HPLC法同時測定兩種復方磺胺類藥物中主要組分含量的方法學驗證試驗

摘要：為驗證在優化樣品溶劑與優化色譜條件下，采用高效液相色譜儀同時測定兩種不同復方磺胺類藥物中主要組分含量的可行性，文章通過對照品含量對比試驗、線性范圍試驗、重復性試驗、準確度試驗、耐用性試驗、專屬性試驗、穩定性試驗和添加回收率試驗等，采用高效液相色譜法同時測定復方磺胺間甲氧嘧啶鈉粉和復方磺胺氯噠嗪鈉粉兩種藥物中的磺胺間甲氧嘧啶鈉、磺胺氯噠嗪鈉和甲氧卞啶3種化合物含量，對本試驗采用的高效液相色譜法進行方法學驗證。試驗結果表明，兩種復方磺胺類藥物中的磺胺間甲氧嘧啶鈉、磺胺氯噠嗪鈉和甲氧卞啶3種化合物能被完全分離，峰型良好；線性范圍試驗表明，上述3種化合物的峰面積與其濃度線性關系較好，濃度線性范圍較廣，3種化合物濃度較好的范圍分別為：磺胺間甲氧嘧啶鈉6～205 μg·mL-1、磺胺氯噠嗪鈉6～202 μg·mL-1、甲氧卞啶1～39 μg·mL-1，判定系數均為R2=0.999 9。方法學驗證結果表明，本試驗采用的高效液相色譜法重復性好、準確度高、耐用性強，具有良好的專屬性和穩定性。在添加回收試驗中，上述3種化合物的添加回收率均大于98%，相對標準偏差值（RSD）為0.06%～0.75%，均滿足方法學要求。

關鍵詞：高效液相色譜法；磺胺間甲氧嘧啶鈉；磺胺氯噠嗪鈉；甲氧卞啶

磺胺類藥物是人工合成的抗菌藥，具有抗菌譜廣、性質穩定等優點。抗菌增效劑甲氧芐啶（TMP）自1969年被首次發現后，與磺胺類藥物聯合使用可顯著增強藥物的抗菌作用，擴大疾病治療范圍[1-3]。因此，即使后來有大量抗生素相繼問世，磺胺類藥物仍廣泛應用于獸醫臨床學，用于治療和預防動物疾病。

目前，《中國獸藥典》2020年版一部[4]和《獸藥質量標準》2017年版化學藥品卷[5]規定的磺胺類獸藥檢測方法各不相同，有永停滴定法、紫外可見分光光度計法和高效液相色譜法（HPLC）。與高效液相色譜法相比，永停滴定法的操作較為繁瑣，易引起測量誤差，對操作者的經驗要求更高；采用紫外可見分光光度計法檢測時，由于磺胺類藥物結構都有共軛雙鍵，在做鑒別和組分含量測定時存在專屬性弱等缺點，而且檢測機構在檢測不同種類的磺胺類獸藥時，平行采用不同檢測方法存在費時、費力、檢測效率低的問題。因此，若建立一個可同時檢測多種磺胺類獸藥的色譜條件可有效解決這些問題。本研究通過參考其他學者的相關研究[6-10]，優化樣品溶劑，建立利用高效液相色譜法能同時檢測復方磺胺氯噠嗪鈉粉和復方磺胺間甲氧嘧啶鈉粉的色譜條件，保證檢測結果準確可靠，有效提高檢測效率，為磺胺類獸藥檢測方法的改進提供參考。

1" 材料和方法

1.1" "試驗材料

1.1.1 儀器 WatersE2695 高效液相色譜系統配置2998 PDA檢測器；Agilent1100型高效液相色譜儀配置紫外檢測器；ME155DU型電子天平（梅特勒-托利多（上海）有限公司）；超純水儀（型號7146，Thermo）；BT-50超聲波分散器（丹東百特儀器有限公司）；SHZ-D（Ⅲ）循環式真空泵（鞏義市予華儀器有限責任公司）。

