小菜蛾幼蟲(chóng)生防菌株毒力測(cè)定及產(chǎn)毒條件優(yōu)化

關(guān)鍵詞：小菜蛾幼蟲(chóng)；生防菌株篩選；毒力測(cè)定；粉紅粘帚霉；產(chǎn)毒條件優(yōu)化

小菜蛾（Plutella xylostellaL．）隸屬于鱗翅目菜蛾科菜蛾屬，又稱(chēng)小青蟲(chóng)、兩頭尖，為害白菜、蘿卜等十字花科蔬菜最為嚴(yán)重。它啃食蔬菜葉片，導(dǎo)致葉片變成網(wǎng)狀，品質(zhì)下降，銷(xiāo)售受到影響。小菜蛾一直在我國(guó)南方省份嚴(yán)重發(fā)生，導(dǎo)致許多蔬菜作物失去原有價(jià)值，一些地區(qū)甚至顆粒無(wú)收，種植戶(hù)們苦不堪言，已成為一種亟待防治的主要害蟲(chóng)之一。

目前，已從化學(xué)防治、物理防治、生物防治以及一些農(nóng)業(yè)防治等領(lǐng)域?qū)π〔硕甑姆乐巫龀鲅芯浚渲猩锓乐问禽^為高效且對(duì)人畜低毒或無(wú)毒的防治方法。有研究表明，蠟蚧輪枝菌（Ver-ticilliu.m lecanii）、球孢白僵菌（Beauveria bassi-ana）及金龜子綠僵菌（Metarhizium anisopliae）菌劑的10倍稀釋液對(duì)小菜蛾都具有很好的防治效果。但關(guān)于粉紅粘帚霉（Clonostachys rosea）、淡紫擬青霉（Purpureocillium lilacinum）、02號(hào)生赤殼屬（Bionectria sp.）菌株防治小菜蛾的研究還未見(jiàn)報(bào)道。粉紅粘帚霉作為一種在世界范圍內(nèi)廣泛分布的絲狀真菌，具有很高的生防潛力。它是自然界中一類(lèi)重要的寄生真菌，可寄生于植物、昆蟲(chóng)和線蟲(chóng)活體內(nèi)，也是一種重要的重寄生菌，除了用于防治蟲(chóng)害外，還可用于防治病害且防治效果較好。蘆俊佳等曾對(duì)粉紅粘帚霉防治楚雄腮扁葉蜂幼蟲(chóng)進(jìn)行過(guò)研究，發(fā)現(xiàn)其具有較好的防治效果。同時(shí)，也有一些研究表明，粉紅粘帚霉對(duì)植物生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用。淡紫擬青霉是很多植物寄生線蟲(chóng)的重要天敵，是一種極具推廣潛力的生防菌和功能菌。孫漫紅等曾報(bào)道過(guò)淡紫擬青霉M-14具有很強(qiáng)的殺線蟲(chóng)活性。Lopez等通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)淡紫擬青霉對(duì)棉花蚜蟲(chóng)有較強(qiáng)防效。02號(hào)生赤殼屬菌株首次被發(fā)現(xiàn)是在對(duì)紅豆杉（Taxus chinensis var. maLrez）內(nèi)生真菌的研究中，被歸類(lèi)為生赤殼科，一系列抑菌試驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)并證明其代謝產(chǎn)物具有明顯的抗菌作用。

真菌的產(chǎn)毒與培養(yǎng)環(huán)境息息相關(guān)，比如培養(yǎng)基類(lèi)型、培養(yǎng)基pH值、培養(yǎng)時(shí)間、光照條件、振蕩培養(yǎng)條件等，對(duì)培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化有利于生防真菌的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用和害蟲(chóng)防治。本研究選用粉紅粘帚霉、淡紫擬青霉、02號(hào)生赤殼屬菌株對(duì)小菜蛾幼蟲(chóng)進(jìn)行噴霧浸染，首先篩選出對(duì)小菜蛾生防效果較好的高毒力菌株，繼而測(cè)定其對(duì)小菜蛾的半致死濃度（LC50）和半致死時(shí)間（LT50），優(yōu)化其產(chǎn)毒條件，以期為小菜蛾的生物防治提供新的微生物資源，為高毒力菌株的開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1供試菌株粉紅粘帚霉SWFUYOO、02號(hào)生赤殼屬菌株SWFUY02、淡紫擬青霉SWFUY08來(lái)源于云南省森林災(zāi)害預(yù)警與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2供試蟲(chóng)源3齡小菜蛾幼蟲(chóng)購(gòu)于濟(jì)源白云實(shí)業(yè)有限公司。

1.1.3儀器與試劑TGL-16G型臺(tái)式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠產(chǎn)品：GXM-358A型光照培養(yǎng)箱，寧波江南儀器廠產(chǎn)品：XB-K-25型血球計(jì)數(shù)板，上海求精生化試劑儀器有限公司產(chǎn)品；MQW-63R型振蕩培養(yǎng)箱，上海曼泉儀器有限公司產(chǎn)品。其他試劑均為分析純。

