液相色譜-質譜聯用技術在肉制品中β-受體激動劑類藥物殘留檢測中的應用

摘 要：β-受體激動劑類藥物在畜牧業中仍存在非法使用的風險，對消費者健康造成潛在威脅。本文采用液相色譜-質譜聯用技術（Liquid Chromatography - Tandem Mass Spectrometry，LC-MS/MS）建立了一種檢測豬肉中β-受體激動劑類藥物殘留的方法。樣品經酶解、凈化、濃縮后，采用LC-MS/MS在多反應監測（Multiple Reaction Monitoring，MRM）模式下進行定性定量分析。優化后的前處理條件為甲醇-水（70∶30，v/v）作為提取溶劑，37 ℃β-葡萄糖醛酸苷酶水浴酶解12 h，固相萃取凈化。優化后的儀器條件為采用C18色譜柱，0.1%甲酸水溶液和乙腈為流動相，梯度洗脫。4種β-受體激動劑在給定濃度范圍內與響應值呈良好的線性關系，相關系數均大于0.99；日內和日間相對標準偏差均小于10%，回收率為87.9%～92.5%，基質效應值在90.4%～109.7%。該方法滿足肉制品中β-受體激動劑類藥物殘留檢測的要求。

關鍵詞：液相色譜-質譜聯用技術；β-受體激動劑；殘留；肉制品

Application of Liquid Chromatography - Tandem Mass Spectrometry in the Detection of β-Receptor Agonist Drug Residues in Meat Products

LI Kuaqiao1， XIAO Zhiguo2， LUO Xiaozhen1*

（1.Luoping County Inspection and Testing Institute Yunnan Province， Luoping 655800， China;"2.Qujing Inspection and Testing Research Institute， Qujing 655000， China）

Abstract： β-receptor agonist drugs still pose a risk of illegal use in animal husbandry， posing a potential threat to consumer health. We used liquid chromatography - tandem mass spectrometry （LC-MS/MS） to detect β- receptor agonist drugs in pork. After enzymatic digestion， purification and concentration， the samples were subjected to qualitative and quantitative analysis using LC-MS/MS in multiple reaction monitoring （MRM） mode. The optimized pretreatment conditions were methanol-water （70∶30， v/v） as the extraction solvent， enzymatic hydrolysis of β-glucuronidase water bath at 37 ℃ for 12 h， and solid-phase extraction and purification. The optimized instrument conditions were gradient elution using a C18 column with 0.1% formic acid in water and acetonitrile as mobile phases. The four β-receptor agonists had a good linear relationship with the response value in the given concentration range， and the correlation coefficient was greater than 0.99， the intra-day and inter-day relative standard deviation was less than 10%， the recovery rate was 87.9% to 92.5%， and the matrix effect value was 90.4% to 109.7%. Methodological validation shows that the method meets the requirements for detecting β -receptor agonist drug residues in meat products.

Keywords： liquid chromatography - tandem mass spectrometry technology; β-receptor agonist; residue; meat products

β-受體激動劑是一類高效肉品促生長藥物，但β-受體激動劑在動物體內很難被代謝，殘留物通過食物鏈富集，可能危害消費者健康。我國明令禁止在畜禽養殖中使用β-受體激動劑類藥物，但養殖戶受到經濟利益驅動，非法使用時有發生。開發靈敏、準確、快速的檢測方法對控制β-受體激動劑類藥物非法使用、保障肉制品安全具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜儀、三重四極桿串聯質譜儀以及配套使用的制水系統。液相色譜采用的色譜柱為C18反相柱。有機溶劑甲醇、乙腈等為色譜純試劑，水為新鮮制備的超純水[1]。β-受體激動劑類藥物純度均高于98%。β-葡萄糖醛酸苷酶等輔助試劑選用分析純級別。樣品前處理過程中使用聚合物基質固相萃取小柱凈化目標物。

1.2 樣品前處理

實驗樣品選用購自市場的新鮮豬肉，去除脂肪和結締組織，攪碎均質后置于-20 ℃冷凍保存備用。取2 g肉樣于50 mL離心管中，加入10 mL pH值為5.2的醋酸緩沖液，渦旋振蕩2 min，超聲20 min。加入β-葡萄糖醛酸苷酶，37 ℃水浴過夜，水解樣品中的藥物結合物，提高游離態藥物的提取效率。酶解后樣品經C18固相萃取柱凈化，甲醇洗脫，氮氣吹干后定容，供液相色譜-質譜分析。

