高位池和工廠化養殖模式下斑節對蝦肝胰腺和腸道微生物特征分析

摘 要：為闡述在不同養殖模式下斑節對蝦（非洲群體）（Penaeus monodon）肝胰腺和腸道微生物的特征，基于高通量測序、Biolog ECO技術探討了高位池和工廠化養殖模式下斑節對蝦肝胰腺、腸道菌群結構特征及腸道微生物代謝活性。高通量測序結果顯示，高位池養殖模式下對蝦腸道菌群多樣性及豐富度顯著高于工廠化養殖模式，且同類樣本距離較近，體現了不同模式對蝦樣品中物種的異質性和多樣性。不同樣品中的細菌門類及相對豐度結果顯示，對蝦腸道菌群的優勢菌門包括變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、浮霉菌門（Planctomycetes）、放線菌門（Actinobacteria）等，其中比例最高的是變形菌門；在屬水平上，工廠化養殖模式中相對豐度最高的是發光桿菌屬（Photobacterium），高位池養殖模式中相對豐度最高的是紅桿菌屬（Rhodobacterium）和弧菌屬（Vibrio）。基于Unifrac距離的生態聚集分析結果顯示，生態聚集過程應該與環境特征和養殖策略有直接的關系。腸道微生物代謝活性總體變化趨勢結果顯示，隨著時間的延長，72 h前微生物整體代謝活性呈現快速增加趨勢，隨后變緩并逐漸趨于平穩；不同養殖模式下斑節對蝦腸道微生物代謝碳源種類和活性具有顯著差異。

關鍵詞：斑節對蝦；肝胰腺；腸道微生物；高通量測序；代謝活性

斑節對蝦（非洲群體）（Penaeus monodon）又稱金剛蝦、斑節王、草蝦王，隸屬于節肢動物門、甲殼綱、十足目、對蝦科、對蝦屬，其體長側扁、略呈梭形，體色鮮亮且較深，頭胸甲厚實，屬雜食性動物，適宜在水溫25～32 ℃、鹽度30左右的沙底質環境中生活。該蝦抗病能力較強，適宜工廠集約化、高位池、池塘等多種養殖模式 ^［1］。

工廠化養殖模式是一種高投入、高產出的新型養殖模式 ^［2］，因其對環境友好、節能、節水等優勢特征被應用較多 ^［3-5］。目前工廠化養殖主要有設施化養殖、流水養殖、半封閉循環水養殖和全封閉循環水養殖等幾種類型。但是，對蝦工廠化循環水養殖往往初期投入大，能耗和運行成本較高，在現階段我國的國情下較難立足。發展對蝦工廠化循環水養殖必須立足各地不同的環境條件，借鑒現有經驗進行開發。高位池養殖模式是推動中國對蝦養殖業恢復和發展的重要模式，目前在我國對蝦養殖產業中占據重要地位 ^［6］。高位池是1個半人工半天然的生態系統 ^［7］，對蝦與殘飼、糞便、生物遺骸等在其中相互作用，通過跟蹤監測微生物狀況等方法可探索不同區域對蝦養殖模式和養殖效果之間的對應關系 ^［8-10］，最終促進系統（氣候環境、養殖環境、生理環境、用藥環境）的健康循環。

對蝦腸道是動物機體獲得外界能量、參與外界基礎物質循環的主要“場所”，甚至被稱為機體的“第二大腦”。腸道菌群是寄居在腸道內的龐大微生物群，與宿主呈相互依存、相互制約的共生狀態 ^［11-12］。肝胰腺是對蝦健康生長、代謝及免疫的前提基礎，其狀態不僅關系著機體對外源營養物質的消化、吸收，也影響著機體免疫系統的正常運轉。肝胰腺作為重要器官之一，同樣受到微生物菌群的影響。例如，弧菌的增加可能會改變肝胰腺的狀態結構，提高疾病感染率 ^［13］；飼料等外源物質的毒素亦可能損傷肝胰腺結構，增加死亡率 ^［12］；對蝦肝胰腺還可以分泌各種消化酶，間接在免疫防御中發揮重要作用 ^［14］。

