小麥TaCLC-e-3AL 基因功能分析及互作蛋白鑒定

摘要： 【目的】分析小麥氯離子通道TaCLC-e-3AL 基因功能并鑒定其互作蛋白，以解析TaCLC-e-3AL 參與小麥響應(yīng)低氮脅迫的作用機(jī)制。【方法】以擬南芥AtCLC-e 氨基酸序列為參考序列，通過BlastP 對(duì)小麥基因組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，獲得TaCLC-e-3AL （TraesCS3A02G253600）、TaCLC-e-3B （TraesCS3B02G285500） 和TaCLC-e-3DL（TraesCS3D02G254500） 3 個(gè)基因，分析其基因結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系。將TaCLC-e-3AL-p1300-GFP 融合蛋白表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至小麥原生質(zhì)體中，分析TaCLC-e-3AL 的亞細(xì)胞定位特征；采用轉(zhuǎn)基因擬南芥進(jìn)行異源功能驗(yàn)證，利用酵母雙雜交篩選與TaCLC-e-3AL 相互作用的蛋白。【結(jié)果】生物信息學(xué)分析表明，TaCLC-e-3AL 編碼的蛋白含有11 個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，與烏拉爾圖小麥TuCLC-e 同源性最高。組織表達(dá)量預(yù)測(cè)分析表明，TaCLC-e-3AL 基因在小麥的葉片和莖部表達(dá)量較高。順式作用元件分析表明，其可能響應(yīng)光、激素以及逆境脅迫等信號(hào)。亞細(xì)胞定位顯示，TaCLC-e-3AL 蛋白經(jīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分選后定位于葉綠體內(nèi)。過表達(dá)TaCLC-e-3AL 轉(zhuǎn)基因擬南芥植株在低氮脅迫條件下可以儲(chǔ)存更多的NO3?，并能夠維持植株體內(nèi)NO3?/Cl?的穩(wěn)態(tài)，不引起植株根長(zhǎng)和鮮重的顯著變化。酵母雙雜交文庫(kù)篩選顯示TaCLC-e-3AL 與水通道、葉綠體a/b 結(jié)合蛋白和電壓依賴性陰離子通道3 個(gè)蛋白互作，表明TaCLC-e-3AL 可能與它們協(xié)同參與干旱脅迫響應(yīng)、光合作用、信號(hào)傳導(dǎo)等生物過程。【結(jié)論】小麥氯離子通道蛋白TaCLC-e-3AL 位于葉綠體內(nèi)。TaCLC-e-3AL 基因轉(zhuǎn)化至擬南芥中過表達(dá)，在低氮脅迫條件下較野生型可以在植株體內(nèi)儲(chǔ)存更多的NO3?，并維持NO3?/Cl?的值，表明TaCLC-e-3AL 可能調(diào)控Cl?和NO3?的協(xié)同運(yùn)輸。TaCLC-e-3AL 通過與水通道蛋白、葉綠體a/b 結(jié)合蛋白、電壓依賴性陰離子通道蛋白互作，參與小麥的干旱脅迫、光合作用和離子脅迫應(yīng)答。

關(guān)鍵詞： 小麥； 氯離子通道蛋白； TaCLC-e-3AL； 功能分析； 互作蛋白

氮素作為植物生長(zhǎng)發(fā)育必需的大量元素之一，參與了蛋白質(zhì)、核酸、磷脂等重要有機(jī)分子的合成[1]。植物可吸收利用的氮素主要為硝態(tài)氮和銨態(tài)氮，硝態(tài)氮是植株吸收利用的主要氮素形態(tài)，銨態(tài)氮只有在水淹地或還原性強(qiáng)的土壤中才可能成為主要氮素營(yíng)養(yǎng)來源[2]。作為中國(guó)三大糧食作物之一的小麥（Triticum aestivum L.），其吸收利用氮源的形態(tài)主要是硝態(tài)氮，硝態(tài)氮能夠促進(jìn)小麥根系生長(zhǎng)、增強(qiáng)抗逆性、提高產(chǎn)量和改善品質(zhì)[3]。植物吸收硝態(tài)氮主要依靠4 類NO3?轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白：低親和硝態(tài)氮轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（low affinity nitrate transporter，NRT1）、高親和硝態(tài)氮轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（high affinity nitrate transporter，NRT2）、氯離子通道蛋白（chloride channel protein，CLC）、慢陰離子通道相關(guān)同系物（slow anion channel relatedhomologue SLAC1/SLAH）[4]。

