離子色譜法測定肝素鈉總己糖胺中半乳糖胺含量的方法研究

2024-01-01 00:00:00米文強任風芝劉建芬張向彬王彩肖李樂樂

品牌與標準化 2024年4期

【摘要】目的：建立肝素鈉總己糖胺中半乳糖胺含量的檢測方法。方法：將標準品及供試品在100℃下水解6 h，使用戴安ICS5000型離子色譜儀，以14 mm氫氧化鈉溶液為淋洗液在0.5 mL/min流速下，經戴安氨基酸捕集柱（50 mm×4 mm）、PA20型色譜柱（150 mm×3 mm）分離，進入配備Au工作電極、pH-Ag-AgCl參比電極的安培檢測器中進行檢測。結果：經不低于6 h水解，供試品充分水解，空白溶液無干擾峰，水解標準溶液色譜圖中，理論板數、分離度、拖尾因子等均符合USP〈831〉的規定，半乳糖胺的檢測限和定量限分別達到2 ng/mL、4 ng/mL，半乳糖胺在4～160 ng/mL濃度范圍內線性良好，平均加樣回收率達到101.2%，RSD為2.64%，水解標準溶液和水解供試品溶液放置24 h，檢測結果的RSD為1.53%。結論：方法專屬性、系統適用性、線性、靈敏度、回收率良好，適用于肝素鈉總己糖胺中半乳糖胺含量的檢測。

【關鍵詞】肝素鈉；離子色譜；半乳糖胺

【DOI編碼】10.3969/j.issn.1674-4977.2024.04.005

Determination of Galactosamine in Total Hexosamine of Heparin Sodium by Ion Chromatography

MI Wenqiang1，3， REN Fengzhi1，3， LIU Jianfen2，3*， ZHANG Xiangbin2，3， WANG Caixiao2，3， LI Lele2，3

（1.North China Pharmaceutical Group Corporation New Drug Research and Development Co.， Ltd.， Shijiazhuang 052165， China； 2. North China Pharmaceutical Huakun Hebei Biotechnology Co.， Ltd.， Shijiazhuang 050000， China； 3.Hebei Multi-component Biochemical Drug Preparation Technology Innovation Center， Shijiazhuang 050000， China）

Abstract： Objective： To establish a method for the determination of galactosamine content in heparin sodium total hexosamine. Methods： The standard and test samples are hydrolyzed at 100°C for 6 hours， and then analyzed by Dionex ICS5000 ion chromatograph， using 14 mm sodium hydroxide solution as eluent at a flow rate of 0.5 mL/min， passing through Dionex amino acid trap column （50 mm×4 mm） and PA20 column （150 mm×3 mm）， and entering the amperometric detector equipped with Au working electrode and pH-Ag-AgCl reference electrode. Results：After hydrolysis for no less than 6 hours， the test samples are fully hydrolyzed， and there is no interference peak in the blank solution. In the chromatogram of the hydrolyzed standard solution， the theoretical plate number， separation degree， tailing factor， etc. all met the requirements of USP<831>. The detection limit and quantitation limit of galactosamine were 2 ng/mL and 4 ng/mL， respectively. Galactosamine had good linearity in the concentration range of 4～160 ng/mL， the average recovery rate was 101.2%， and the RSD was 2.64%. The RSD of the test results of the hydrolyzed standard solution and the hydrolyzed test sample solution placed for 24 hours is 1.53%. Conclusion：The method has good specificity， system suitability， linearity， sensitivity， and recovery rate， and is suitable for the determination of galactosamine content in heparin sodium total hexosamine.

