and Function of Nodoid Gene At1g01070 in Arabidopsis thaliana［D］.Xinxiang： Henan Normal University， 2015.

［9］ Ju F Y， Liu S D， Zhang S P， et al. Transcriptome analysis and identification of genes associated with fruiting branch internode elongation in upland cotton［J］. BMC Plant Biology， 2019， 19（1）： 415.

［10］ Tang Y， Zhang Z N， Lei Y， et al. Cotton WATs modulate SA biosynthesis and local lignin deposition participating in plant resistance against Verticillium dahliae［J］. Frontiers in Plant Science， 2019， 10： 526.

［11］ 王海霞， 崔大勇. 陸生植物生長素合成的主要途徑及調控［J］. 生物學教學， 2015， 40（9）： 2-5.

WANG Haixia， CUI Dayong. Main ways and regulation of auxin synthesis in terrestrial plants［J］. Biology Teaching， 2015， 40（9）： 2-5.

［12］ 賀新強， 崔克明. 植物細胞次生壁形成的研究進展［J］. 植物學通報， 2002，（5）：513-522.

HE Xinqiang， CUI Keming. Progress in study of secondary wall formation in plants［J］. Chinese Bulletin of Botany， 2002，（5）：513-522.

［13］ Hanika K， Schipper D， Chinnappa S， et al. Impairment of tomato WAT1 enhances resistance to vascular wilt fungi despite severe growth defects［J］. Frontiers in Plant Science， 2021， 12： 721674.

［14］ 劉嘉鵬， 屈蒙蒙， 孫雪麗， 等. 香蕉WAT1基因的鑒定及表達分析［J］. 果樹學報， 2020， 37（5）： 645-658.

LIU Jiapeng， QU Mengmeng， SUN Xueli， et al. Identification and expression analysis of WAT1 genes in banana［J］. Journal of Fruit Science， "2020， 37（5）： 645-658.

［15］ Ladwig F， Stahl M， Ludewig U， et al. Siliques are Red1 from Arabidopsis acts as a bidirectional amino acid transporter that is crucial for the amino acid homeostasis of siliques［J］. Plant Physiology， 2012， 158（4）： 1643-1655.

［16］ Livak K J， Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method［J］. Methods， 2001， 25（4）： 402-408.

［17］ 孔佑賓， 王冰， 張華， 等. 植物蛋白融合HA標簽通用載體構建與應用［J］. 中國農業科技導報， 2017， 19（6）： 131-137.

KONG Youbin， WANG Bing， ZHANG Hua， et al. Construction and amplification of protein fusion HA tag universal expression vector in plant［J］. Journal of Agricultural Science and Technology， 2017， 19（6）： 131-137.

［18］ 張邊江， 陳全戰. 質粒導入不同種農桿菌凍融法的探討［J］. 湖北農業科學， 2007， 46（3）： 329-331.

ZHANG Bianjiang， CHEN Quanzhan. Study on the freeze-thaw method of transforming plasmid DNA into two different Agrobacterium tumefaciens［J］. Hubei Agricultural Sciences， 2007， 46（3）： 329-331.

［19］ 馬春泉， 孫培琳， 李海英. BvM14-GAI基因的克隆及亞細胞定位［J］. 中國農學通報， 2020， 36（16）： 28-33.

MA Chunquan， SUN Peilin， LI Haiying. BvM14-GAI gene： cloning and subcellular localization［J］. Chinese Agricultural Science Bulletin， 2020， 36（16）： 28-33.

［20］ 孫蔓莉， 孟玉玲， 張強， 等. 農桿菌介導的煙草瞬時表達影響因素研究［J］. 西北農業學報， 2015， 24（1）： 161-165.

SUN Manli， MENG Yuling， ZHANG Qiang， et al. Optimization of Agrobacterium-mediated transient assay of gene expression in Nicotiana tobacum［J］. Acta Agriculturae Boreali-Occidentalis Sinica， 2015， 24（1）： 161-165.

［21］ Nelson B K， Cai X， Nebenführ A. A multicolored set of in？vivo organelle markers for co-localization studies in Arabidopsis and other plants［J］. The Plant Journal， "2007， 51（6）： 1126-1136.

［22］ 李濯雪， 陳信波. 植物誘導型啟動子及相關順式作用元件研究進展［J］. 生物技術通報， 2015， 31（10）： 8-15.