1.1.2 藥品試劑 磺胺間甲氧嘧啶對照品（含量99.5%，批號C0031610，中國獸醫藥品監察所）；甲氧芐啶對照品（含量99.8%，批號H0161704，中國獸醫藥品監察所）；磺胺氯噠嗪鈉對照品（含量99.9%，批號FS009103，PANPHY）；復方磺胺間甲氧嘧啶鈉粉（規格為100 g，其中含磺胺間甲氧嘧啶鈉10 g、甲氧卞啶2 g，批號E086442，禮藍（上海）動物保健有限公司）；磺胺氯噠嗪鈉粉（規格為1 000 g，其中含磺胺氯噠嗪鈉100 g、甲氧卞啶20 g，批號21111001，開封嘉駿生物科技有限公司）；超純水（實驗室自制，符合GB/T 6682-2008規定的一級水要求）；磷酸（優級純，天津市大茂化學試劑廠）。

1.2" "試驗設計

在以往檢測磺胺類藥物的色譜條件基礎上[6-10]，調試色譜條件，選定樣品溶劑，在優化的色譜條件和優選溶劑下，采用高效液相色譜法同時測定復方磺胺間甲氧嘧啶鈉粉和復方磺胺氯噠嗪鈉粉中的主要組分含量，上述檢測方法簡稱新方法。通過設置對照品含量對比試驗、線性范圍試驗、重復性試驗、準確度試驗、耐用性試驗、專屬性試驗、穩定性試驗和添加回收率試驗等，對新方法進行方法學驗證。

1.2.1 色譜條件 通過調式，試驗確定新方法色譜條件為：Agilent 5 HC-C18（2） 250×4.6 mm色譜柱，柱溫35 ℃，進樣量20 μL，波長240 nm，

流動相為0.1%磷酸溶液-乙腈（80∶20），流速為1.0 mL·min-1。按外標法以峰面積計算含量。結合《中國獸藥典》2020年版一部規定，理論塔半數按甲氧卞啶峰計算應不低于5 000，分離度應大于1.5。

1.2.2 對照品溶液配制 試驗分別精準稱定磺胺間甲氧嘧啶鈉對照品0.051 38 g和磺胺氯噠嗪鈉對照品0.050 52 g，置于2個50 mL容量瓶中，精密稱定甲氧卞啶對照品0.019 96 g于100 mL容量瓶中，分別在裝有上述3種化合物的容量瓶中加入一定量的50%甲醇溶液，使用超聲波使其溶解，再用50%甲醇溶液定容至刻度，制得磺胺間甲氧嘧啶鈉、磺胺氯噠嗪鈉和甲氧卞啶對照品儲備液。試驗分別精準量取上述對照品儲備液5 mL放入同一50 mL容量瓶中，用流動相稀釋至刻度，即得含磺胺間甲氧嘧啶鈉102.76 μg·mL-1、磺胺氯噠嗪鈉101.04 μg·mL-1和甲氧卞啶19.96"μg·mL-1的混合對照品溶液，同法分別制得含磺胺間甲氧嘧啶鈉102.76 μg·mL-1的對照品溶液，含磺胺氯噠嗪鈉101.04 μg·mL-1的對照品溶液和含甲氧卞啶19.96 μg·mL-1的對照品溶液。

1.2.3 供試品溶液配制 試驗分別精準稱定復方磺胺間甲氧嘧啶鈉粉1.027 1 g和復方磺胺氯噠嗪鈉粉1.021 2 g置于2個100 mL容量瓶中，分別用50%甲醇溶液溶解并定容，得到復方磺胺間甲氧嘧啶鈉粉與復方磺胺氯噠嗪鈉粉供試品原液。然后分別精準量取上述供試品原液5 mL，置于2個50 mL容量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，作為2種供試品溶液。上述2種供試品溶液經0.22 μm微孔濾膜濾過，續濾液用于高效液相色譜分析。同時稱取質量為0.25 g不含磺胺類成分、以淀粉為主的空白輔料樣品，處理方法同上，制得空白輔料溶液。

1.3" "方法學驗證試驗

在新方法條件下，筆者分別進行對照品含量對比試驗、線性范圍試驗、重復性試驗、準確度試驗、耐用性試驗、專屬性試驗、穩定性試驗和添加回收率試驗等，對本研究方法進行方法學驗證。

1.3.1 對照品含量對比試驗 試驗分別精準量取1.2.2項下的磺胺間甲氧嘧啶鈉、磺胺氯噠嗪鈉、甲氧卞啶對照品溶液和混合對照品溶液各20 μL，注入高效液相色譜儀。在新方法條件下，測定對照品溶液化合物的峰面積及保留時間，確定新方法是否可以同時對上述幾種化合物進行檢測。

