小菜蛾幼蟲生防菌株毒力測定及產毒條件優化

關鍵詞：小菜蛾幼蟲；生防菌株篩選；毒力測定；粉紅粘帚霉；產毒條件優化

小菜蛾（Plutella xylostellaL．）隸屬于鱗翅目菜蛾科菜蛾屬，又稱小青蟲、兩頭尖，為害白菜、蘿卜等十字花科蔬菜最為嚴重。它啃食蔬菜葉片，導致葉片變成網狀，品質下降，銷售受到影響。小菜蛾一直在我國南方省份嚴重發生，導致許多蔬菜作物失去原有價值，一些地區甚至顆粒無收，種植戶們苦不堪言，已成為一種亟待防治的主要害蟲之一。

目前，已從化學防治、物理防治、生物防治以及一些農業防治等領域對小菜蛾的防治做出研究，其中生物防治是較為高效且對人畜低毒或無毒的防治方法。有研究表明，蠟蚧輪枝菌（Ver-ticilliu.m lecanii）、球孢白僵菌（Beauveria bassi-ana）及金龜子綠僵菌（Metarhizium anisopliae）菌劑的10倍稀釋液對小菜蛾都具有很好的防治效果。但關于粉紅粘帚霉（Clonostachys rosea）、淡紫擬青霉（Purpureocillium lilacinum）、02號生赤殼屬（Bionectria sp.）菌株防治小菜蛾的研究還未見報道。粉紅粘帚霉作為一種在世界范圍內廣泛分布的絲狀真菌，具有很高的生防潛力。它是自然界中一類重要的寄生真菌，可寄生于植物、昆蟲和線蟲活體內，也是一種重要的重寄生菌，除了用于防治蟲害外，還可用于防治病害且防治效果較好。蘆俊佳等曾對粉紅粘帚霉防治楚雄腮扁葉蜂幼蟲進行過研究，發現其具有較好的防治效果。同時，也有一些研究表明，粉紅粘帚霉對植物生長具有促進作用。淡紫擬青霉是很多植物寄生線蟲的重要天敵，是一種極具推廣潛力的生防菌和功能菌。孫漫紅等曾報道過淡紫擬青霉M-14具有很強的殺線蟲活性。Lopez等通過試驗發現淡紫擬青霉對棉花蚜蟲有較強防效。02號生赤殼屬菌株首次被發現是在對紅豆杉（Taxus chinensis var. maLrez）內生真菌的研究中，被歸類為生赤殼科，一系列抑菌試驗后發現并證明其代謝產物具有明顯的抗菌作用。

真菌的產毒與培養環境息息相關，比如培養基類型、培養基pH值、培養時間、光照條件、振蕩培養條件等，對培養條件進行優化有利于生防真菌的進一步開發利用和害蟲防治。本研究選用粉紅粘帚霉、淡紫擬青霉、02號生赤殼屬菌株對小菜蛾幼蟲進行噴霧浸染，首先篩選出對小菜蛾生防效果較好的高毒力菌株，繼而測定其對小菜蛾的半致死濃度（LC50）和半致死時間（LT50），優化其產毒條件，以期為小菜蛾的生物防治提供新的微生物資源，為高毒力菌株的開發利用提供理論依據。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1供試菌株粉紅粘帚霉SWFUYOO、02號生赤殼屬菌株SWFUY02、淡紫擬青霉SWFUY08來源于云南省森林災害預警與控制重點實驗室。

1.1.2供試蟲源3齡小菜蛾幼蟲購于濟源白云實業有限公司。

1.1.3儀器與試劑TGL-16G型臺式離心機，上海安亭科學儀器廠產品：GXM-358A型光照培養箱，寧波江南儀器廠產品：XB-K-25型血球計數板，上海求精生化試劑儀器有限公司產品；MQW-63R型振蕩培養箱，上海曼泉儀器有限公司產品。其他試劑均為分析純。

