一株群體感應抑制活性鏈霉菌的篩選鑒定及其毒力因子代謝能力分析

摘 要：【目的】挖掘干旱區放線菌天然產物代謝潛力，篩選群體感應抑制活性的產物，研究其對梨火疫病原菌毒力因子代謝能力的影響。

【方法】利用紫色桿菌（Chromobacterium violaceum 026， CV026）群體感應抑制活性篩選模型，對新疆庫木塔格沙漠周邊干旱地區土壤中分離的放線菌進行發酵，采用牛津杯法對其發酵液進行活性篩選；鑒定群體感應抑制活性菌株及驗證其發酵液提取和活性，分析粗提液對歐文氏菌毒力因子代謝影響，并采用液質聯用（liquid chromatography and mass spectrometry， LC-MS）方法檢測菌株代謝產物活性物質，挑選相似結構化合物驗證群體感應抑制活性。

【結果】獲得一株具有明顯群體感應抑制活性菌株K-9，其與Streptomyces rubradiris strain NBRC 14000T相似性達到99.72%。該菌發酵粗提液具有明顯的群體感應抑制活性，可有效降低紫色桿菌CV026產紫色素和梨火疫病原菌的游動能力，并對梨火疫病原菌生物膜、胞外多糖和胞外酶等毒力因子產生具有顯著抑制活性，呈明顯的濃度依賴性；從鏈霉菌K-9粗提液中得到635種化合物，苯基丙烯酸、4-羥基-3甲氧基苯甲酸等5種明顯群體感應抑制化合物。

【結論】干旱區放線菌K-9為Streptomyces rubradiris，其發酵代謝產物具有明顯群體感應抑制活性，能顯著抑制歐文氏菌毒力因子的產生，并發現了多種新型的群體感應抑制活性化合物。

關鍵詞：群體感應抑制劑；干旱地區放線菌；歐文氏菌；毒力因子

中圖分類號：S188 文獻標志碼：A 文章編號：1001-4330（2024）04-1011-10

0 引 言

【研究意義】群體感應抑制劑（Quorum sensing inhibitor， QSI）是一種可以阻斷群體感應通路的化學物質［1］。群體感應參與許多重要的生物學過程，如孢子形成、毒力和生物膜形成等［2］，還可引起動植物發病、食物腐敗等［3］。群體感應抑制劑可通過對群體感應信號分子合成酶抑制，或產生信號分子類似物競爭結合轉錄蛋白受體等，阻斷群體感應通路，降低病原菌抗藥性、毒力因子代謝等，且不會給病原菌帶來明顯的生存壓力［4-5］。【前人研究進展】梨火疫病危害香梨和蘋果［6］；梨火疫病原菌解淀粉歐文氏菌（Erwinia amylovora）是一種革蘭氏陰性菌，能夠引起梨、蘋果及其他薔薇科植物火疫病，使植物葉、花、果實以及枝干快速枯萎、變黑，導致農作物減產［7］。歐文氏菌的毒力因子與生物膜、胞外多糖、胞外酶等代謝產生及其運動性均與群體感應系統相關，其中LuxI/LuxR信號系統主要調控一些蛋白酶、毒力因子的表達，LuxS/LuxO信號系統與植物細胞壁降解酶產生有關，并可以提高環境適應度［8， 9］。

