北苑貢茶茶樹種質遺傳多樣性及其與青心烏龍茶樹的親緣關系

doi：10.3969/j.issn.1000-4440.2024.05.018

收稿日期：2023-06-19

基金項目：建甌市茶葉科技創新專項（JO2022001）；福建省科技廳農業科技引導性項目（2021N0024）；福建農林大學科技創新專項基金項目（CXZX2020123B）；海關總署科研項目（2020HK187）

作者簡介：劉財國（1996-），男，江西上饒人，碩士研究生，研究方向為茶樹栽培育種。（E-mail）1060737445@qq.com

通訊作者：葉乃興，（E-mail） ynxtea@126.com；于文濤，（E-mail） wtyu@foxmail.com

摘要：" 為更好地發掘、保護和利用北苑貢茶茶樹種質資源，采用EST-SNP分子標記技術對北苑貢茶種質遺傳多樣性及其與青心烏龍的親緣關系進行分析。篩選出49個多態性強的SNP位點，適用于鑒定北苑貢茶茶樹種質基因分型以及分析其與青心烏龍的親緣關系，并進行PCoA主成分分析、層級進化樹構建和遺傳距離分析。結果表明，北苑貢茶茶樹種質具有豐富的遺傳多樣性，其6個茶樹種質群體間的遺傳距離為0.021～0.137；北苑貢茶核心產地福建省建甌市東峰鎮的百年烏龍茶園為有性茶樹-無性茶樹混合種植的古茶園；青心烏龍茶樹（中國臺灣）、矮腳烏龍茶樹（武夷山）與北苑貢茶的百年烏龍茶樹種質親緣關系密切。根據親緣關系分析推測，青心烏龍茶樹（中國臺灣）、軟枝烏龍茶樹（中國臺灣）和矮腳烏龍茶樹（武夷山）可能均源自建甌北苑貢茶產區。

關鍵詞：" 北苑貢茶；青心烏龍；茶樹；種質資源；遺傳多樣性

中圖分類號：" S571.1""" 文獻標識碼：" A""" 文章編號：" 1000-4440（2024）05-0935-09

Genetic diversity of Beiyuan tribute tea germplasms and their genetic relationship with Qingxinwulong

LIU Caiguo1，" LYU Shuiyuan2，" YU Wentao2，" PAN Hongying3，" WANG Pan1，" YAN Linhua3，" ZHU Yanyu1，" JIN Shan1，" YE Naixing1

（1.College of Horticulture， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou 350002， China;2.Technology Centre of Fuzhou Customs District， Fuzhou 350001， China;3.Jian’ou Tea Industry Development Center， Jian’ou 353100， China）

Abstract：" To enhance the excavation， protection and utilization of excellent Beiyuan tribute tea germplasm resources， the genetic diversity of Beiyuan tribute tea germplasms and their genetic relationship with Qingxinwulong were analyzed using the EST-SNP molecular marker technique. Forty-nine SNP loci with strong polymorphism were screened out， which were suitable for identifying the genotyping of Beiyuan tribute tea germplasm and analyzing its genetic relationship with Qingxinwulong， and the PCoA principal component analysis， hierarchical phylogenetic tree construction and genetic distance analysis were carried out. The results showed that the germplasm resources of Beiyuan tribute tea had abundant genetic diversity， and the genetic distance among the six tea groups ranged from 0.021 to 0.137. The century-old oolong tea garden in Dongfeng Town， the core producing area of Beiyuan tribute tea， was an ancient tea garden with mixed planting of sexual and asexual. Qingxinwulong （Taiwan） and Aijiaowulong （Wuyishan） were closely related to the centennial oolong germplasm of Beiyuan tribute tea. According to the analysis of genetic relationship， it was speculated that Qingxinwulong （Taiwan）， Ruanzhiwulong （Taiwan） and Aijiaowulong （Wuyishan） might be derived from Jian’ou Beiyuan tribute tea producing area.