目前普遍認為，肝臟與腸道是相互作用、相互影響的。有研究報道，對蝦肝胰腺病變的同時，機體腸道也會發生不同程度的病變 ^［15-16］。近年來，針對“腸-肝軸”的研究日益增多，關于條件性致病因素對于水產養殖物種致病機理的研究，特別是針對肝胰腺或者腸道免疫功能的研究越來越受到重視。動物宿主微生物群對周圍生長環境具有強烈的選擇性，機體微生物群和潛在的生態系統在生長中會受到生物和非生物變異的影響，但其影響機制尚不清楚。本試驗嘗試通過對蝦肝胰腺及腸道微生物的變化來反映養殖模式及環境的重要性，分析存在其中的密切而復雜的相互作用，以期為斑節對蝦健康養殖提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗設計及試驗動物管理

試驗在山東省濱州市無棣北海新區養殖場進行。分別采用高位池養殖和工廠設施化養殖兩種模式飼養斑節對蝦，其中高位池面積為337 m2/口，對蝦放養密度為300尾/m2；工廠設施化養殖池面積為36 m2/口，對蝦放養密度為600尾/m2。每種養殖模式設3口平行養殖池。

斑節對蝦（非洲群體）（以下簡稱為“對蝦”）來自福建某養殖場，暫養后試驗初始平均體質量為（1.5±0.3）g。試驗共進行31 d（2021年7月2日—2021年8月1日）。試驗水源為海水，經砂濾、消毒后進入蓄水池。試驗水質條件為：鹽度30.0±1.5，pH 7.8±0.5，水溫（28±1.5）℃，溶解氧（7.5±1.0）mg/L，氨氮＜0.5 mg/L。羅茨鼓風機24 h充氣，每日上午10：00換水1次。每日投飼量為對蝦體質量的8%～10%，分5次投喂（ 6：0 0、10：00、14：00、18：00、22：00），并根據當日天氣、剩余飼料情況等進行調整

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品采集

飼養試驗結束后，采用5點取樣法在每口養殖池各采集100尾健康對蝦。隨即獲取其腸道內容物和肝胰腺組織。混勻后迅速置于液氮中帶回實驗室備用。樣品分為兩個部分，一部分用于 Biolog分析，另一部分用于DNA提取及高通量測序分析。

1.2.2 基因組DNA提取、擴增、純化

采用E.Z.N.A.Stool DNA Kit提取對蝦肝胰腺及腸道內容物微生物總基因組DNA，按照操作說明方法進行。提取得到的DNA經1.5 %瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，并由超微量核酸蛋白分析儀（Biodropsis BD-1000）測定其濃度，于 -80 ℃保存作為模板使用。反應體系為25 μL，包括基因組DNA模板50 ng，V3+V4區通用引物338F（ACTCCTACGGGAGGCAGCAG）和806R（GGACTACHVGGGTWTCTAAT）各2.5 μL， Pusion Hot start flex 2×Master Mix 12.5 μL，補充ddH2O至25 μL。反應條件為：98 ℃變性30 s，擴增98 ℃ 10 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，共35個循環；72 ℃延伸10 min。PCR產物經回收、純化后備測。

1.2.3 高通量測序及分析

純化后的產物由杭州聯川生物技術股份有限公司通過文庫制備和庫檢后進行Illumina MiSeq "2×300 bp paired-end上機測序。Miseq測序完成后，得到原始的下機數據，去除reads（讀長）的barcode（樣品標簽）和接頭序列，利用overlap將雙端數據進行拼接，去除含有N（N表示無法確定堿基信息）的比例大于5%的tags（標簽），去除低質量tags（質量值Q＜10的堿基數占所有tags的20%以上），通過質控和過濾后，獲得高質量的clean數據（有效數據）。對有效數據進行97%的相似度聚類，采用CD-HIT將序列相似性大于97%的clean tags定為一個OUT（operational "taxonomy unit），過濾后獲得最終的OTU豐度及代表序列，進一步進行多樣性分析和差異分析等。分析內容包括原始數據優化及有效優質序列統計、OTU Venn圖、Alpha多樣性指數分析、基于weighted UniFrac距離PCoA分析、Rank- aboundance曲線分析、分類學豐度分析、物種差異分析。