1.3.2 線性范圍試驗 試驗分別精準量取1.2.2項下的磺胺間甲氧嘧啶鈉、磺胺氯噠嗪鈉和甲氧卞啶對照品儲備液20 mL，分別置于3個100 mL容量瓶中，加流動相稀釋至刻度，共得到3份第一次稀釋的線性對照品溶液。從這3份第一次稀釋的線性對照品溶液中分別吸取10 mL置于3個20 mL容量瓶中，用流動相定容，再次得到3份第二次稀釋的線性對照品溶液，以此類推，經過連續5次稀釋，分別得到含磺胺間甲氧嘧啶鈉205.52、102.76、51.38、25.69、12.84、6.42 μg·mL-1的對照品溶液；含磺胺氯噠嗪鈉202.18、101.09、50.54、25.27、12.64、6.32 μg·mL-1的對照品溶液；含甲氧卞啶39.92、19.96、9.98、4.99、2.50、1.25 μg·mL-1的對照品溶液。試驗分別精準量取3種對照品溶液20 μL，在新方法條件下，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。在1.2.1色譜條件下，分別測得磺胺間甲氧嘧啶鈉、磺胺氯噠嗪鈉和甲氧卞啶的峰面積（Area），共得到3種化合物峰面積（Area）與質量濃度（C）的回歸方程，計算二者的相關系數，以此檢驗新方法是否可以同時測定3種化合物的含量。

1.3.3 重復性試驗 試驗精準量取1.2.2項下含有磺胺間甲氧嘧啶鈉102.76 μg·mL-1、磺胺氯噠嗪鈉101.09 μg·mL-1和甲氧卞啶19.96 μg·mL-1的對照品混合溶液以及1.2.3項下復方磺胺間甲氧嘧啶鈉粉供試品溶液和復方磺胺氯噠嗪鈉粉供試品溶液各20 μL，連續進樣6次，采用新方法測定上述化合物各自的峰面積，計算相對標準偏差，檢驗新方法的重復性。

1.3.4 準確度試驗 目前，《中國獸藥典》2020年版一部[4]規定，復方磺胺氯噠嗪鈉粉中的磺胺氯噠嗪鈉和甲氧卞啶含量均采用高效液相色譜法進行檢測；《獸藥質量標準》2017年版化學藥品卷[5]規定，復方磺胺間甲氧嘧啶鈉粉中的磺胺間甲氧嘧啶鈉含量采用容量法進行檢測，甲氧卞啶含量采用紫外可見分光光度法檢測，上述檢測方法均為目前標準規定的方法。

在準確度試驗中，按1.2.3項下制作供試品溶液的操作流程，將復方磺胺間甲氧嘧啶鈉粉和復方磺胺氯噠嗪鈉粉各分為5份，采用優化色譜條件與選定溶劑后的高效液相色譜法與標準規定方法進行檢測對比，共設5個平行試驗，檢驗新方法的準確度。

1.3.5 耐用性試驗 試驗分別采用WatersE2695型高效液相色譜儀和Agilent 1100型高效液相色譜儀檢測1.2.3項下的復方磺胺間甲氧嘧啶鈉粉和復方磺胺氯噠嗪鈉粉供試品溶液組分含量，均在新方法條件下測定，設3個平行試驗，比較不同儀器檢測結果的相對標準偏差，檢驗新方法的耐用性。

1.3.6 專屬性試驗 試驗采用新方法測定。通過觀察1.2.2項下的對照品混合溶液和1.2.3項下的輔料溶液、復方磺胺氯噠嗪鈉粉溶液和復方磺胺間甲氧嘧啶鈉可溶粉溶液的高效液相色譜圖以及PDA檢測的光譜圖，判定本試驗色譜條件的專屬性。

1.3.7 穩定性試驗 試驗采用新方法測定。精密量取1.2.2項下的混合對照品溶液20 μL，其中含磺胺間甲氧嘧啶鈉102.76 μg·mL-1、磺胺氯噠嗪鈉101.09 μg·mL-1、甲氧卞啶19.96 μg·mL-1，分別于0、24、48 h時測定，每時間段連續進樣3針，得到上述3種化合物的峰面積，檢驗新方法的穩定性。