Key words：" Beiyuan tribute tea;Qingxinwulong;Camellia sinensis;germplasm resources;genetic diversity

茶樹，為山茶科山茶屬的常綠木本植物，是世界上重要的經濟作物之一，原產于中國。福建省建甌市地處武夷山脈東南面，鷲峰山脈西北側，閩江建溪流域，產茶歷史悠久，有“千年古茶都”之美譽。北苑貢茶發源于建甌市，享譽海內外。周絳在《補茶經》載：“天下之茶，建為最，建之北苑，又為最”，宋子安的《東溪試茶錄》記載道：“茶之名者有七”，是茶史上首次對茶樹品種進行分類。豐富多樣的茶樹種質資源是茶樹遺傳育種、品種創新和茶葉生產的物質基礎。周理飛調查發現建甌古茶樹有數百株，又以東峰鎮桂林村的矮腳烏龍茶樹為最。賴少波記載道：矮腳烏龍為建甌境內茶鄉流傳的特色茶種，俗稱“菜茶”，并廣泛流傳省內外。中國臺灣的茶樹品種和制茶技術均由福建傳來，青心烏龍是中國臺灣的主要栽培品種。中國臺灣大學吳振鐸通過比對茶樹形態、結構特征，認為建甌東峰的百年烏龍茶園是中國臺灣青心烏龍和凍頂烏龍的發源地。植物種質資源的快速鑒定及親緣關系分析已成為種質資源相關研究人員關注的核心問題之一。單核苷酸多態性（Single nucleotide polymorphism， SNP）作為第三代分子標記，具有準確度高、遺傳穩定性高、自動化等優點，在茶樹研究中不斷得到應用，包括遺傳多樣性和種群結構分析、起源和進化分析、標記輔助選擇以及遺傳連鎖圖譜的構建等。此外，Liu等使用SNP技術研究發現武夷山茶樹種質資源可分為2個群體。樊曉靜等通過將茶樹基本信息與SNP位點信息相結合構建了茶樹分子身份證。目前，對北苑貢茶的研究主要集中于北苑貢茶歷史、生化品質多樣性、茶樹抗逆性等方面，關于北苑貢茶茶樹種質SNP基因分型鑒定的研究尚未見報道。本研究采用SNP分子標記技術對北苑貢茶茶樹種質進行遺傳多樣性及親緣關系分析，以期從分子水平上探究北苑貢茶茶樹群體的遺傳多樣性，以及對其與周邊茶產區茶樹之間的遺傳關系進行分析，闡明中國臺灣青心烏龍與北苑貢茶茶樹群體的親緣關系，有利于更好地保護、發掘和利用北苑貢茶的優異茶樹種質資源。

1" 材料與方法

1.1" 材料收集

供試材料來自建甌市北苑貢茶產區（包括東峰鎮、東游鎮、小橋鎮、南雅鎮）茶樹種質117份，中國臺灣、武夷山、安溪等周邊產區茶樹種質53份（表1）。

1.2" DNA提取

使用新的植物基因組提取試劑盒，根據試劑盒的說明，從各茶樹種質的芽葉中提取DNA。然后，使用NanoDrop核酸測序儀（NanoDrop 2000/2000C）分析DNA質量，要求DNA質量濃度gt;50 μg/ml。成功提取的DNA存儲在-20 ℃冰箱里。

1.3" 單核苷酸多態性標記與基因分型

在本研究的早期階段，茶樹的表達序列（EST）從美國國家生物信息中心（NCBI）的數據庫（http：//www.NCBI.nlm.nih.gov/）下載。為了挖掘和選擇茶樹的單核苷酸多態性，最終篩選出96個用于茶樹種質資源基因分型的SNP位點。具體SNP基因分型方法參考Lin等的方法。