【本研究切入點】

目前，主要以細菌來源為主，如殺黃胞鏈霉菌能夠抑制胡蘿卜軟腐歐文氏菌所引起的軟腐作用［10］；芽胞桿菌 240B1 菌株產生的N-酰基高絲氨酸內酯酶可以降低胡蘿卜軟腐歐文氏菌的致病性［11］。放線菌可以代謝豐富多樣的天然活性產物，現已從多種特殊環境放線菌中分離獲得群體感應抑制劑［12-13］。目前，常用的群體感應抑制劑篩選模型紫色桿菌CV026，當添加群體感應抑制劑時可阻斷或破壞信號分子傳遞通路，從而抑制紫色桿菌CV026紫色素產生，但不抑制其生長，從而形成無紫色色素的模糊透明圈［14］。歐文氏菌具有和紫色桿菌CV026相類似的群體感應信號分子，通過該模型可對歐文氏菌群體感應抑制劑進行有效的篩選。目前，有關歐文氏菌群體感應抑制劑相關研究的報道較少，需研究挖掘干旱區放線菌天然產物代謝潛力，篩選群體感應抑制活性的產物。【擬解決的關鍵問題】從庫木塔格沙漠周邊干旱區土壤中分離出一批放線菌資源，通過紫色桿菌CV026篩選模型篩選，發現一株具有較強群體感應活性的菌株K-9，鑒定菌株，并對其發酵產物進行提取，檢驗粗提物對歐文氏菌群集性和泳動性的影響及其生物膜、胞外多糖、胞外酶產量的抑制作用，為菌株K-9群體感應抑制活性分子分析及應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌 株

紫色桿菌CV026由中國海洋大學海洋生命學院王巖教授惠贈; 梨火疫病原菌解淀粉歐文氏菌（Erwinia amylovora）由新疆微生物資源保藏管理中心提供。

1.1.2 試 劑

二甲基亞砜（DMSO），結晶紫，乙酸乙酯，蒽酮，N-己酰基-L-高絲氨酸內酯標準品（C6-HSL）均購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司； DL-4-羥基苯乳酸水合物，3，4-二羥苯基丙酸均購自上海麥克林生化科技有限公司；苯基丙烯酸、哌啶酸、4-羥基-3，5-二甲氧基苯甲酸購自北京陽光峰行化學研究有限公司； 4-羥基-3甲氧基苯甲酸均購自北京壇墨質檢科技有限公司； 2-吡咯羧酸、甘氨酸三甲胺內鹽均購自河北百靈威超精細材料有限公司。

1.1.3 培養基

高氏一號培養基，貝耐特培養基， ISP2培養基和LB培養基，購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司。

群集檢測培養基（g/L）：蛋白胨 10.0，葡萄糖 5.0，NaCl 5.0，瓊脂5.0，pH自然。

泳動檢測培養基（g/L）：胰蛋白胨10.0，NaCl 3.0，瓊脂5.0，pH自然。

1.1.4 器 材

PLCD離心機（德國希格瑪公司）；SPX-250BF恒溫培養箱（上海福瑪實驗設備有限公司）；R300旋轉蒸發儀（河南鞏義市英裕予華公司）；Biotek Epoch-2型酶標儀（美國伯騰儀器有限公司）；SW-CJ-1F超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司）；BSD-250振蕩培養箱（上海博訊實業有限公司醫療設備廠）；Silica gel 60 F254薄層鋁板（德國默克公司）。

1.2 方 法

1.2.1 QSI活性放線菌的篩選

從新鮮待測放線菌菌株斜面上刮取表面孢子，接種至含有50 mL高氏一號液體培養基的250 mL三角瓶中，30 ℃，150 r/min恒溫振蕩培養7 d。發酵液經雙層濾紙抽濾后，用0.22 μm濾膜過濾，收集濾液，保存于-20 ℃，備用。

取紫色桿菌CV026新鮮菌苔一環接入LB中， 30 ℃ ，150 r/min恒溫振蕩培養16 h。取1 mL CV026菌液和20 μL 100 μmol/mL C6-HSL加入平皿中，加入25 mL LB固體培養基（約50 ℃），迅速混勻，放入外徑8 mm牛津杯，等培養基凝固，備用。