1.3.8 添加回收率試驗 按照《中國獸藥典》2020年版一部規定的藥物回收率添加方法，添加后各組分含量為其供試品含量的80%、100%、120%，按照（實測含量-樣品含量）/實際添加量×100%，計算各組分的添加回收率，分別測定已確定含量的復方磺胺間甲氧嘧啶鈉粉（磺胺間甲氧嘧啶為標示量的99.4%，甲氧卞啶為標示量的96.4%）約500 mg，置于3個100 mL容量瓶中，分別在3個100 mL容量瓶中按照從少至多的順序依次加入磺胺間甲氧嘧啶鈉對照品30、50、70 mg，在這3個100 mL容量瓶中同樣按從少至多的順序依次加入甲氧卞啶對照品6、10、14 mg，按照1.2.3項下供試品溶液的配置方法制成3份復方磺胺間甲氧嘧啶鈉粉供試品溶液，采用新方法測定3份供試品溶液的組分含量；另測定已確定含量的復方磺胺氯噠嗪鈉粉（磺胺氯噠嗪鈉為標示量的104.0%，甲氧卞啶為標示量的98.2%）約500 mg，操作與測定方法同上，測定3個化合物的添加回收率。

1.4" "化合物含量的測定與數據處理

試驗分別精準量取上述1.2.2項下的對照品溶液和1.2.3項下的供試品溶液各20 μL，在新方法條件下，將待檢測溶液注入高效液相色譜儀，記錄磺胺間甲氧嘧啶鈉、磺胺氯噠嗪鈉和甲氧卞啶的色譜圖，按外標法以峰面積計算，即得到化合物含量。采用Excel、Empower、Origin 8等軟件進行數據處理和作圖。

2" 結果與分析

2.1" "對照品含量對比試驗

采用新方法對1.2.2項下的不同對照品溶液進行測定（圖1）。試驗結果表明，圖1中a對應1.2.2項下的混合對照品溶液，其中磺胺間甲氧嘧啶鈉、磺胺氯噠嗪鈉、甲氧卞啶能被完全分離，峰型良好，且該混合對照品溶液與1.2.2項下的磺胺間甲氧嘧啶鈉、磺胺氯噠嗪鈉、甲氧卞啶對照品溶液相應色譜峰的保留時間與峰面積基本相同。由此可見，在新方法條件下，可以通過高效液相色譜法（HPLC）同時測定磺胺間甲氧嘧啶鈉、磺胺氯噠嗪鈉、甲氧卞啶的含量。

2.2" "線性范圍試驗

采用新方法對1.3.2項下配制的溶液進行測定，得到磺胺間甲氧嘧啶鈉、磺胺氯噠嗪鈉、甲氧卞啶的峰面積與各自質量濃度的線性關系方程（表1）。由表1可知，上述3個化合物線性方程判定系數均接近1，表明磺胺間甲氧嘧啶鈉、磺胺氯噠嗪鈉、甲氧卞啶的峰面積與各自質量濃度的線性關系良好。試驗結果表明，在特定濃度范圍內，在新方法條件下，可以通過高效液相色譜法（HPLC）同時測定磺胺間甲氧嘧啶鈉、磺胺氯噠嗪鈉、甲氧卞啶的含量，其中磺胺間甲氧嘧啶鈉峰面積在6.42～205.52 μg·mL-1范圍內線性關系良好，磺胺氯噠嗪鈉峰面積在6.32～202.19 μg·mL-1范圍內線性關系良好，甲氧卞啶峰面積在1.25～39.92 μg·mL-1范圍內線性關系良好。

2.3" nbsp;重復性試驗

采用新方法對1.2.2和1.2.3項下配制的溶液進行測定（表2）。由表2可見，1.2.2項下的混合對照品溶液面積最大RSD值為0.21%，1.2.3項下的復方磺胺間甲氧嘧啶鈉粉（E086442）面積最大RSD值為0.26%，復方磺胺氯噠嗪鈉粉（21111001）面積最大RSD值為0.29%。試驗結果表明，在新方法條件下，采用高效液相色譜法（HPLC）同時測定磺胺間甲氧嘧啶鈉、磺胺氯噠嗪鈉、甲氧卞啶含量的重復性良好。

2.4" "準確度試驗

試驗分別采用新方法和目前標準規定方法對1.2.3項下的供試品溶液進行測定（表3）。試驗結果表明，新方法測定的不同化合物百分含量結果與目前標準規定方法測定的結果相近。采用優化色譜條件后的HPLC法測定不同化合物的RSD最大值為1.03%，符合檢驗方法允許的相對標準偏差規定值（1.5%）。試驗結果說明，在新方法條件下，采用高效液相色譜法（HPLC）同時測定磺胺間甲氧嘧啶鈉、磺胺氯噠嗪鈉、甲氧卞啶含量具有較好的準確度。