1.2.4 ECO代謝活性分析

腸道微生物的整體代謝活性可通過平均吸光值（average well color development，AWCD）來分析，即計算一定時間內微生物的整體代謝平均活性。本研究通過BiologTM的ECO測試板（ECO MicroPlate，USA）對其進行測定。ECO板含有3套31種不同碳源，其中氨基酸類6種、糖類10種、羧酸類7種、聚合物類4種、胺類2種和酚類2種（見表1）。將不同模式的對蝦腸道樣品混合物按照一定比例用0.9%生理鹽水稀釋后，倒在無菌加樣槽中，然后加樣于25 ℃預熱的ECO 96孔微板中，每孔加入150 μL；加好樣的微板加蓋后于28 ℃恒溫培養，每隔24 h讀取各孔在590 nm波長下的光密度，連續測定120 h，每個樣品做3個重復。其計算公式為：

D=∑（Ci-R）/n （1）

式（1）中：D為平均吸光值，Ci為所測定的31個碳源孔的吸光值，R為對照孔的吸光值，n為培養基碳源總數（本試驗中n=31）。

1.3 數據分析

16S rDNA測序結果經QIIME 2軟件分析獲得，數據庫包括RDP、Greengenes、NCBI 16S Microbial和Customized database。通過SPSS 20.0軟件對所得數據進行統計學分析。

2 結果

2.1 序列質量及特征分析

從每個樣本的測序下機原始數據整理發現，模糊堿基非常少，G+C堿基數量占比約53.0%，90.0%以上的堿基測定準確率達99.9%，95.0%以上的堿基測定準確率達99.0%（見表2）。因此，本次測序原始數據的平均質量達到預期，可以進行后續分析。

對蝦肝胰腺樣品高通量測序結果顯示，工廠化養殖模式下對蝦肝胰腺樣品高質量序列平均為85 036條，有效序列數達到94.54%，樣本中有758個操作分類單元（OUT）；腸道樣品高質量序列平均為80 759條，有效序列數達到90.17%，樣本中有906個OTU。高位池養殖模式下對蝦肝胰腺樣品高質量序列平均為55 022條，有效序列數達到96.02%，樣本中有819個OTU；腸道樣品高質量序列平均為81 455條，有效序列數達到 78.99%，樣本中有1 026個OTU。高位池養殖模式的OTU數量（相似度大于97%）多于工廠化養殖模式的。

2.2 不同養殖模式下對蝦肝胰腺和腸道菌群 Alpha多樣性特征分析

表3呈現了工廠化和高位池養殖對蝦腸道菌群Alpha多樣性特征，反映了不同模式下對蝦腸道菌群特征與模式環境的相互關系。從菌種豐富度指數（Chao1 index）、香農指數（Shannon "index）、辛普森多樣性指數（Simpson index）等數據結果分析，高位池養殖模式的菌群多樣性和豐富度均大于工廠化養殖模式的。

圖1是使用97%相似度的OTU制作的稀釋曲線圖，表現了樣本中物種的豐富度，說明本研究中測序數據量的合理性；折線圖橫軸上的長度表示樣本中的可操作分類單元數量，平緩或陡峭現象反映均勻度大小，說明高位池養殖模式下對蝦腸道和肝胰腺樣品中的菌落豐富度和菌落組成均勻度略高于工廠化養殖模式。對各個樣品細菌多樣性的相互關系進行分析，并構建Venn圖（見圖2），結果顯示，工廠化和高位池不同養殖模式下對蝦肝胰腺樣品中共有294個OTUs，腸道樣品中共有401個OTUs。差異可操作分類單元比較結果顯示，高位池養殖模式的OTUs多于工廠化養殖模式，說明養殖模式與微生物菌群結構存在必然的聯系。