取100 μL發酵濾液加入孔中，并以無菌水為對照，30 ℃正置恒溫培養24 h，觀察平板變色情況，并記錄有模糊透明圈的菌株。

1.2.2 放線菌的形態及分子鑒定

將篩選獲得菌株劃線于高氏一號固體培養基平板上， 30 ℃恒溫培養 4 d，觀察菌落形態大小、顏色等形態。

菌株基因組DNA按照試劑盒（TIANamp Bacteria DNA Kit）說明書提取，PCR采用細菌16S rRNA基因序列通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′），反應條件為 95 ℃預變性 5 min； 94 ℃變性 30 s，54 ℃退火 30 s， 72 ℃延伸 1 min，30個循環； 72 ℃延伸10 min。PCR 擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測，純化后，由北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司測序。

1.2.3 粗提物制備及其功能驗證

菌株接種至高氏一號液體培養基，30 ℃，150 r/min恒溫振蕩培養7 d， 發酵液離心，取上清液，等體積乙酸乙酯萃取3 h，取有機相40 ℃真空旋轉蒸發儀中蒸干，稱重，獲得粗提物。稱取適量粗提物溶解于二甲基亞砜中配制成一定濃度，有機溶劑濾膜過濾，濾液保存于-20 ℃，備用。

粗提液群體感應活性驗證采用薄層色譜（TLC）-生物自顯影法［15］。取5 μL粗提物點在鋁制薄層板上，選用展開劑體系為甲醇-乙酸乙酯-三氯甲烷-石油醚（體積比10∶50∶1∶1），密閉層析至上端0.5 cm，冷風吹干，置于紫外線燈254 nm觀察熒光斑點 ，并拍照。將混有紫色桿菌CV026和C6-HSL的LB瓊脂鋪于TLC板上，凝固后， 30℃恒溫培養36 h，觀察平板變色情況，并拍照。

1.2.4 不同濃度粗提液的抑菌情況

采用96孔板法，分別接種對數中后期的紫色桿菌CV026和梨火疫病原菌，按2%接種量接種于含有不同濃度粗提物的LB液體培養基中，其中粗提物的終濃度分別為0.15、0.3、0.6、1.25、2.5、5、10 mg/mL，并以加入等體積二甲基亞砜作為對照，等體積無菌水為陰性對照。各處理設3個平行，置于酶標儀中30 ℃震蕩培養24 h，每2 h測定OD590值，觀察粗提物的抑菌情況。

1.2.5 粗提液對紫色桿菌產紫色色素的影響

采用96孔板法，分別取 120 μL的LB液體培養基（含 0.1 μmol C6-HSL ）置于孔中，以 2%接種量接種CV026菌液，分別加入適量的粗提液，至0.15、0.3、0.6、1.25、2.5 mg/mL，并以加入等量的二甲基亞砜為對照，置于酶標儀中30 ℃震蕩培養24 h。采用Choo等［16］方法，分別吸取上述發酵液100 μL置于1.5 mL離心管中，10 000 r/min室溫離心5 min，棄上清，加100 μL的DMSO渦旋震蕩混勻，并使紫色桿菌紫色素充分溶解后，離心取上清液，運用酶標儀測定其 OD600值，分析粗提物對紫色桿菌產生紫色素的影響。

1.2.6 粗提液對梨火疫病原菌生物膜的影響

采用96孔板法，分別取120 μL LB液體培養基于孔中，以2%的接種量接入梨火疫病原菌菌液，分別加入一定量的粗提物，至終濃度為0.5、1、2、5 mg/mL， 并以加入等量的二甲基亞砜為對照，置于酶標儀中30 ℃震蕩培養24 h。參考Zhang等［17］棄掉菌液，蒸餾水沖洗3次獲得生物膜，自然風干后用1%結晶紫染色15 min，沖洗干凈并烘干，用95%的乙醇洗脫，測定OD590值。

1.2.7 粗提液對梨火疫病原菌胞外多糖的測定

參考于福浩等［18］方法，吸取100 μL菌液上清液，加入乙酸乙酯萃取2次，40 ℃蒸干，加入100 μL超純水溶解后用 300 μL 2%蒽酮-硫酸溶液進行顯色反應，在沸水中反應 15 min并冷卻，設立空白對照組，重復3次，測定樣品與空白對照組的 OD625 值。