2.5" "耐用性試驗

在新方法條件下，試驗分別采用WatersE2695

型高效液相色譜儀和Agilent1100型高效液相色譜儀測定1.2.3項下的供試品溶液組分含量（表4）。試驗結果表明，利用WatersE2695型高效液相色譜儀測定的復方磺胺間甲氧嘧啶鈉粉（E086442）和復方磺胺氯噠嗪鈉粉（21111001）的最大RSD值分別為1.03%和0.85%；利用Agilent1100型高效液相色譜儀測定的復方磺胺間甲氧嘧啶鈉粉（E086442）和復方磺胺氯噠嗪鈉粉（21111001）的最大RSD值分別為1.02%和1.00%。試驗顯示，利用這2種型號高效液相色譜儀測定的上述化合物的百分含量比較接近。結果表明，在新方法條件下，采用高效液相色譜法（HPLC）同時測定磺胺間甲氧嘧啶鈉、磺胺氯噠嗪鈉、甲氧卞啶含量的耐用性良好。

2.6" "專屬性試驗

試驗采用新方法測定1.2.2項下的對照品溶液與1.2.3項下的供試品溶液組分含量（圖2）。試驗結果表明，3種化合物保留時間與峰面積基本一致，在色譜圖中，甲氧卞啶、磺胺氯噠嗪鈉和磺胺間甲氧嘧啶鈉峰附近未發現明顯干擾峰。在光譜圖中，經PDA檢測器對1.2.3項下的供試品溶液的色譜主峰進行識別和定位，發現與對應標準品一致。試驗結果表明，在新方法條件下，高效液相色譜法（HPLC）同時測定磺胺間甲氧嘧啶鈉、磺胺氯噠嗪鈉、甲氧卞啶含量的專屬性良好。

2.7" "穩定性試驗

采用新方法測定1.2.2項下的混合對照品溶液組分含量（表5）。測定結果顯示，甲氧卞啶的RSD值為0.06%，磺胺間甲氧嘧啶鈉的RSD值為0.04%，磺胺氯噠嗪鈉的RSD值為0.08%。試驗結果表明，在新方法條件下，高效液相色譜法（HPLC）同時測定磺胺間甲氧嘧啶鈉、磺胺氯噠嗪鈉、甲氧卞啶含量所采用的溶劑在48 h內具有良好的穩定性。

2.8" "添加回收率試驗

采用新方法測定1.3.8項下的供試品溶液組分含量（表6和表7）。試驗結果顯示，經測定1.3.8項下的復方磺胺間甲氧嘧啶鈉可溶性粉溶液中（表6），磺胺間甲氧嘧啶鈉的平均回收率為100.39%，RSD值為0.24%；甲氧卞啶的平均回收率為100.86%，RSD值為0.75%。在測定1.3.8項下的復方磺胺氯噠嗪鈉可溶性粉溶液中（表7），磺胺氯噠嗪鈉的平均回收率為98.63%，RSD值為0.24%；甲氧卞啶的平均回收率為100.45%，RSD值為0.52%。試驗結果表明，在新方法條件下，通過高效液相色譜法（HPLC）同時測定磺胺間甲氧嘧啶鈉、磺胺氯噠嗪鈉、甲氧卞啶含量的回收率符合方法學要求。

3" 結論與討論

目前，已有越來越多的學者通過試驗將當前標準中的一些磺胺類獸藥檢測方法從容量分析法和紫外分光光度計法轉變為采用高效液相色譜法進行測定，如陳錫龍等[11]通過高效液相色譜法同時測定復方磺胺間甲氧嘧啶預混劑中磺胺間甲氧嘧啶及甲氧芐啶含量；王雪靜[12]通過高效液相法測定復方磺胺對甲氧嘧啶片中的磺胺對甲氧嘧啶和甲氧芐啶含量，建立了測定不同磺胺類獸藥的色譜條件。本研究結果表明，應用同一色譜條件可同時檢測復方磺胺間甲氧嘧啶鈉粉和復方磺胺氯噠嗪鈉粉2種磺胺類獸藥，在該色譜條件下，磺胺間甲氧嘧啶鈉、磺胺氯噠嗪鈉和甲氧卞啶3種組分能有效被分離，分離度和塔板數均符合標準要求，該方法具有線性范圍廣、準確度高、耐用性好和回收率高的優點。

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