LI Zhuoxue， CHEN Xinbo. Research advances on plant inducible promoters and related Cis-acting Elements ［J］. Biotechnology Bulletin， "2015， 31（10）： 8-15.

［23］ Farquharson K L. Probing the role of auxin in wood formation［J］. The Plant Cell， "2008， 20（4）： 822.

［24］ Sousa C， Johansson C， Charon C， et al. Translational and structural requirements of the early nodulin gene enod40， a short-open reading frame-containing RNA， for elicitation of a cell-specific growth response in the alfalfa root cortex［J］. Molecular and Cellular Biology， 2001， 21（1）： 354-366.

［25］ 王晶晶. 棉花類結瘤素基因GhMtN21-31棉花黃萎病抗性中的功能研究［D］.南京：南京農業大學， 2022.

WANG Jingjing. Functional analysis of a nodulin-like gene ghmtn21-31 in cotton resistance against verticillium wilt ［D］. Nanjing： Nanjing Agricultural University， 2022.

［26］ 邢浩然， 劉麗娟， 劉國振. 植物蛋白質的亞細胞定位研究進展［J］. 華北農學報， 2006， 21（S2）： 1-6.

XING Haoran， LIU Lijuan， LIU Guozhen. Advancement of protein subcellular localization in plants［J］. Acta Agriculturae Boreali-Sinica， "2006， 21（S2）： 1-6.

［27］ 張松， 夏學峰， 沈金城， 等. 基于序列保守性和蛋白質相互作用的真核蛋白質亞細胞定位預測［J］. 生物化學與生物物理進展， 2008， 35（5）： 531-535.

ZHANG Song， XIA Xuefeng， SHEN Jincheng， et al. Eukaryotic protein subcellular localization prediction based on sequence conservation and protein-protein interaction［J］. Progress in Biochemistry and Biophysics， 2008， 35（5）： 531-535.

［28］ 謝宏， 李舒文， 董迪， 等. 蒺藜苜蓿MtDWF1基因克隆、亞細胞定位及表達特征分析［J］. 草地學報， 2023， 31（4）： 984-991.

XIE Hong， LI Shuwen， DONG Di， et al. Cloning， subcellular localization and expression pattern of MtDWF1 gene in Medicago truncatula［J］. Acta Agrestia Sinica， 2023， 31（4）： 984-991.

［29］ Mansoor S， Paterson A H. Genomes for jeans： cotton genomics for engineering superior fiber［J］. Trends in Biotechnology， 2012， 30（10）： 521-527.

［30］ 上官小霞， 曹俊峰， 楊琴莉， 等. 棉花纖維發育的分子機理研究進展［J］. 棉花學報， 2022， 34（1）： 33-47.

SHANGGUAN Xiaoxia， CAO Junfeng， YANG Qinli， et al. Research progress on the molecular mechanism of cotton fiber development［J］. Cotton Science， 2022， 34（1）： 33-47.

Cloning and subcellular localization of the GHWAT1-35 gene in Gossypium hirsutum

Abstract：【Objective】 To explore the role of GHWAT1-35 gene in the development of cotton fibers.

【Methods】 "In this study， the fiber at different developmental stages post-anthesis of Gossypium hirsutum variety Xi9 were used as materials.The full-length cDNA sequence of the GHWAT1-35 gene was successfully cloned and subjected to bioinformatics analysis， real-time fluorescence quantitative （qRT-PCR） analysis， and subcellular localization.

【Results】 "The length of the GHWAT1-35 gene was 1125 bp， encoding 374 amino acids， with a relative molecular weight is 40.23 kDa and a theoretical isoelectric point of 8.74.Protein multiple sequence alignment and construction of a systematic evolutionary tree analysis showed that the GHWAT1-35 protein was most closely related to the Gossypium arboreum.The expression of the GHWAT1-35 gene significantly increased at 15 days after flowering， and subcellular localization predicted that the protein was located on the cytoplasmic membrane.The GHWAT1-35 gene was recombined with the pCAMIA1300-35S-YFP vector to construct a fusion expression vector， which was then transformed into Agrobacterium using the freeze-thaw method and after being injected into tobacco.The GHWAT1-35 protein was observed to be located on the cytoplasmic membrane.

【Conclusion】 The GHWAT1-35 gene plays an important role in fiber development， providing a foundation for further exploration of its biological function in Gossypium hirsutum.

Key words：Gossypium hirsutum; WAT1; gene cloning; bioinformatics; subcellular localization