1.2.8 粗提液對梨火疫病原菌蛋白酶產量測定

取100 μL菌液10 000 r/min常溫離心8 min，取上清，加入200 μL 1.3%的脫脂牛奶溶液（w/v，50 mmol/L K2HPO4，pH值 7.0），37℃，靜置2 h，測量OD600。

1.2.9 粗提液對梨火疫病原菌群集性和泳動性的影響

參考劉佳宜等［19］方法，分別配制含有0.6、1.2、2.5、5 mg/mL粗提物的群集瓊脂培養基和泳動瓊脂培養基平板，以添加等體積的二甲基亞砜為對照，點接梨火疫病原菌，30 ℃恒溫正置培養 24 h，觀察菌株的群集和泳動情況。

1.2.10 LC-MS檢測及化合物群體感應抑制活性驗證

將菌株K-9發酵粗提物送至蘇州帕諾米克生物醫藥科技有限公司進行LC-MS檢測，色譜條件：正離子流動相為 0.1%甲酸乙腈（B2）和 0.1%甲酸水（A2），梯度洗脫順序為2% B2，0～1 min；2%～50% B2，1～9 min；50%～98% B2，9～12 min；98% B2，12～13.5 min；98%～2% B2，13.5～14 min；2% B2，14～20 min。負離子流動相為乙腈（B3）和 5 mM 甲酸銨水（A3），梯度洗脫順序為2% B3，0～1 min；2%～50% B3，1～9 min；50%～98% B3，9～12min；98% B3，12～13.5 min；98%～2% B3，13.5～14 min；2% B3，14～17 min。流速：0.25 mL/min，柱溫：40 ℃，進樣量 2 μL［20］。

質譜主要條件：采用電噴霧離子源（ESI），正離子噴霧電壓為 3.50 kV，負離子噴霧電壓為-2.50 kV，毛細管溫度 325 ℃。以分辨率 70 000 進行一級掃描，一級離子掃描范圍100～1 000 m/z，并采用高能碰撞誘導裂解模式（HCD）進行二級裂解，碰撞能量為 30 eV，二級分辨率為 17 500［21］。

選取部分潛在功能化合物，將化合物標準品濃度配制為10 mg/mL，功能驗證。取100 μL標準品溶液加至紫色桿菌CV026模型篩選培養基打孔處，并以無菌水為對照，30 ℃正置恒溫培養24 h，觀察平板變色情況，記錄有模糊透明圈直徑。

1.3 數據處理

將所得菌株16S rRNA 基因序列上傳至 NCBI數據庫進行比對，并調取相關相似性模式菌株序列，利用 MEGA 7軟件進行Neighbor-Joining系統進化樹構建，確定其分類地位。

2 結果與分析

2.1 群體感應抑制活性菌株的篩選及鑒定

研究表明，與對照無菌水相比，菌株K-9發酵液可產生較大的模糊圈，該菌株發酵液無明顯抑制紫色桿菌CV026的生長，但可以明顯抑制紫色桿菌CV026產生紫色色素，且經稀釋4倍仍具有較淡模糊圈，該菌株具有明顯的群體感應抑制效果。

菌株K-9菌落大小為0.2～0.6（cm）×0.2～0.6（cm），其與培養基結合較緊、質地致密，中間凹陷，氣生菌絲呈白色絨狀，孢子呈白色，基內菌絲呈淡黃色。構建系統發育進化樹，菌株K-9隸屬于鏈霉菌屬，其16S rRNA基因序列與Streptomyces rubradiris NBRC 14000T相似性達到99.72%，其16S rRNA基因序列登錄號為OQ568903。圖1，圖2

2.2 粗提液群體感應抑制效果驗證

2.2.1 粗提液TLC活性成分生物顯影

研究表明，100 mg/mL濃度粗提液在254 nm紫外照射下出現三個明顯的暗斑，群體感應活性中心條帶處具有明顯著色條帶，其主要活性基團具有254 nm紫外吸收能力。在TLC薄板上方有多處明顯菌株生長，但無紫色素積累條帶，粗提液中含有較強的群體感應抑制活性。圖3