1.4" 數據分析

數據采集由EP1儀器執行，使用Fluidigm SNP基因分型分析軟件導出并分析數據（https：//www.fluidigm.com/software），然后使用GenAlEx6.503軟件進行相關等位基因信息、群體分化和遺傳距離計算分析。PCoA圖分析來自GenAIEx的遺傳距離測量。對于層次聚類樹，應用MEGA5.05軟件計算序列數據，然后使用層次聚類法構建。

2" 結果與分析

2.1" 北苑貢茶茶樹種質多態性SNP位點的篩選與分析

通過對96個SNP標記位點的篩選，獲得了49個多態性強的特異位點，適用于鑒定北苑貢茶茶樹種質的基因分型，占所有位點的51.0%。篩選的49個SNP位點的相關等位基因信息如表2所示，這些SNP位點的信息指數為0.125～0.680，平均值為0.466；觀測雜合度為0.037～0.846，平均值為0.365；期望雜合度為0.077～0.487，平均值為0.314；固定指數為-0.730～0.435，平均值為-0.139；次等位基因頻率為0.050～0.500，平均值為0.264。觀測雜合度和期望雜合度的平均值相近，表明供試北苑貢茶茶樹種質具有豐富的遺傳多樣性。此外，在篩選SNP位點時，次等位基因頻率要確保≥0.05。49個多態性SNP位點的次等位基因頻率如圖1所示。

2.2" 北苑貢茶茶樹種質SNP基因指紋圖譜

通過分析篩選獲得的多態性SNP位點，確定每個樣品SNP位點上的基因型，即XX型、XY型和YY型，用以構建北苑貢茶茶樹種質DNA指紋圖譜。其中XY型為雜合子，即同源染色體上相同位點的等位基因是不同堿基個體，有AC、AT、CT、CG、AG、TG、GA、TC、GT、GC、TA、CA等12種。XX型和YY型為純合子，即同源染色體上相同位點的等位基因是相同堿基個體，包括AA、CC、GG、TT等4種。堿基個體包括腺嘌呤（A）、鳥嘌呤（G）、胞嘧啶（C）、胸腺嘧啶（T）。本研究通過49個高質量SNP位點的基因分型，構建了北苑貢茶茶樹種質的 EST-SNP 指紋圖譜（圖2）。

2.3" 北苑貢茶茶樹種質與相鄰地區茶樹種質的親緣關系

根據PCoA主成分分析結果，前3個主成分分別占總變異的27.41%、10.77%和5.47%。通過第一主成分和第二主成分構建的PCoA圖（圖3）顯示了北苑貢茶茶樹種質與鄰近茶產區茶樹種質的親緣關系。將各組群區域標明后可以發現，北苑貢茶茶樹種質資源與安溪茶產區、武夷山茶產區茶樹種質間存在交流，但與閩東茶產區茶樹種質分開。供試茶樹種質存在較明顯的聚類關系，來自武夷山茶產區的17個茶樹種質和安溪茶產區的16個茶樹種質聚類相對集中，并且來自武夷山和安溪的2個武夷山矮腳烏龍在圖中完全重合，為同一品種，這表明安溪的矮腳烏龍來自于武夷山。而閩東的15份茶樹種質分布相對分散，這與供試種質來自閩東的不同縣域產區有關。值得一提的是，來自中國臺灣的青心烏龍和軟枝烏龍的5個種質明顯聚集在建甌北苑貢茶群體內，而且青心烏龍1與青心烏龍2完全重合，軟枝烏龍1、軟枝烏龍2和軟枝烏龍3完全重合。圖4顯示建甌北苑貢茶茶樹種質資源的親緣關系，各群體間皆存在相互交流。從參試種質的分布來看，來自東游、甌寧、小橋、南雅和吉陽茶樹種質分布相對集中，而來自東峰茶樹種質分布相對分散。進一步對參試茶樹種質進行分析發現：百年烏龍種質2、百年烏龍種質3、百年烏龍種質5、百年烏龍種質6、百年烏龍種質9、百年烏龍種質19、百年烏龍種質25、百年烏龍種質27和百年烏龍種質32完全重合；百年烏龍種質1、百年烏龍種質24、百年烏龍種質33和百年烏龍種質34完全重合；百年烏龍種質38、百年烏龍種質42和百年烏龍種質44完全重合；百年烏龍種質46和百年烏龍種質50完全重合；百年烏龍種質37、百年烏龍種質41、東峰黃重尾2號、東峰金盤山3號、東峰長源2號和東游上范2號完全重合。