1.1.4培養基馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dex-trose agar，PDA）培養基：葡萄糖20g，瓊脂粉20g，馬鈴薯200g，蒸餾水1000mL。馬鈴薯蔗糖培養基（potato sucrose agar，PSA）：蔗糖20g，瓊脂粉20g，馬鈴薯200g，蒸餾水1000mL。察氏液體培養基（Czapek）：KN03 2g，KCl0.5g，FeS040.01g，K2 HP041g．MgS04.7H2 00.5g，蒸餾水1000mL。薩氏葡萄糖瓊脂酵母膏（Sachs dex-trose agar yeast，SDAY）：酵母浸粉20g，葡萄糖40g，蛋白胨10g，蒸餾水1000mL。

1.2試驗設計及方法

本試驗于2023年2月在西南林業大學園林園藝學院實驗室與云南省森林災害預警與控制重點實驗室進行。

1.2.1凍存菌株活化培養活化培養所用培養基為PDA培養基。將凍存的粉紅粘帚霉、02號生赤殼屬、淡紫擬青霉進行活化，每種菌株活化30皿，恒溫恒濕培養箱中培養15～30d待用。

1.2.2孢子懸浮液制備取培養15～30d且長滿菌絲的培養皿，用含吐溫80的無菌水進行洗脫，多次攪拌，過濾菌絲得到孢子懸浮液，將三種菌株孢子懸浮液均通過16格×25格血球計數板計數確定孢子濃度為1.0x108個孢子/mL。計算公式為：

孢子濃度（個/mL）=每小方格中孢子平均數x400x104×稀釋倍數。

1.2.3生防菌篩選采用噴霧法進行。設置粉紅粘帚霉、淡紫擬青霉、02號生赤殼屬菌株為試驗組，以無菌水為對照組，每組重復3次，每重復20頭3齡小菜蛾幼蟲。小菜蛾幼蟲先用無菌水噴霧處理消毒，處理后吸干水分，然后用三種菌株的孢子懸浮液（1.0x108個孢子/mL）對小菜蛾幼蟲進行噴霧處理，將處理后的小菜蛾幼蟲連同蔬菜葉片一起放入墊有濕棉花和用無菌水濕潤濾紙的培養皿中，用透明保鮮膜封閉培養皿后再在透明膜上用針扎70個小孔。之后三種菌株分別做好標記，對照組編號為CK，放人培養箱中恒溫恒濕培養，每隔6h觀察一次，記錄死亡蟲數并計算死亡率。

死亡率（%）=死亡蟲數／試驗總蟲數×100；

校正死亡率（%）=（試驗組死亡率一對照組死亡率）／（1-對照組死亡率）×100。

死亡判定標準：用細毛筆輕觸小菜蛾腹部，不動者視為死亡。

觀察到部分死亡小菜蛾幼蟲尸體上長出菌絲后，挑出菌絲接到新的培養基上，置于恒溫恒濕培養箱中培養7～10d．觀察新長出菌株的形態特征，并與浸染生防菌株的形態特征進行比較，確定小菜蛾幼蟲死因是生防菌株浸染所致。

1.3高毒力菌株毒力測定

對預先培養的生長良好的高毒力菌株進行洗脫，確定孢子懸浮液濃度。設置測定半致死濃度的孢子懸浮液濃度梯度為1.0x104、1.0x105、1.0x106、1.0x107、1.0x108個孢子/mL。測定半致死時間的孢子懸浮液濃度為1.0x108個孢子/mL。制備好的孢子懸浮液用1.2.3的方法進行處理，并觀察記錄數據。