2.3 不同養殖模式下對蝦肝胰腺和腸道菌群Beta多樣性特征分析

PCoA結果計算了weighted UniFrac距離（考慮了樣本之間物種類別差異以及各類別物種的豐富度差異），依據距離矩陣進行主成分分析，與Alpha多樣性構成不同菌群的異質性（見圖3）。結果顯示，加權法橫坐標PCoA1，貢獻率值為 86.08%；縱坐標PCoA2，貢獻率值為13.81%，說明不同養殖模式的對蝦樣品來自于不同的養殖環境，體現了不同物種的異質性和多樣性，同類樣本距離較近，多樣性差異較小。

2.4 不同養殖模式下對蝦肝胰腺和腸道菌群組成分析

不同養殖模式下對蝦腸道及肝胰腺樣品中細菌群落的組成見圖4、圖5。從細菌門水平上分析（見圖4），不同樣品中的優勢菌門包括變形菌門Proteobacteria、擬桿菌門Bacteroidetes、浮霉菌門Planctomycetes、放線菌門Actinobacteria、疣微菌門Verrucomicrobia、衣原體門Chlamydiae、厚壁菌門Firmicutes，其中占比最高的是變形菌門，工廠化養殖模式的相對豐度（肝胰腺98.22%，腸道 96.08%）顯著高于高位池養殖模式（肝胰腺 77.02%，腸道85.47%）。從細菌屬水平上分析（見圖5），工廠化養殖模式下相對豐度最高的是發光桿菌屬Photobacterium（肝胰腺96.40%，腸道89.07%），其次是紅桿菌屬Rhodobacter、弧菌屬Vibrio等，這些菌屬的豐度比例相對較低；高位池養殖模式下對蝦肝胰腺中相對豐度最高的是紅桿菌屬（33.04%），其次是假交替單胞菌屬Pseudoalteromonas（14.12%），對蝦腸道中相對豐度最高的是弧菌屬（48.45%），其次是紅桿菌屬（ 10.38%），而發光桿菌屬、魯杰氏菌屬Ruegeria等的豐度比例相對較低。為進一步探索細菌菌群結構與不同樣本之間的聯系，基于可分類的不同級別水平構建了含系統發育樹、樣品聚類關系樹的熱圖（heatmap）。分析表明，門、屬水平上細菌菌群進化關系聚為兩大分支，其中工廠化模式肝胰腺和腸道菌群構成一支，高位池模式構成另一支，說明不同養殖模式下的細菌群落聚類不同。

2.5 不同養殖模式下樣品細菌群落的生態分析

生態相似性（ecological resemblance）以計算不同樣本群落組成相似程度或距離（相異程度）為基礎，是處理多元生態數據的基本方法之一。

在Unifrac距離中，除了關注物種的存在與否及其豐度外，還將物種之間的進化關系考慮在內，距離0更側重于表示兩個群落的進化分類完全一致。由表4可見，工廠化養殖模式下對蝦腸道與肝胰腺的微生物群落距離系數為0.05，生態相似度極高，工廠化養殖模式與高位池養殖模式對蝦腸道的微生物群落距離系數為0.44；工廠化養殖模式和高位池養殖模式下的對蝦肝胰腺微生物群落距離系數達到0.70，而且高位池養殖模式下對蝦肝胰腺微生物群落與工廠化養殖模式下對蝦腸道微生物群落的距離系數為0.66。可見生態聚集過程應該與環境和飲食有直接的關系。

