香芹酚對惡臭假單胞菌的抑制作用

摘 要：以惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）為對象，通過測定惡臭假單胞菌生長曲線、群集性、泳動性、核酸泄漏情況及產胞外蛋白酶和生物被膜能力等指標，考察不同體積分數香芹酚對惡臭假單胞菌的抑菌效果。結果表明：當香芹酚體積分數≥0.015%時，對惡臭假單胞菌的生長、運動能力、產胞外蛋白酶和生物被膜能力具有極顯著抑制作用（P＜0.01）；當香芹酚體積分數為0.025%時，惡臭假單胞菌所產生物被膜含量比空白組極顯著減少86.35%（P＜0.01）。香芹酚可通過抑制生長、產生物被膜能力及運動能力破環細胞膜通透性，導致大量細胞內容物泄漏，從而對惡臭假單胞菌產生抑菌作用。

關鍵詞：惡臭假單胞菌；香芹酚；鮮肉保鮮；泳動性；群集性

Inhibitory Effect of Carvacrol on Pseudomonas putina

Li Jiawen1， Wu Xuan1， PAN Yajie1， Xiao Longquan1，2， Liu Dayu1， Wang Xinhui1， Xu Gang2， Zhou Chuang1，*

（1. School of Food and Biological Engineering， Chengdu University， Chengdu 610106， China;

2. Yibin E-Tiange Foods Co. Ltd.， Yibin 644100， China）

Abstract： The inhibitory effect of different volume fractions （V/V） of carvacrol on Pseudomonas putida was investigated through the determination of the growth curve， swarming motility， swimming motility， nucleic acid leakage， the ability to produce extracellular protease and biofilm of P. putida. The results showed that carvacrol at a volume fraction equal to or greater than 0.015% had a significant inhibitory effect on the growth， motility， extracellular protease production and biofilm formation of P. putida （P lt; 0.01）. When the volume fraction of carvacrol was 0.025%， the biofilm production of P. putida was reduced by 86.35% compared with the blank group （P lt; 0.01）. Carvacrol can exert an inhibitory effect on P. putida by inhibiting its growth， biofilm-producing ability and motility， and destroying the permeability of the cell membrane， and thereby resulting in the leakage of a large amount of cellular contents.

Keywords： Pseudomonas putida; carvacrol; meat perseveration; swimming mobility; swarming mobility

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20240421-090

中圖分類號：TS251.1 " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " 文獻標志碼：A 文章編號：1001-8123（2024）06-0071-05

引文格式：

李佳玟， 吳軒， 潘雅潔， 等. 香芹酚對惡臭假單胞菌的抑制作用[J]. 肉類研究， 2024， 38（6）： 71-75. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20240421-090. " "http：//www.rlyj.net.cn

LI Jiawen， WU Xuan， PAN Yajie， et al. Inhibitory effect of carvacrol on Pseudomonas putina[J]. Meat Research， 2024， 38（6）： 71-75. （in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20240421-090. " "http：//www.rlyj.net.cn

假單胞菌是導致肉類腐敗變質的主要微生物之一，多種假單胞菌作為肉中的優勢腐敗菌常被檢出，如惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）、莓實假單胞菌、熒光假單胞菌等[1]，假單胞菌可致高蛋白質食品腐敗，如肉及肉制品、乳制品、水產品等，從而影響產品質量，縮短貨架期，造成嚴重經濟損失甚至導致人群食物中毒[2-4]，有效抑制假單胞菌是鮮肉保鮮的關鍵手段之一。惡臭假單胞菌是一種條件致病菌，廣泛分布于泥土和水體環境中，有研究表明，在70余批常規送檢的冷凍肉類中均檢出惡臭假單胞菌[5]。

香芹酚是一種天然的酚類化合物，是百里香和牛至精油的主要成分[6]，香芹酚應用較為廣泛，常作為食品防腐劑或香料[7]。香芹酚作為一種天然、安全防腐劑，已被美國食品藥品監督管理局列為公認安全的食品成分[8]。研究發現，香芹酚具有抗菌活性[9-10]，對單核細胞增生李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和沙門氏菌等食品中常見的食源性致病菌均具有抑制作用[11-12]。與其他抑菌劑相比，香芹酚具有無毒、安全性高、抗菌性強等