1.4高毒力菌株產毒條件優化

1.4.1不同培養基對高毒力菌株產毒的影響選用不加瓊脂的PDA培養基（以下用PDB表不）、PSA培養基、SDAY培養基、Czapek液體培養基進行測定。挑取3塊5 mm的高毒力菌株菌餅放于配制好的培養基中，于黑暗條件下28℃、180r/min搖床中培養，7d后通過4層紗布和兩層濾紙過濾，8000r/min離心10min，上清液即為無菌絲的粗毒素。將提取出的粗毒素用噴霧法處理小菜蛾幼蟲，方法與1.2.3中的一致，每6h記錄一次小菜蛾幼蟲死亡數，計算校正死亡率。培養觀察期間分別以對應的粗毒素保濕，對照采用無菌水處理。

1.4.2不同初始pH值對高毒力菌株產毒的影響

設置pH值為5、6、7、8、9共5個處理，以PDB培養基為基礎培養基培養7d后提取粗毒素，按1.4.1的方法進行提取和處理小菜蛾幼蟲，并記錄數據。

1.4.3不同培養時間對高毒力菌株產毒的影響

設置3、5、7、9d和11d共5個培養日寸間，以PDB培養基為基礎培養基，分別于不同培養時間提取粗毒素，按1.4.1的方法進行提取和處理小菜蛾幼蟲，并記錄數據。

1.5數據處理與分析

試驗數據使用Microsoft Excel進行統計處理并作圖，用SPSS 26.0軟件中Duncan's新復極差法進行差異顯著性比較（Plt;0.05）。

2結果與分析

2.1生防菌株篩選

死亡小菜蛾幼蟲體表菌絲回接培養7～10d后觀察形態，發現從幼蟲體表長出的菌株形態和生長狀況與接種的菌株一致，表明小菜蛾幼蟲死因是受到接種菌株的浸染。小菜蛾幼蟲接種不同菌株的校正死亡率如圖1所示，粉紅粘帚霉SWFUYOO、02號生赤殼屬菌株SWFUY02、淡紫擬青霉SWFUY08對小菜蛾幼蟲均有致死作用，60h時累計校正死亡率分別為98.04%、47.06%和54.90%。綜合比較三種生防菌株對小菜蛾幼蟲的浸染致死率，發現粉紅粘帚霉對小菜蛾幼蟲的浸染致死作用較強。因此，選取粉紅粘帚霉進行后續的毒力測定和產毒條件優化試驗。

2.2高毒力菌株毒力測定

高毒力菌株粉紅粘帚霉SWFUYOO對小菜蛾幼蟲的致死情況如圖2所示。接種60h時，孢子懸浮液濃度為1.0x108個孢子/mL日寸小菜蛾幼蟲校正死亡率可達98%以上，濃度為1.0x104個孢子/mL時校正死亡率為63.33%。可知，小菜蛾幼蟲死亡率隨菌株孢子懸浮液濃度的增加而逐漸增高，致死率與孢子懸浮液濃度呈正相關。

選取孢子濃度為1.0x108個孢子/mL試驗組數據（表1）計算得出，粉紅粘帚霉對小菜蛾幼蟲的半致死時間LT50為30.88h。根據顯著性最高時間段54h時小菜蛾幼蟲死亡率與孢子懸浮液濃度之間的回歸關系可得，粉紅粘帚霉對小菜蛾幼蟲的半致死濃度LC50為4.365x104個孢子/mL（表2）。

2.3高毒力菌株產毒條件優化

2.3.1不同培養基對高毒力菌株產毒的影響四種培養基培養的粉紅粘帚霉毒素發酵濾液——粗毒素對小菜蛾幼蟲的致死力存在一定的差異，但均有毒殺作用（圖3）。其中，SDAY和PDB培養基粗毒素的毒殺作用較強，其次為PSA，Czapek的毒殺作用最弱。可見，四種培養基中SDAY和PDB較有利于粉紅粘帚霉產毒。