2.2.2 不同濃度粗提液對菌株生長的影響

研究表明，高濃度的粗提液對紫色桿菌和梨火疫病原菌生長均有明顯的抑制，但低濃度下對不同菌抑制效果存在不同，當粗提液濃度為2.5 mg/mL時紫色桿菌生長即受明顯影響，而梨火疫病原菌在濃度為5 mg/mL仍可微弱生長。表1

2.2.3 對紫色桿菌紫色色素產生的影響

研究表明，各試驗組中粗提液均對紫色桿菌CV026紫色色素產量有著明顯影響，且隨著粗提液濃度的升高，紫色色素含量顯著減少。當粗提物濃度為2.5 mg/mL時，對紫色色素產生具有極其顯著抑制作用；當粗提液濃度為0.3～1.25 mg/mL時，對紫色色素產生具有極顯著抑制作用；即使濃度0.15 mg/mL的粗提液仍能有效降低其紫色素產量，達到12.95%，粗提液具有較強的群體感應抑制劑活性。圖4

2.3 粗提液對梨火疫病原菌群體感應抑制效果

2.3.1 粗提液對生物膜產生的影響

研究表明，各粗提液濃度均對梨火疫病原菌生物膜產生有極其顯著的影響，且隨著粗提液濃度的升高，生物膜抑制作用也逐漸增強，其中濃度為5 mg/mL時對生物膜有抑制作用最為顯著，抑制率達95.92%。圖5

2.3.2 粗提液對胞外多糖產量的影響

研究表明，不同添加濃度對胞外多糖產量有著不同的影響效果，當粗提物濃度為1.2～5.0 mg/mL時抑制效果最顯著，抑制率分別為48.98%、38.62%、26.27%，當濃度低于0.6 mg/mL時抑制效果不顯著。圖6

2.3.3 粗提液對蛋白酶的影響

研究表明，在添加濃度為0.3～5 mg/mL時的粗提液時，菌株蛋白酶抑制率呈濃度依賴性下降，均有極其顯著抑制作用，抑制率分別為61.8%、37.07%、33.94%、26.34%和20.23%。圖7

2.3.4 粗提液對菌株群集和泳動性影響

研究表明，梨火疫病原菌群集在有無粗提液處理下均不明顯，而加入粗提液后對病原菌泳動性具有明顯的抑制，且隨著濃度的增加抑制效果更為明顯。圖8

2.4 粗提液活性物質

研究表明，鑒定出635種代謝化合物，遴選出8個化合物進行功能驗證。在濃度均為10 mg/L時，所選化合物中有5種具有明顯群體感應抑制活性，其中2種化合物也具有較為明顯的抑菌活性。苯基丙烯酸和4-羥基-3甲氧基苯甲酸的抑制活性最高，群體感應面積分別達4.15和3.14 cm2；吡咯-2-羧酸和3，4-二羥苯基丙酸同時具有抑菌活性和群體感應抑制活性；DL-4-羥基苯乳酸群體感應抑制活性最低，抑制面積為0.79 cm2，其余各化合物沒有群體感應抑制活性。圖9，表2

3 討 論

3.1

微生物來源的天然活性產物33 500種，其中放線菌來源的有13 700種，約占41%，而鏈霉菌屬來源的占其80%左右［22］。沙漠極端環境具有極端干旱、強紫外線輻射和晝夜周期極端溫度變化等特征，有著豐富的極端環境微生物，其中，放線菌是重要組成部分之一［23］。庫木塔格沙漠夏季炎熱干燥，最高氣溫達到49.6 ℃，地表溫度最高可達82.5 ℃，而冬季一般氣溫在-10 ℃左右，極端低溫可達-29 ℃，全年偶有雨雪，生態環境極其特殊。該區域放線菌占可培養菌群的絕對優勢，并篩選到一株具有明顯群體感應抑制活性菌株K-9，其16S rRNA基因序列與Streptomyces rubradiris NBRC 14000T相似性達到99.72%。