優點[13-14]。Xiao Longquan等[15]以香芹酚、殼聚糖等為原料制備的抗菌膜可將羊肉的保鮮期延長15 d以上。

目前，對于惡臭假單胞菌的研究限于藥敏分析、生物學功能研究等，用天然精油抑制惡臭假單胞菌的研究較少，因此，研究香芹酚對惡臭假單胞菌抑制作用十分有意義。本研究以惡臭假單胞菌為研究對象，對比不同體積分數的香芹酚對惡臭假單胞菌的抑菌效果，并探究香芹酚的抑菌機制，為香芹酚在肉及肉制品、乳制品、水產品中的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

惡臭假單胞菌（ATCC 49128） 上海魯微科技有限

公司；香芹酚（純度99%） 上海麥克林生化科技有限公司；Luria-Bertani（LB）營養瓊脂、蛋白胨、胰蛋白胨、瓊脂粉（生物試劑） 北京奧博星生物技術有限責任公司；溶菌肉湯（LB肉湯）、乙醇、結晶紫、脫脂奶粉、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）

（分析純） 天津市恒興化學試劑制造有限公司。

1.2 儀器與設備

UV-2700i紫外-可見分光光度計 島津儀器蘇州有限

公司；LRH-150生化培養箱 上海一恒科學儀器有限公司；

THZ-82水浴恒溫振蕩器 常州澳華儀器有限公司；

LDZX-75L立式高壓蒸汽滅菌鍋 上海申安醫療器械

公司；TGL-22S高速冷凍離心機 四川蜀科儀器有限

公司；1550酶標儀 上海賽默飛世爾儀器有限公司；

SW-CJ-2FD超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司。

1.3 方法

1.3.1 生長曲線的測定

微生物生長曲線是描述微生物生長狀況的基本指標[16-17]。將惡臭假單胞菌接種至LB肉湯，放置于水浴恒溫振蕩器中，溫度調至30 ℃，過夜培養活化后取出，將OD600 nm調至約為1.00，置于錐形瓶中，用LB肉湯以1∶100比例稀釋，加入香芹酚，使其最終體積分數分別為0.005%、0.010%、0.015%、0.020%和0.025%，各梯度均用體積分數0.1% DMSO助溶，同時做空白對照和DMSO對照。將樣品置于30 ℃水浴恒溫振蕩器中振蕩培養，分別于0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、26 h時取樣，用紫外-可見分光光度計測定OD600 nm。

1.3.2 泳動性和群集性測定

參照丁婷[18]的方法并稍作修改。培養基配制好后，按1.3.1節方法配制含有不同體積分數香芹酚的菌懸液并設置空白對照和DMSO對照。搖勻后，各接種3 μL樣品溶液至泳動性和群集性平板中央。將平板于30 ℃恒溫培養箱中培養24 h后，測量菌株蔓延分散距離。

1.3.3 嗜鐵素產生情況測定

按1.3.1節方法配制含有不同體積分數香芹酚的菌懸液并設置空白對照和DMSO對照。嗜鐵素平板按丁婷[18]的方法配制。培養基凝固后，每孔加入100 μL稀釋的惡臭假單胞菌樣液。將平板于30 ℃恒溫培養箱中培養24 h后，測量嗜鐵素平板中黃色暈圈的直徑[19]。

1.3.4 胞外蛋白酶的測定

參照Vijayaraghavan等[20]的方法并稍作修改。LB營養瓊脂滅菌冷卻至約50 ℃后，將LB營養瓊脂與單獨滅菌的脫脂奶粉混勻，使脫脂奶粉的最終質量分數為1.0%，倒平板，并用牛津杯打孔，備用。將惡臭假單胞菌過夜培養活化，并調節OD600 nm約為1.00，按1∶1 000的比例加入到LB肉湯中，按1.3.1節方法配制含有不同體積分數香芹酚的菌懸液并設置空白對照和DMSO對照。搖勻后，分別向打孔平板中加入100 μL樣液，將平板置于30 ℃培養箱培養24 h后，使用游標卡尺測量3 組脫脂奶粉瓊脂平板中透明圈的直徑。

1.3.5 生物被膜形成能力的測定

參考Ma Maomao[21]、朱耀磊[22]等的方法并進行修改，將惡臭假單胞菌過夜活化至OD600 nm約為1.00，用LB肉湯以1∶100的比例稀釋，按1.3.1節方法配制含有不同體積分數香芹酚的菌懸液，同時做空白對照和DMSO對照。取200 μL上述菌液于96 孔板中，將96 孔板置于30 ℃培養箱下靜置培養24 h，吸去孔中的菌液，殘留生物被膜用200 μL去離子水洗滌3 次。向每個生物被膜孔添加200 μL 0.1 g/100 mL結晶紫溶液，28 ℃染色20 min。染色后的生物被膜用200 μL去離子水沖洗3 次，吸干，最后加入等體積95%乙醇洗脫5 min后，使用酶標儀測定OD600 nm，以此表征惡臭假單胞菌的生物被膜形成能力。