為了優化提取條件，本研究考察了甲醇、乙腈、丙酮等常用有機溶劑與水的不同比例（70∶30、50∶50，v/v）混合溶液對β-受體激動劑類藥物提取效率的影響。將處理后的肉樣分別用不同溶劑組合提取，提取液經凈化、濃縮后，采用優化的LC-MS/MS條件進行分析，比較不同提取溶劑組合下目標物的回收率，篩選最佳提取溶劑。

1.3 液相色譜-質譜條件

液相色譜采用Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），柱溫35 ℃。流動相A為0.1%甲酸水溶液，B為0.1%甲酸乙腈溶液，梯度洗脫，洗脫程序如下：0 min 10% B，3 min 50% B，8 min 90% B，10 min 90% B，10.1 min 10% B，12 min 10% B。流速0.3 mL·min-1，進樣量為5 μL。質譜采用電噴霧電離正離子模式（ESI+），噴霧電壓3 500 V，離子源溫度350 ℃，去溶劑氣流量1 000 L·h-1，霧化氣壓力35 psi。

2 結果與分析

2.1 質譜條件優化

2.1.1 母離子和子離子的選擇

通過優化質譜條件，選定各目標物的母離子均為[M+H]+準分子離子。母離子經碰撞誘導解離后產生多個子離子，從中挑選出豐度較高、重現性好、受基質干擾小的1個定量離子和1～2個定性離子，構建多反應監測（Multiple Reaction Monitoring，MRM）通道[2]。

2.1.2 碰撞能量的優化

碰撞能量過低，母離子裂解不完全，子離子豐度偏低；碰撞能量過高，子離子過度裂解，靈敏度下降。為獲得最佳檢測靈敏度，需要優化每個特征離子的碰撞能量。通過調整碰撞能量，考察子離子豐度變化，繪制碰撞能量-離子豐度曲線，選擇子離子響應最強時的碰撞能量值作為最佳值。各目標物的定量離子和定性離子經優化后的碰撞能量見表1。

2.1.3 色譜條件的優化

本研究采用反相C18色譜柱，考察了流動相組成、梯度洗脫程序、柱溫等因素對分離效果的影響[3]。結果表明，以0.1%甲酸水溶液和乙腈為流動相，梯度洗脫，柱溫35 ℃時，各目標物得到良好的分離。優化后的液相色譜條件能在12 min內完成所有待測物的分離分析，色譜峰型對稱，基線平穩，無明顯拖尾現象，為準確定量提供了良好的基礎。

2.2 樣品前處理條件優化

2.2.1 提取溶劑的選擇

本研究考察了甲醇、乙腈、丙酮等常用有機溶劑和水的不同比例混合溶液對目標物提取效果的影響。由表2可知，甲醇-水（70∶30，v/v）作為提取溶劑時，各目標物的提取效率最高，重復性最好。這可能是因為甲醇-水混合溶劑的極性適中，易于溶解和釋放肉樣中的極性和非極性藥物分子，同時促進了肉樣基質的膨脹，有利于目標物的提取。

2.2.2 酶解條件的優化

為準確測定總殘留量，需采用β-葡萄糖醛酸苷酶水解樣品，釋放結合態藥物。本研究優化了酶解溫度和時間。結果表明，在37 ℃條件下酶解過夜（12 h），藥物結合代謝物可完全水解為游離型，酶解效率最高。延長酶解時間至24 h，各目標物的檢測量沒有明顯增加。因此，選擇37 ℃水浴酶解12 h作為最佳酶解條件。優化的酶解條件可有效提高β-受體激動劑類藥物的檢出率，確保檢測結果的準確性和可靠性。

2.2.3 凈化條件的優化

采用固相萃取（Solid-Phase Extraction，SPE）方式凈化樣品，考察了不同SPE柱、淋洗液和洗脫液的凈化效果。結果顯示，使用C18反相SPE柱，以5%甲醇水溶液淋洗，甲醇-水（90∶10，v/v）洗脫，可獲得最佳凈化效果。與HLB、SCX等其他SPE柱相比，C18柱能更有效地去除肉樣基質中的脂肪、蛋白質等雜質，同時減少目標藥物的損失。優化的SPE凈化條件能最大限度地消除基質干擾，提高檢測靈敏度和準確性。