3.2

群體感應抑制劑來源多種多樣，包括動物、植物以及微生物，其中，多種放線菌被報道代謝產物具有群體感應抑制活性，如灰紅肉鏈霉菌、達松維爾擬諾卡氏菌、微小鏈霉菌、殺黃胞鏈霉菌等［10，24］。Hassan等［25］從土壤樣品中分離出Streptomyces coelicoflavus，其代謝產物1H-吡咯-2-羧酸可以抑制群體感應相關基因的表達；Ooka等［26］從土壤中分離出Streptomyces phaeofaciens其多種代謝產物菜青素A1 、3’-鼠李糖苷A1以及新化合物菜青素E具有群體感應抑制活性；周恒等［24］和Ishaque等［27］分別從中國連云港海區表層海水和印度南部羅美斯瓦倫海岸土壤中分離到Streptomyces parvulus和Streptomyces tendae具有群體感應抑制活性；Velasco-Bucheli等［28］分離出的Streptomyces lavendulae代謝產物青霉素酰化酶可有效水解幾種AHL的酰胺鍵。試驗獲得菌株Streptomyces sp. K-9與已報道的Streptomyces coelicoflavus、Streptomyces tendae 和Streptomyces griseoincarnatus［29］均具有較近的相似性，分別為98.37%、98.72%和98.58%，預示著Streptomyces sp. K-9可能有著三株菌相似的群體感應抑制活性產物或代謝途徑，相關研究有待深入。

3.3

Molina等［30］將信號分子內酯酶基因導入熒光假單胞菌可降低胡蘿卜軟腐病的癥狀；在大腸桿菌中異種表達的aim基因產物也對群體感應信號分子具有較強的水解活性，可減少馬鈴薯軟腐病歐文氏菌產生果膠酶活性從而減輕軟腐病侵害［31］；Kang等［10］發現Streptomyces xanthocidicus KPP01532代謝產物piericidin A和glucopiericidin A可以抑制馬鈴薯軟腐病歐文氏菌（Erwinia carotovora subsp. atroseptica）毒力基因表達。試驗對Streptomyces sp.K-9代謝粗提物進行分析，發現其對紫色桿菌CV026具有較強的群體感應抑制活性，且能明顯抑制梨火疫病原菌泳動特性，對菌株的生物膜、胞外多糖、蛋白酶產生具有顯著抑制活性，并呈明顯的濃度依賴性，在試驗條件下相關最高抑制率分別可達95.92%、48.98%和61.8%。同時，高濃度K-9粗提液具有明顯的抑菌活性，該菌的發酵液可通過群體感應抑制和抑菌活性聯合對有害菌株生長進行抑制。

3.4

5種具有群體感應抑制化合物，除發現了苯基丙烯酸和4-羥基-3甲氧基苯甲酸［32， 33］已報道外，發現吡咯-2-羧酸和3，4-二羥苯基丙酸同時還具有較為明顯的抑菌活性，而3，4-二羥苯基丙酸、DL-4-羥基苯乳酸此前未見報道，顯示鏈霉菌K-9豐富的群體感應抑制活性化合物代謝能力，相關化合物的進一步功能評價及發酵代謝優化，有待深入開展。

4 結 論

從新疆庫木塔格沙漠分離出一株群體感應抑制活性放線菌K-9，經16S rRNA基因序列分子鑒定其于Streptomyces rubradiris NBRC 14000T相似性達到99.72%。發酵粗提液在亞抑菌濃度下能明顯抑制紫色桿菌紫色色素的產生，且能顯著抑制梨火疫病原菌的泳動性，對其生物膜、胞外多糖、蛋白酶等毒力因子代謝的抑制率最高可達95.92%、48.98%和61.8%。從鏈霉菌K-9粗提液鑒定出635個化合物，篩選出5種具有明顯的群體感應抑制活性。

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