1.3.6 核酸泄漏量的測定

參考Ashrafudoulla等[23]的方法并稍作修改。將惡臭假單胞菌接種至肉湯培養基，于28 ℃水浴振蕩器中活化24 h，吸取菌懸液于4 ℃、8 000 r/min離心5 min后收集沉淀，并用磷酸鹽緩沖溶液洗滌、重懸并調整菌懸液至OD600 nm約為1.00，按1.3.1節方法配制含有不同體積分數香芹酚的菌懸液并設置空白對照和DMSO對照。將樣品置于28 ℃水浴振蕩器中振蕩培養活化，分別于15、30、45、60 min取菌懸液，4 ℃、8 000 r/min離心5 min[24]，使用移液器吸取上清液，并用紫外-可見分光光度計測定OD260 nm。

1.4 數據處理

每組實驗做3 次以上平行重復，采用IBM SPSS Statistics 26軟件進行數據分析，采用Duncan’s多重比較對數據進行差異顯著性分析，P＜0.01表示差異極顯著；采用Origin 2021軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 香芹酚對惡臭假單胞菌生長曲線的影響

由圖1可知，空白對照組和DMSO對照組惡臭假單胞菌生長曲線十分相似，在0～6 h生長迅速。采用香芹酚處理后，惡臭假單胞菌的生長速率變緩，且隨著香芹酚含量升高，其生長受到的抑制愈加明顯。與2 個對照組相比，香芹酚體積分數為0.005%時，惡臭假單胞菌的生長受到輕微抑制，香芹酚體積分數為0.010%時，惡臭假單胞菌生長受到明顯抑制。當香芹酚體積分數≥0.015%時，其延遲期延長至16 h以上，且在16 h以后，其生長也十分緩慢。結果表明，當香芹酚在體積分數≥0.015%時對惡臭假單胞菌的生長具有良好的抑制作用。

2.2 香芹酚對惡臭假單胞菌泳動性和群集性的影響

由圖2A可知，空白對照組和DMSO對照組的泳動性菌落較大，表明惡臭假單胞菌具有較強的運動能力。隨香芹酚含量升高，惡臭假單胞菌的移動距離呈現明顯減小趨勢，當香芹酚體積分數≥0.010%時，對惡臭假單胞菌的泳動性有明顯的抑制作用。由圖2B可知，隨香芹酚含量升高，惡臭假單胞菌的移動距離呈現明顯減小趨勢，當香芹酚體積分數≥0.015%時，對惡臭假單胞菌的群集性有明顯的抑制作用。結果表明，香芹酚可明顯削弱惡臭假單胞菌的運動能力，且體積分數越大，效果越好。Wang Yaying等[25]研究香芹酚對熒光假單胞菌泳動性和群集性的影響發現，香芹酚對熒光假單胞菌的運動有很強的抑制作用，與本研究結果較為一致。

2.3 香芹酚對惡臭假單胞菌產嗜鐵素和胞外蛋白酶的影響

由于嗜鐵素平板由鉻天青、十六烷基三甲基溴化銨和鐵離子組成，故呈藍色（圖3A）。當細菌產生嗜鐵素時，嗜鐵素平板會出現淡黃色暈圈，這是由于嗜鐵素對Fe3＋選擇性黏著，對Fe3＋具有一定的親和性[26]。由圖3A可知，空白對照組、DMSO對照組、0.005%和0.010%組均出現黃色暈圈，且呈逐漸減小趨勢，0.015%、0.020%、0.025%組均未見黃色暈圈，表明香芹酚能夠抑制惡臭假單胞菌產嗜鐵素的能力，且香芹酚含量越高，抑制效果越明顯。

由圖3B可知，平板上的空白對照組和DMSO對照組出現較大的白色透明圈，說明惡臭假單胞菌分泌的蛋白酶分解了平板中的蛋白質，導致白色透明圈的產生。而香芹酚處理后，白色透明圈直徑減小，且香芹酚含量越高，白色透明圈直徑越小，表明香芹酚能夠抑制惡臭假單胞菌胞外蛋白酶的產生。由圖3C可知，香芹酚體積分數為0.025%時，透明圈直徑比空白對照組減小31.15%。0.015%、0.020%、0.025%組的透明圈直徑極顯著小于空白對照組（P＜0.01），說明香芹酚能夠抑制惡臭假單胞菌胞外蛋白酶的產生，且香芹酚含量越高，抑制效果越好。由此可知，香芹酚能夠抑制惡臭假單胞菌胞外蛋白酶產生，可有效阻止其對蛋白質的利用，減緩食品腐敗變質，在肉及肉制品等高蛋白食品保鮮中具有巨大的應用潛力。