2.4" 北苑貢茶茶樹種質層級進化樹

通過DAW win 6.0軟件對170份供試茶樹種質聚類生成層級進化樹（圖5），進化樹分析結果與PCoA分析結果基本一致。從進化樹中可以發現，供試茶樹種質被分為兩大分支，第一大分支中的茶

樹種質皆為北苑貢茶核心茶樹種質，包括東游上范2號和24個東峰的百年烏龍種質；第二大分支包括其余的145個茶樹種質，且它們之間的親緣關系也較為清晰。基因型相似度為100%的聚類結果與PCoA中完全重合的結果一致。2個青心烏龍聚為同一個種質，3個軟枝烏龍聚為同一個種質，來源不同的2個武夷山矮腳烏龍聚為同一個種質。青心烏龍（中國臺灣）、軟枝烏龍（中國臺灣）和矮腳烏龍（武夷山）均為無性系品種，說明本試驗結果的準確性和可靠性。本研究結果顯示，供試的百年烏龍茶樹中大部分是不同種質，僅少量供試茶樹是同一種質，這可能與早期建甌茶區廣泛采用茶樹“壓條”和“扦插”技術進行無性繁殖有關，說明百年烏龍茶園為有性-無性混合種植的古茶園。此外，發現青心烏龍（中國臺灣）、軟枝烏龍（中國臺灣）和矮腳烏龍（武夷山）3個種質與建甌東峰鎮百年烏龍茶樹種質之間的親緣關系密切，其親緣關系密切程度依次為青心烏龍＞軟枝烏龍＞矮腳烏龍。矮腳烏龍與百年烏龍種質21的親緣關系較近，青心烏龍、軟枝烏龍與百年烏龍種質35的親緣關系相近。青心烏龍和軟枝烏龍間基因型相似度更高、親緣關系更近。

2.5" 北苑貢茶茶樹種質與相鄰產區茶樹種質間遺傳距離及北苑貢茶茶樹種質群體間的遺傳距離

用GenAlEx 6.503軟件計算北苑貢茶茶樹種質與相鄰茶產區茶樹種質遺傳距離和北苑貢茶茶樹種質6個群體間遺傳距離。從表3可知，北苑貢茶茶樹種質與武夷山、安溪兩個產區茶樹種質間的遺傳距離很近，僅0.055和0.057，說明它們之間的基因型相近，但與閩東產區茶樹種質的遺傳距離為0.119，大于其他。這與前面PCoA和層級進化樹結果相一致。表4顯示了北苑貢茶茶樹種質6個群體間的遺傳距離在0.021～0.137，其中建甌東峰茶樹群體與建甌甌寧茶樹群體間遺傳距離最遠，為0.137，建甌東游和建甌吉陽茶樹群體間遺傳距離最近，為0.021。值得注意的是，建甌東峰茶樹群體與其他5個茶樹群體的遺傳距離都大于其他兩兩茶樹群體間的遺傳距離。