Keywords： heparin； HPIC； galactosamine

肝素在臨床上廣泛用于腎臟透析、心臟外科手術、預防或治療血栓栓塞性疾病，以及血液透析和體外血液循環過程中的抗凝血[1-2]。肝素是一種提取自動物組織的抗凝血藥物，屬于糖胺聚糖家族的一員，由不同硫酸化多糖鏈的異質混合物組成，主要的工藝相關雜質如硫酸皮膚素和硫酸軟骨素均含有半乳糖胺的糖胺聚糖[3]。研究表明，半乳糖胺可通過消耗肝細胞中的磷酸尿嘧啶，造成蛋白合成紊亂，最終導致肝細胞損傷，引發肝纖維化、急性肝損傷，甚至肝衰竭[4-7]。美國藥典規定了半乳糖胺的限度，而中國藥典對其尚無要求。

1材料與方法

1.1材料

儀器設備：戴安ICS 5000離子色譜儀，脈沖安培檢測器，XA105型電子分析天平（瑞士Mettler公司），RephiLe G超純水機（上海樂楓公司）。

試劑：鹽酸半乳糖胺對照品（含量0.998 mg/mg，批號：G1L378，USP）；鹽酸葡萄糖胺對照品（含量0.997 mg/mg，批號：R104K1，USP）；肝素鈉原料藥（批號：220701，自產）；氫氧化鈉溶液（質量分數50%，批號：SS254-1，美國Thermo Fisher公司）；鹽酸（批號：20220427，北京化工廠）；超純水（超純水機制備）。

1.2方法

1.2.1檢測方法

1）色譜條件。色譜柱：AminoTrap氨基酸捕集柱（50 mm×4 mm，10μm），CarboPac PA20分析柱（50 mm×3 mm，6μm）；柱溫：30℃；淋洗液：氫氧化鈉溶液（14 mmol/L）；Au工作電極；pH-Ag-AgCl參比電極；流速：0.5 mL/min；進樣體積10μL；標準糖四電位波形，見表1。

2）溶液配制。水解標準溶液：含半乳糖胺對照品、葡萄糖胺對照品分別為8μg/mL、0.8 mg/mL的鹽酸（5 mol/L）溶液，100℃下保溫6 h，用超純水稀釋100倍即得；供試品溶液：2.4 mg/mL肝素鈉鹽酸（5 mol/L）溶液，100℃下保溫6 h，用超純水稀釋100倍即得。

1.2.2研究方法

1）水解時長：從水解反應0 h起至水解反應11 h止，每隔1 h取水解標準溶液、水解供試品溶液采集色譜圖，記錄半乳糖胺、葡萄糖胺峰面積，比較檢測結果隨時間的變化。

2）專屬性：分別取水、鹽酸（5 mol/L）、半乳糖胺對照品、葡萄糖胺對照品、供試品，按水解供試品溶液配制方法配制溶液。確定各色譜峰位置。

3）系統適用性：重復6次采集水解標準溶液，考察半乳糖胺與葡萄糖胺的峰分離度、拖尾因子及以葡萄糖胺計算的理論塔板數。

4）靈敏度：規定分別以3倍信噪比（S/N=3）和10倍信噪比（S/N=10）對應的質量濃度作為半乳糖胺的檢出限、定量限。

5）線性與范圍：配制系列水解標準溶液，使半乳糖胺濃度為4 ng/mL、8 ng/mL、16 ng/mL、64 ng/mL、120 ng/mL、160 ng/ mL，對應葡萄糖胺濃度為0.39 ng/mL、0.78 ng/mL、1.56 ng/ mL、6.24 ng/mL、11.7 ng/mL、15.6 ng/mL，分別擬合半乳糖胺-濃度、葡萄糖胺峰面積-濃度方程，計算線性回歸系數。

6）精密度：平行配制水解標準溶液、水解供試品溶液各6份，檢測半乳糖胺限度；變更實驗人員，重復測定，計算半乳糖胺限度的RSD。

7）準確度：向供試品中加入80%、100%、120%的半乳糖胺，每比例平行配制3份，測定每份供試品中氨基己糖的半乳糖胺占比，計算回收率及RSD。

8）溶液穩定性：配制水解標準溶液和水解供試品溶液，分別在0、4、8、12、24 h進行測定，計算RSD。

9）供試品測定：取肝素鈉供試品3批（220701，220702，220703）進行檢測。