2.4 香芹酚對惡臭假單胞菌產生物被膜的影響

細菌生物被膜有復雜的三維結構，是細菌黏著在接觸表面后分泌的多糖類物質、脂質蛋白、脫氧核糖核酸等組成的復合物，其包裹方式可有效保護內部細菌，增強細菌對環境的抵抗力，有利于其在惡劣環境中生

存[27-30]。由圖4可知，香芹酚對惡臭假單胞菌生物被膜的產生呈現濃度依賴性抑制作用。香芹酚含量越高，生物被膜抑制作用越明顯。與空白對照組相比，當用0.015%～0.025%香芹酚處理惡臭假單胞菌后，其產生的生物被膜減少50.9%～86.35%。0.025%組惡臭假單胞菌生物被膜產量極顯著低于空白對照組（P＜0.01），說明香芹酚能夠抑制惡臭假單胞菌產生物被膜，且香芹酚含量越高，抑制效果越好。Addo等[31]研究發現，香芹酚和桉樹腦可通過干擾細菌的運動能力分別抑制金黃色葡萄球菌和陰溝桿菌的生物被膜形成；劉楠[32]也發現，香芹酚對熒光假單胞菌的生物被膜有破壞作用。與本研究結果一致。綜上，香芹酚可以有效抑制惡臭假單胞菌生物被膜的產生能力。

2.5 香芹酚對惡臭假單胞菌核酸泄漏的影響

細胞膜是具有彈性的半透性膜，可選擇性地交換物質，菌液中大分子含量變化是反映細胞膜滲透性變化的重要指標，如果大分子含量變化顯著，說明細胞膜可能受到了嚴重損壞[33]。由圖5可知，隨著香芹酚含量增加，核酸泄漏量增多；隨著處理時間的延長，惡臭假單胞菌核酸泄漏量增多。經香芹酚處理15 min后，0.005%～0.025%組核酸泄漏量比空白對照組增加41.32%～77.84%；處理45 min后，0.005%～0.025%組核酸泄漏量比空白對照組增加60.43%～82.97%。香芹酚處理15、30、45、60 min，0.005%～0.025%組核酸泄漏量均極顯著高于空白對照組（P＜0.01）。Zhang Junshun等[34]

研究表明，香芹酚會破壞細菌細胞膜，改變其細胞膜滲透性，導致核酸泄漏，最終導致細胞死亡。本研究結果中，核酸泄漏物變化趨勢與Ma Maomao等[21]在研究香芹酚和獨活素對大腸桿菌O157：H7和鼠傷寒沙門氏菌的協同作用中的變化趨勢相似，Abdelhamid等[35]研究中也發現香芹酚能夠抑制沙門氏菌生長，導致細菌細胞內核酸泄漏，且具有濃度依賴性，與本研究結果相似。

3 結 論

本研究采用不同體積分數的香芹酚處理惡臭假單胞菌，觀察香芹酚對惡臭假單胞菌的抑菌效果。結果表明，當香芹酚體積分數≥0.015%時，對惡臭假單胞菌的生長、運動能力、產胞外蛋白酶和生物被膜能力具有顯著的抑制作用。此外，核酸泄漏結果表明，香芹酚能夠引起胞內物質泄漏，破壞惡臭假單胞菌的細胞完整性。綜上所述，香芹酚對惡臭假單胞菌具有良好的抑制作用，在高蛋白食品如肉及肉制品保鮮中具有巨大的應用潛力。

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收稿日期：2024-04-21

基金項目：四川省科技計劃項目（2023YFN00140）；宜賓市科技計劃項目（2022NY021）；

四川省肉羊創新團隊建設項目（SCCXTD-2024-14）；達州市科技計劃項目（22DWHZ0005）

第一作者簡介：李佳玟（1999—）（ORCID： 0009-0001-4717-0352），女，碩士研究生，研究方向為食品與生物技術。

E-mail： 1342778969@qq.com

*通信作者簡介：周闖（1968—）（ORCID： 0000-0001-9639-1111），男，副教授，碩士，研究方向為食品與生物技術。

E-mail： zhouchuang@cdu.edu.cn