CLC 基因廣泛存在于各種古菌、微生物真菌、動(dòng)物和植物中。1996 年，首次在煙草[5]和擬南芥[6]中發(fā)現(xiàn)植物CLC 基因，隨后發(fā)現(xiàn)該家族基因也存在于水稻[7]、玉米[8]、大豆[9]、小麥[10]和棉花[11]等物種中。大部分CLC 蛋白結(jié)構(gòu)特征為含有一個(gè)高度保守的電壓門控氯離子通道（voltage-gate CLC） 結(jié)構(gòu)域和兩個(gè)保守的胱硫醚β 合成酶（CBS） 結(jié)構(gòu)域[ 1 2 ]。植物CLC 家族基因除了行使氮素吸收轉(zhuǎn)運(yùn)功能外，其在維持細(xì)胞內(nèi)外滲透壓、體內(nèi)離子動(dòng)態(tài)平衡、氣孔運(yùn)動(dòng)、增強(qiáng)植物抗旱性和耐鹽性等方面也發(fā)揮著重要作用。植物中CLC 基因家族可以分為2 個(gè)亞類（Ⅰ、Ⅱ），7 個(gè)簇，其中亞類Ⅰ包含5 個(gè)簇（-a、-b、-c、-d、-g），亞類Ⅱ包含2 個(gè)簇（-e、-f）。亞類Ⅰ的研究較為廣泛，AtCLC-a、AtCLC-b 參與液泡中NO3?的積累，AtCLC-c 能轉(zhuǎn)運(yùn)Cl?并增強(qiáng)植株耐鹽性[12?14]。玉米ZmCLC-a 定位于細(xì)胞膜上，能使轉(zhuǎn)基因擬南芥積累更多的硝酸鹽[15]。大豆GsCLC-c2 通過調(diào)節(jié)陰離子穩(wěn)態(tài)提高轉(zhuǎn)基因擬南芥和大豆的耐鹽性[ 1 6 ]。棉花GhCLC-g1 可以調(diào)節(jié)植株體內(nèi)離子含量，增強(qiáng)植株耐鹽性[17]。亞類Ⅱ中的AtClC-e 能夠維持?jǐn)M南芥細(xì)胞內(nèi)膜的硝酸鹽穩(wěn)態(tài)，且與AtClC-a 基因存在相關(guān)性[18]；AtCLC-e 可以維持?jǐn)M南芥體內(nèi)Cl?穩(wěn)態(tài)，影響葉綠體的超微結(jié)構(gòu)和調(diào)節(jié)光合電子的傳輸[19]；茶樹CsCLC-e 參與了陰離子Cl?和F?的反應(yīng)過程[20]；過表達(dá)蘋果MhCLC-e2 能夠增強(qiáng)愈傷組織對(duì)缺氮脅迫的耐受性[21]。

目前氯離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白CLC 僅在模式植物擬南芥和水稻中進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究，小麥TaCLC 家族的研究主要集中于基因家族的初步分析[10]，家族成員的克隆和具體功能解析鮮有報(bào)道。本研究通過同源比對(duì)獲得3 個(gè)TaCLC-e 同源基因，利用小麥原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)基因擬南芥和酵母雙雜交技術(shù)對(duì)TaCLCe-3AL 的亞細(xì)胞定位、基因功能以及互作機(jī)制進(jìn)行了初步解析，以期為小麥氮素吸收利用提供基因資源和理解氮素調(diào)控的分子生物學(xué)機(jī)制提供參考。