2.3 分析方法的評價

2.3.1 線性范圍與相關系數

配制一系列不同濃度（1 μg·kg-1、2 μg·kg-1、5 μg·kg-1、10 μg·kg-1、20 μg·kg-1、50 μg·kg-1、100 μg·kg-1）的藥物標準溶液，按建立的樣品前處理方法和儀器分析方法測定，以藥物濃度為橫坐標，響應值（峰面積）為縱坐標，繪制標準曲線，進行線性回歸分析[4]。結果顯示，4種β-受體激動劑在給定濃度范圍內與響應值呈良好的線性關系，相關系數均大于0.99。線性范圍覆蓋了動物源性食品中β-受體激動劑最大殘留限量（Maximum Residue Limit，MRL）的數值，可滿足實際樣品檢測的需求。各藥物的線性方程和相關系數見表3。

2.3.2 精密度與準確度

為了評價方法的精密度和準確度，進行了日內和日間重復性試驗。精密度通過計算相對標準偏差（Relative Standard Deviation，RSD）來衡量。在3個添加水平（1 μg·kg-1、10 μg·kg-1、100 μg·kg-1）下，每個水平重復6次，連續測定3天，計算日內和日間RSD。準確度采用加標回收率考察。

結果表明，4種β-受體激動劑日內和日間RSD均小于10%，日內RSD為3.5%～4.5%，日間RSD為5.9%～7.2%，表明方法精密度良好。在3個添加水平下，平均回收率為87.9%～92.5%，說明該方法準確度高。

2.3.3 基質效應

本研究采用基質匹配標準曲線法評估方法的基質效應[5]。配制純溶劑標準溶液和基質匹配標準溶液（空白基質提取液+標準工作液），比較不同基質中目標物的響應值與純溶劑中的響應值之比，即為基質效應值?；|效應在90%～110%時，表明基質效應小，不影響定量結果的準確性。

本方法測定的4種β-受體激動劑的基質效應值均在90.4%～109.7%，表明經優化的樣品前處理和儀器分析條件，可有效減少豬肉樣品基質的干擾，保證分析結果的可靠性。

2.4 實際樣品檢測與分析

為了驗證建立的液相色譜-串聯質譜法的實際應用效果，對市售豬肉樣品中β-受體激動劑類藥物殘留進行了檢測分析[6]。從超市、農貿市場等不同銷售渠道采集了50個豬肉樣品，按照優化的樣品前處理方法提取凈化后，采用建立的LC-MS/MS方法進行定性定量分析。結果如表4所示，在檢測的50個樣品中，有8個樣品檢出了β-受體激動劑類藥物殘留，檢出率為16%。其中，克侖特羅和沙丁胺醇為主要檢出藥物，殘留濃度分別在2.1～15.6 μg·kg-1和1.8～10.2 μg·kg-1。檢出樣品的殘留量均低于我國和國際上相關法規標準規定的MRL值。

實際樣品檢測結果表明，建立的方法靈敏度高、選擇性強，能有效檢測出豬肉中低水平的β-受體激動劑類藥物殘留，為豬肉質量安全控制提供有力的分析手段。

3 結論

本研究建立了液相色譜-質譜聯用技術測定豬肉中β-受體激動劑類藥物殘留的方法，對實際樣品進行檢測，證實了該方法的可行性和實用性。該方法靈敏度和選擇性高，定量準確，為肉制品中β-受體激動劑類藥物殘留檢測提供了一種可供選擇的新方法。

參考文獻

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[2]韓超，周秀錦，陳瑤，等.超高效液相色譜-串聯質譜法測定豬腎中安普霉素的殘留量[J].分析測試學報，2024，43（5）：787-791.

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[5]張洋.LC-MS/MS法同時快速檢測牛肉中12種β-受體激動劑的應用研究[J].食品安全導刊，2020（26）：71-75.

[6]閆順華，馬君，蘇比努爾.超聲輔助提取-LC-MS/MS法測定豬肉中9種β-受體激動劑[J].分析儀器，2023（6）：41-46.