2.6 不同養殖模式下腸道樣品代謝活性分析

由圖6可見，不同養殖模式下腸道微生物代謝活性總體變化趨勢相似，72 h內微生物整體代謝活性呈現快速增強的趨勢，但隨時間的推移，吸光值上升趨緩，微生物代謝活性逐漸趨于平穩。從總體代謝活性來看，高位池養殖模式下對蝦樣品微生物對其中6類主要碳源的利用情況由強到弱表現為：羧酸類gt;氨基酸類gt;糖類gt;聚合物類gt;胺類gt;酚酸類；工廠化養殖模式下則表現為：羧酸類gt;聚合物類gt;氨基酸類gt;糖類gt;胺類gt;酚酸類，平均吸光值均隨著時長的增加而增強。

表5列出了兩種養殖模式中利用率較高的碳源，其中高位池養殖模式下利用率較高（AWCDgt;3.00）的糖類有3種，氨基酸類有2種，聚合物類有1種，羧酸類有1種，酚酸類和胺類相對較弱；工廠化養殖模式下利用率較高（AWCDgt;2.00）的糖類有5種，氨基酸類有2種，聚合物類有2種，羧酸類有3種，酚酸類和胺類相對較弱。

由圖7可見，不同養殖模式下微生物群落對底物碳源的利用種類和利用強度表現出差異的趨勢，兩種模式的微生物群落均對酚酸類的利用程度最小。

3 討論

3.1 高位池和工廠化養殖模式下對蝦腸道和肝胰腺微生物菌群結構的差異

通過了解不同養殖模式對蝦肝胰腺和腸道微生物菌群的結構特征，可預警宿主疾病狀態，影響制定宿主養殖過程的病害防控措施，從而降低養殖風險，提高養殖經濟效益。對蝦肝胰腺微生物主要來自周圍環境菌群的定植，腸道微生物群主要是由對蝦主動選擇后定植共存 ^［17-19］，因此，養殖環境是決定或控制對蝦機體微生物菌群的決定性因素 ^［20-21］。本研究工廠化模式下對蝦肝胰腺和腸道優勢菌主要是發光桿菌屬，原因可能是發光桿菌屬來源于養殖水體環境及飼（餌）料的機會菌，攝入后定植于對蝦機體內成為共生菌、常居菌，在菌群結構單一且外源營養不充分的情況下，可通過合成和分泌多種初生和次生代謝產物來提供良好的生理環境，維持宿主常規的代謝規律。高位池養殖模式對蝦肝胰腺中相對豐度最高的是紅桿菌屬和假交替單胞菌屬，對蝦腸道中相對豐度最高的是弧菌屬，這些菌屬均是對蝦實際養殖過程中的條件致病菌，而且，腸道微生物群在一定程度上是受某個或某些外部因素（例如養殖水體的鹽度、溫度和溶解氧等）的影響，驅動對蝦腸道微生物群的演替 ^［22-23］。有研究報道，水體環境中的硝酸鹽等物質可以作為某些細菌的底物能源而促進微生物菌群的結構形成 ^［24］，水環境因子變化通過直接或間接的作用影響了對蝦肝胰腺的菌群結構。這與本研究結果是一致的，可能是高位池養殖模式下對蝦養殖水體環境中的硝酸鹽濃度相對偏高，導致條件性致病菌的生長富集，這些結果也為后續研究提供了思路。在高位池養殖模式下，養殖過程中要更多地關注弧菌相對豐度，在菌群結構的基礎上進一步探討病害防控措施。從PCoA圖也可看出，不同養殖模式下菌群結構的貢獻關系可能與微生物的代謝差異有關，而代謝差異是由選擇不同碳源的差異引起的，這對于后續研究微生物代謝差異的限制性因子或碳源選擇偏好性提供了豐富的信息。