2.3.2不同初始pH值對高毒力菌株產毒的影響

以PDB為基礎培養基，設置5、6、7、8、9共5個pH值梯度發酵培養并制備粉紅粘帚霉粗毒素。結果（圖4）顯示，各粗毒素對小菜蛾幼蟲都具有毒殺作用，但致死力存在顯著差異。粉紅粘帚霉粗毒素毒性隨pH值增大呈先增強后減弱趨勢，初始pH值為6時粗毒素毒殺作用最強，據此確定其最適產毒pH值為6。

2.3.3不同培養時間對高毒力菌株產毒的影響

以PDB為基礎培養基，設置3、5、7、9d和11d共5個培養時間梯度發酵培養并制備粉紅粘帚霉粗毒素。結果（圖5）顯示，各粗毒素對小菜蛾幼蟲都有毒性，且隨培養時間延長呈先增強后減弱趨勢，以7d時毒力最強，9d和11d時減弱且兩者間差異不顯著。其原因可能是，粉紅粘帚霉在培養過程中逐漸分泌毒素，培養后期培養基中的營養物質減少，粉紅粘帚霉生長減緩，分泌的毒素隨之減少。據此，確定粉紅粘帚霉產毒的最適培養時間為7d。

3討論與結論

本研究中，供試三種生防菌株粉紅粘帚霉、淡紫擬青霉、02號生赤殼屬對小菜蛾幼蟲都具有毒殺作用。其中，粉紅粘帚霉對小菜蛾幼蟲的生防毒力最強，接種36h時小菜蛾幼蟲校正死亡率為58.37%，接種60h時為98.04%：淡紫擬青霉次之；生赤殼屬最弱。

半致死時間LT50和半致死濃度LC50是衡量生防菌株對寄主毒力的重要指標。甄偉用濃度為107個孢子/mL的球孢白僵菌[Beauveria bassi-ana（Balsamo）

Vuillemin]處理小菜蛾幼蟲，6d時的校正死亡率為87.14%。劉曼等用貴州麻江白僵菌（Beauveria majiangensis）MJ1015菌株對三種金龜子幼蟲的毒力進行測定發現，其LC50分別為4.75x106、1.29x107、2.78x107個孢子/mL，LT50范圍在3.86～13.3d之間。周立等篩選出兩株對斜紋夜蛾有高致病力的球孢白僵菌，其LT50分別為5.01d和5.98d，LC50分別為3.29×107、8.09x107個孢子/mL。本研究中，粉紅粘帚霉對小菜蛾幼蟲的LT50為30.88h，LC50為4.365×104個孢子/mL。同比可見，粉紅粘帚霉對小菜蛾幼蟲具有毒力高、致病速度快等特點，可作為小菜蛾生物防治的優良微生物資源，下一步可對其進行田間防效試驗。

粉紅粘帚霉是自然界中一類重要的寄生菌，可寄生于植物、昆蟲和線蟲活體內，也是一種重要的重寄生菌，除了防治蟲害，還可用于防治病害。許多研究表明，粉紅粘帚霉對草莓、番茄和玫瑰的灰霉病具有很好的防治效果。楊蕊等研究了粉紅粘帚霉對玉米莖基腐病的抑菌防病作用，發現其對玉米莖基腐病具有生防潛力，其孢子液還能在一定程度上提高種子的發芽率和單株鮮重。還有研究表明，粉紅粘帚霉和淡紫擬青霉具有促進植物生長、產生多種功能酶和降解農藥等作用，前者還有望被用于生產生物燃料，具有很大的開發前景。本試驗結果顯示，粉紅粘帚霉的最適產毒培養基為SDAY、PDB，最適產毒pH值為6，最適產毒培養時間為7d。本研究得出的粉紅粘帚霉的產毒優化條件，可為其在生防上進～步開發利用提供理論依據。但本試驗只選取了培養時間、初始pH值和培養基3個條件，更多條件的優化還有待進行：且本試驗只研究了粉紅粘帚霉對小菜蛾幼蟲的毒殺作用，它在其他害蟲上的毒力情況還有待挖掘，后續可對其生防價值展開進一步研究。