3" 討論

3.1" 北苑貢茶茶樹種質的遺傳多樣性

茶樹地方種質由當地獨特的地理環境孕育而成，適應性強、遺傳基礎豐富，是一種重要的基礎資源，了解其遺傳多樣性和親緣關系有利于我們對種質資源的有效使用。本研究通過對170份供試茶樹種質進行PCoA分析和層級進化樹構建，結果表明，170份供試茶樹種質聚集相對集中，沒有區分為亞群，說明北苑貢茶茶樹種質與武夷山茶產區、安溪茶產區和閩東茶產區茶樹種質間的親緣關系較近。但在遺傳距離上，北苑貢茶茶樹種質與武夷山茶產區、安溪茶產區茶樹種質之間的距離更小，為0.055、0.057，與前人研究結果一致。此外，北苑貢茶產區內各群體間種質聚集較為緊密，僅建甌東峰茶樹群體分布較為分散。在遺傳距離方面，建甌東峰與其他5個群體間的遺傳距離較大，遺傳多樣性更加豐富，其他5個群體間的遺傳距離很小，僅有0.021～0.056，說明建甌東游、建甌甌寧、建甌小橋、建甌南雅和建甌吉陽5個茶樹群體間的親緣關系近，種質間交流頻繁。據史可知，建甌東峰是北苑貢茶的發源地，宮廷御茶園之所在地，歷來是作為皇室貢茶，茶樹種質得到比較完善的保護。

3.2" 青心烏龍、軟枝烏龍、矮腳烏龍及近緣地方種質間的親緣關系

建甌市東峰鎮桂林村的百年烏龍茶園地處北苑御茶園的核心產地，百年烏龍被統稱為矮腳烏龍茶樹，建甌茶農多稱之為小葉烏龍，但這是一種不嚴謹的稱謂。此外，桂林村百年烏龍茶園是中國臺灣青心烏龍茶樹的發源地。青心烏龍也稱作軟枝烏龍、種茶、正樅等，其葉長、葉寬、葉脈、鋸齒等形態特征與百年烏龍茶園中的茶樹非常吻合。長期以來，存在關于中國臺灣青心烏龍、軟枝烏龍和矮腳烏龍是異名同種的說法。因此，有關青心烏龍、軟枝烏龍和矮腳烏龍以及這些近緣地方種質的親緣關系是迫切需要研究梳理的。

4" 結論

本研究通過構建SNP指紋圖譜、PCoA和層級進化樹等進行分析，結果表明，建甌市東峰鎮百年烏龍茶樹種質總體具有眾多各異的基因型，彼此間的基因相似度較高，可見百年烏龍茶園的茶樹種質不是單一的無性系品種，屬于建甌北苑貢茶有性群體種。同時，研究發現，百年烏龍種質37與百年烏龍種質41基因相似度高達100%，且與建甌的黃重尾、金盤山、長源和東游上范等地茶園的栽培種基因型一致。基于SNP的多重分析首次發現，青心烏龍茶樹（中國臺灣）、軟枝烏龍茶樹（中國臺灣）和矮腳烏龍茶樹（武夷山）三者與百年烏龍茶樹種質間的親緣關系密切，但基因分型不同。青心烏龍茶樹（中國臺灣）與軟枝烏龍茶樹（中國臺灣）為一個單系群，且二者SNP基因分型差異極小。矮腳烏龍茶樹（武夷山）與百年烏龍茶樹種質21的親緣關系較近，青心烏龍茶樹、軟枝烏龍茶樹與百年烏龍茶樹種質35間的親緣關系相近，從分子水平闡明了武夷山的矮腳烏龍茶樹、中國臺灣青心烏龍茶樹和中國臺灣軟枝烏龍茶樹可能來源于建甌東峰鎮百年烏龍茶園。另外，本研究結果還表明，百年烏龍種質2、百年烏龍種質37、百年烏龍種質38等茶樹種質已進行了無性繁殖擴繁，揭示了建甌茶農早期已從北苑貢茶種質中篩選了優異單株，經過無性繁殖后在生產上進行了大面積推廣種植。

致謝：" 本研究試驗種質采集承蒙建甌市茶產業工作專班左宇、林其明，建甌市茶業發展中心黎鄭偉，天福茶博物院茶道交流部王瑞香，福建省川苑茶業有限公司李榮旺，建甌市小青茶廠李小青，建甌市郭云山茶業有限公司葛桂亮，建甌市東峰茶廠范兆敏，福建盛榮生態茶業有限公司張盛榮，福建省江山美人茶業有限公司李鵬春的大力支持，特此致謝！

參考文獻：

闞能才. 茶樹起源與川渝野生茶樹分布研究. 西南農業學報，2013，26（1）：382-385.