3.2 高位池和工廠化養殖模式下對蝦腸道和肝胰腺微生物菌群代謝活性的差異

群落水平多樣性（community-level "physiological profile）不僅要關注微生物對碳源利用模式，更要關注其中某一碳源的絕對利用情況，再結合其生態學意義，能更好地了解微生物群落代謝特征 ^［25］。ECO生態微板分析是根據微生物整體對單一碳源利用活性而進行的一種不同微生物群體的差異分析方法，因其具有靈敏度高、分辨力強、無需分離純培養、測定簡便等優點而被研究者們廣泛使用 ^［26-28］。本試驗中，兩種養殖模式的水源均來自北海新區潮汐海水，水體理化性質同源，AWCD總活性表現出相似的特征，表明在同一區域相似水體的不同養殖模式下微生物的代謝活性表征沒有太大差異。

微生物代謝能力可能影響環境中“廢物”的存在 ^［29-30］，由兩種養殖模式微生物對碳源的總體利用能力對比發現，相比工廠化養殖模式，高位池養殖模式的AWCD活性較高，表明高位池養殖模式下微生物群落對碳源的總體利用能力較強，原因可能是高位池養殖環境中浮游動植物或無機鹽等物質為對蝦腸道微生物提供了一定的營養物質，加速了其對碳源的利用，而且其優勢菌屬（弧菌屬和紅桿菌屬等）對羥基丁酸、蘋果酸等相應底物的降解增多，這與優勢菌群結構的結果相呼應。此外，大功率增氧機等設備的使用，增加了高位池水層的攪動，微生物AWCD總活性增強直觀地體現出微生物群落的反應速度和營養消耗效率。有研究報道，腸道微生物菌群中異養微生物的結構和活性與碳源種類有很大的相關性 ^［31-32］。本研究中，兩種養殖模式下的微生物碳源代謝也呈現出選擇性差異，這可能與兩種模式的養殖策略相關。高位池養殖模式下投喂配合飼料相對較少，而配合其他改良底質或調控水質的微生態制劑較多，且高位池中天然餌料豐富，受自然環境的影響更直接，這些波動性因素都可促使對蝦機體內以及水體中微生物的差異繁殖，進而導致微生物結構及代謝活性的不同。試驗中還發現，微生物在碳源利用中對胺類和酚類的利用率較低，活性較弱，這一結果可為對蝦養殖過程中微生物營養需求的研究提供方向，并可在水質調控方面為研究C/N平衡和物質循環的微生物定向強化提供依據。

4 結論

斑節對蝦（非洲群體）在工廠化和高位池養殖模式下肝胰腺和腸道微生物的豐富度和多樣性呈現差異，高位池模式下菌群多樣性和相對豐度較高，體現了不同模式的異質性和多樣性。在群落組成上，工廠化養殖模式下的優勢菌屬是發光桿菌屬，高位池養殖模式下的優勢菌屬是紅桿菌屬和弧菌屬。相同養殖模式的樣品相似性高于不同養殖模式，表明生態聚集過程應該與養殖環境及飼養策略有直接的關系。微生物代謝活性結果表明，高位池和工廠化養殖模式下對蝦肝胰腺和腸道微生物的碳代謝能力有顯著的差異。該研究結果可為分析養殖系統微生物群落的調理和代謝活性提供理論支撐。

參考文獻

［1］王曉璐，樊英，王友紅，等.斑節對蝦（非洲群體）腸道細菌抗生素耐藥性及耐藥基因分布特征［J］.微生物學報，2022，62（9）：3399-3409.

［2］王峰，雷霽霖，高淳仁，等.國內外工廠化循環水養殖研究進展［J］.中國水產科學，2013，20（5）：1100-1111.

［3］TIMMONS M B， EBELING J M.The role for recirculating aquaculture systems（RAS） Part 1［J］.Aquaculture Magazine，2006，32（3）：26-31.

［4］程波，劉鷹，楊紅生，等.Cu污染條件下封閉循環水養蝦系統的效能［J］.農業工程學報，2011，27（2）：248-254.

［5］PEDERSEN L F，PEDERSEN P B.Hydrogen peroxide application to a commercial recirculating aquaculture system［J］.Aquacultural Engineering，2012，46：40-46.

［6］頡曉勇，鐘金香，李純厚，等.高位池循環水養殖模式創新與實踐［J］.農業環境與發展，2012，29（6）：20-22.