鞏" 志，姚月明. 建茶史微. 農業考古，1995（4）：192-201.

潘宏英. 建甌市茶產業發展現狀與思考. 中國農技推廣，2021，37（1）：35-37.

賴少波. 北苑御焙名冠天下——《建甌茶志》總述選萃. 中國茶葉，2017，39（12）：37-39.

劉祖陛. 宋代建茶文化初探. 福建史志，2019（4）：1-6.

肖正廣，申長鋒. 試析宋子安《東溪試茶錄》的現實意義. 中國茶葉加工，2017（增刊2）：61-66.

周理飛. 建甌茶區優異種質資源保護與利用的實踐. 福建茶葉，2011，33（1）：26-28.

賴少波. 建甌茶志. 福州：福建科學技術出版社，2017：34-55.

鞏" 志. 建茶的傳播. 福建茶葉，2003，（4）：46.

郭" 琳，郭雅玲，洪翠云. 淺談閩臺茶業的淵源與交流. 茶葉科學技術，2008，（1）：52-54.

LIN Y， YU W T， ZHOU L， et al. Genetic diversity of oolong tea （Camellia sinensis） germplasms based on the nanofluidic array of single-nucleotide polymorphism （SNP） markers. Tree Genetics amp; Genomes，2020，16（1）：1-14.

羅祥宗，胡云飛，吳淋慧，等. 茶樹葉綠體基因組SNP分子標記的初步研究. 茶葉科學，2022，42（6）：768-778.

LIN Y， YU W T， CAI C P， et al. Rapid varietal authentication of oolong tea products by microfluidic-based SNP genotyping. Food research international，2022，162（A）：111970.

LIU C G， YU W T， CAI C P， et al. Genetic diversity of tea plant" germplasm resources in Wuyi Mountain of China based on single nucleotide polymorphism （SNP） markers. Horticulturae，2022，8（10）：932-944.

樊曉靜，于文濤，蔡春平，等. 利用SNP標記構建茶樹品種資源分子身份證. 中國農業科學，2021，54（8）：1751-1772.

李錦生. 淺談建甌北苑貢茶文化的挖掘與弘揚. 中國茶葉，2020，42（4）：67-70.

鄭安儒，陳光武，徐 凱，等. 建甌地區13個不同茶樹品種制成烏龍茶品質差異研究. 茶葉學報，2022，63（2）：73-81.

裴朝鑒. 茶樹炭疽病的發生原因及防治措施. 福建農業科技，2012（2）：34-35.

FANG W P， MEINHARDT L W， TAN H W， et al. Varietal identification of tea （Camellia sinensis） using nanofluidic array of single nucleotide polymorphism （SNP） markers. Horticulture Research，2014，1（1）：1-8.

陳林海，鐘吉茂，何燕燕，等. 福安地方茶樹種質親緣關系與遺傳多樣性. 茶葉通訊，2022，49（2）：173-180.

WEI K， WANG X C， HAO X Y， et al.Development of a genome-wide 200K SNP array and its application for high-density genetic mapping and origin analysis of Camellia sinensis. Plant Biotechnology Journal，2022，20（3）：414-416.

何" 崚，陳伊妮，肖海茵，等. 貢茶生產對地方生態環境影響初探. 北京林業大學學報（社會科學版），2018，17（3）：34-39.

鄭立盛. 牽掛海峽兩岸的一件茶事. 福建茶葉，2001（4）：39-40.

姚月明，鞏" 志. 閩臺烏龍茶同根同祖. 農業考古，1993（2）：20-21.

（責任編輯：黃克玲）