［7］周小壯，林小濤，林繼輝，等.不同模式對蝦養殖的自身污染及其環境效應［J］.生態科學，2004，23（1）：68-72.

［8］李琦，李純厚，頡曉勇，等.對蝦高位池循環水養殖系統對水質調控效果研究［J］.農業環境科學學報，2011，30（12）：2579-2585.

［9］胡維安，李純厚，頡曉勇，等.高位池循環水養殖系統的構建及其水質調控效果［J］.廣東農業科學，2011，38（23）：124-128.

［10］李純厚，魏小嵐，頡曉勇，等.對蝦高位池循環水養殖效果比較分析［J］.廣東農業科學，2011，38（17）：91-95.

［11］GENSOLLEN T，IYER S S，KASPER D L，et al.How colonization by microbiota in early life shapes the immune system［J］.Science，2016，352（6285）：539-544.

［12］NORMAN J M，HANDLEY S A，VIRGIN H W.Kingdom-agnostic metagenomics and the importance of complete characterization of enteric microbial communities［J］.Gastroenterology，2014，146（6）：1459-1469.

［13］QIN J J，LI R Q，RAES J，et al.A human gut microbial gene "catalogue established by metagenomic sequencing［J］.Nature，2010，464（7285）：59-65.

［14］KAU A L，AHERN P P，GRIFFIN N W，et al.Human nutrition，the gut microbiome and the immune system［J］.Nature，2011，474（7351）：327-336.

［15］LIGHTNER D V，REDMAN R M，PANTOJA C R，et al.Early mortality syndrome affects shrimp in Asia［J］.Global Aquaculture Advocate，2012，15：40.

［16］LIU W，WU J P，LI Z，et al.Effects of dietary coated protease on growth performance，feed utilization，nutrient apparent digestibility，intestinal and hepatopancreas structure in juvenile Gibel carp （Carassius auratus gibelio）［J］.Aquaculture Nutrition，2018，24（1）：47-55.

［17］ZHOU Q，ZHU X，LI Y Z，et al.Intestinal microbiome-mediated resistance against vibriosis for Cynoglossus semilaevis［J］.Microbiome，2022，10（1）：153.

［18］XIONG J B，DAI W F，QIU Q F，et al.Response of host-bacterial colonization in shrimp to developmental stage，environment and disease［J］.Molecular Ecology，2018，27（18）：3686-3699.

［19］BURNS A R，STEPHENS W Z，STAGAMAN K，et al. Contribution of neutral processes to the assembly of gut "microbial communities in the zebrafish over host development［J］.The ISME Journal，2016，10（3）：655-664.

［20］HAO Y T，WU S G，XIONG F，et al.Succession and fermentation products of grass carp （Ctenopharyngodon idellus） hindgut "microbiota in response to an extreme dietary shift［J］.Frontiers in Microbiology，2017，8：1585.

［21］CORNEJO-GRANADOS F，GALLARDO-BECERRA L， LEONARDO-REZA M，et al.A meta-analysis reveals the "environmental and host factors shaping the structure and "function of the shrimp microbiota［J］.PeerJ，2018，6：e5382.

［22］XIONG J B，XUAN L X，YU W N，et al.Spatiotemporal "successions of shrimp gut microbial colonization：high "consistency despite distinct species pool［J］.Environmental "Microbiology，2019，21（4）：1383-1394.

［23］ZHAO Y T，DUAN C L，ZHANG X X，et al.Insights into the gut microbiota of freshwater shrimp and its associations with the "surrounding microbiota and environmental factors［J］.Journal of Microbiology and Biotechnology，2018，28（6）：946-956.

［24］KUHN D D，SMITH S A，BOARDMAN G D，et al.Chronic "toxicity of nitrate to Pacific white shrimp，Litopenaeus vannamei：impacts on survival，growth，antennae length，and pathology［J］.Aquaculture，2010，309（1/2/3/4）：109-114.

［25］OEHMEN A.The competition between polyphosphate accumulating organisms and glycogen accumulating organisms in the enhanced biological phosphorus removal process［D］.Brisbane：The University of Queensland，2005.

［26］ZHANG T Y，WU Y H，ZHUANG L L，et al.Screening heterotrophic microalgal strains by using the Biolog method for biofuel production from organic wastewater［J］.Algal Research，2014，6：175-179.

［27］李志斐，謝駿，郁二蒙，等.基于Biolog-ECO技術分析雜交鱧和大口黑鱸高產池塘水體微生物碳代謝特征［J］.農業環境科學學報，2014，33（1）：185-192.

［28］袁翠霖.羅非魚養殖系統微生物群落生態研究及潛在有益菌的篩選［D］.廣州：暨南大學，2011.

［29］LPEZ M J，ELORRIETA M A，VARGAS-GARCíA M C，et al.The effect of aeration on the biotransformation of lignocellulosic wastes by white-rot fungi［J］.Bioresource Technology，2002，81（2）：123-129.

［30］DIGNAC M F，HOUOT S，FRANCOU C，et al.Pyrolytic study of compost and waste organic matter［J］.Organic Geochemistry，2005，36（7）：1054-1071.

［31］CHOI K H，DOBBS F C.Comparison of two kinds of Biolog "microplates （GN and ECO） in their ability to distinguish among aquatic microbial communities［J］.Journal of Microbiological Methods，1999，36（3）：203-213.

［32］魏成，劉平.人工濕地污水凈化效率與根際微生物群落多樣性的相關性研究［J］.農業環境科學學報，2008，27（6）：2401-2406.

Distribution characteristics of microorganisms in hepatopancreas and intestine of

Penaeus monodon under industrial and high-pond culture modes

YU Xiaoqing1， WANG Youhong1， BI Yijia2， WANG Xiaolu1， WANG Shuxian1，

GAI Chunlei1， XU La1， YE Haibin1， LI Li1， DIAO Jing1， LIU Xintian2， LIU Hongjun1， FAN Ying1

［1. Marine Science Research Institute of Shandong Province; Key Laboratory for

Disease Control in Mariculture of Shandong Province（National Oceanographic Center， Qingdao），

Municipal Engineering

Research Center of Aquatic

Biological Quality Evaluation and Application，

Qingdao

266104， China; 2. Weihai Oceanic Development Research Institute， Weihai 264200， China］

Abstract： To describe the characteristics of microorganisms in the hepatopancreas and intestine of Penaeus "monodon under different culture modes， the structural characteristics of the hepatopancreas and intestinal "microbiota and the metabolic activities of intestinal microorganisms of P. monodon under high-level pond and "industrial culture modes were investigated based on high-throughput sequencing and Biolog ECO technology. The results of high-throughput sequencing showed that the diversity and richness of intestinal microbiota in the "high-level pond culture mode were significantly higher than those in the factory culture mode， and the similar "samples were closer， reflecting the heterogeneity and diversity of species in the shrimp samples of different modes. The results of bacterial phyla and relative abundance in different samples showed that the dominant phyla of shrimp intestinal flora included Proteobacteria， Bacteroidetes， Planctomycetes， Actinobacteria， etc.， and the highest proportion was Proteobacteria. At the genus level， the highest relative abundance in the factory culture mode was Photobacterium， and the highest relative abundance in the high-pond culture mode was Rhodobacterium and "Vibrio. Based on the results of Unifrac distance ecological aggregation analysis， the ecological aggregation process should be directly related to environmental characteristics and breeding strategies. The metabolic activity of "intestinal microorganisms increased rapidly in first 72 hours， but then slowed down and stabilized gradually with time extends. The types and activities of intestinal microbial metabolic carbon sources of shrimp under different culture modes showed different trends.

Key words： Penaeus monodon; hepatopancreas; intestinal microbiome; high-throughput sequencing; metabolic activity