1.1.4培養(yǎng)基馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dex-trose agar，PDA）培養(yǎng)基：葡萄糖20g，瓊脂粉20g，馬鈴薯200g，蒸餾水1000mL。馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基（potato sucrose agar，PSA）：蔗糖20g，瓊脂粉20g，馬鈴薯200g，蒸餾水1000mL。察氏液體培養(yǎng)基（Czapek）：KN03 2g，KCl0.5g，F(xiàn)eS040.01g，K2 HP041g．MgS04.7H2 00.5g，蒸餾水1000mL。薩氏葡萄糖瓊脂酵母膏（Sachs dex-trose agar yeast，SDAY）：酵母浸粉20g，葡萄糖40g，蛋白胨10g，蒸餾水1000mL。

1.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)及方法

本試驗(yàn)于2023年2月在西南林業(yè)大學(xué)園林園藝學(xué)院實(shí)驗(yàn)室與云南省森林災(zāi)害預(yù)警與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2.1凍存菌株活化培養(yǎng)活化培養(yǎng)所用培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基。將凍存的粉紅粘帚霉、02號(hào)生赤殼屬、淡紫擬青霉進(jìn)行活化，每種菌株活化30皿，恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15～30d待用。

1.2.2孢子懸浮液制備取培養(yǎng)15～30d且長(zhǎng)滿(mǎn)菌絲的培養(yǎng)皿，用含吐溫80的無(wú)菌水進(jìn)行洗脫，多次攪拌，過(guò)濾菌絲得到孢子懸浮液，將三種菌株孢子懸浮液均通過(guò)16格×25格血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)確定孢子濃度為1.0x108個(gè)孢子/mL。計(jì)算公式為：

孢子濃度（個(gè)/mL）=每小方格中孢子平均數(shù)x400x104×稀釋倍數(shù)。

1.2.3生防菌篩選采用噴霧法進(jìn)行。設(shè)置粉紅粘帚霉、淡紫擬青霉、02號(hào)生赤殼屬菌株為試驗(yàn)組，以無(wú)菌水為對(duì)照組，每組重復(fù)3次，每重復(fù)20頭3齡小菜蛾幼蟲(chóng)。小菜蛾幼蟲(chóng)先用無(wú)菌水噴霧處理消毒，處理后吸干水分，然后用三種菌株的孢子懸浮液（1.0x108個(gè)孢子/mL）對(duì)小菜蛾幼蟲(chóng)進(jìn)行噴霧處理，將處理后的小菜蛾幼蟲(chóng)連同蔬菜葉片一起放入墊有濕棉花和用無(wú)菌水濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿中，用透明保鮮膜封閉培養(yǎng)皿后再在透明膜上用針扎70個(gè)小孔。之后三種菌株分別做好標(biāo)記，對(duì)照組編號(hào)為CK，放人培養(yǎng)箱中恒溫恒濕培養(yǎng)，每隔6h觀察一次，記錄死亡蟲(chóng)數(shù)并計(jì)算死亡率。

死亡率（%）=死亡蟲(chóng)數(shù)／試驗(yàn)總蟲(chóng)數(shù)×100；

校正死亡率（%）=（試驗(yàn)組死亡率一對(duì)照組死亡率）／（1-對(duì)照組死亡率）×100。

死亡判定標(biāo)準(zhǔn)：用細(xì)毛筆輕觸小菜蛾腹部，不動(dòng)者視為死亡。

觀察到部分死亡小菜蛾幼蟲(chóng)尸體上長(zhǎng)出菌絲后，挑出菌絲接到新的培養(yǎng)基上，置于恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7～10d．觀察新長(zhǎng)出菌株的形態(tài)特征，并與浸染生防菌株的形態(tài)特征進(jìn)行比較，確定小菜蛾幼蟲(chóng)死因是生防菌株浸染所致。

1.3高毒力菌株毒力測(cè)定

對(duì)預(yù)先培養(yǎng)的生長(zhǎng)良好的高毒力菌株進(jìn)行洗脫，確定孢子懸浮液濃度。設(shè)置測(cè)定半致死濃度的孢子懸浮液濃度梯度為1.0x104、1.0x105、1.0x106、1.0x107、1.0x108個(gè)孢子/mL。測(cè)定半致死時(shí)間的孢子懸浮液濃度為1.0x108個(gè)孢子/mL。制備好的孢子懸浮液用1.2.3的方法進(jìn)行處理，并觀察記錄數(shù)據(jù)。

1.4高毒力菌株產(chǎn)毒條件優(yōu)化

1.4.1不同培養(yǎng)基對(duì)高毒力菌株產(chǎn)毒的影響選用不加瓊脂的PDA培養(yǎng)基（以下用PDB表不）、PSA培養(yǎng)基、SDAY培養(yǎng)基、Czapek液體培養(yǎng)基進(jìn)行測(cè)定。挑取3塊5 mm的高毒力菌株菌餅放于配制好的培養(yǎng)基中，于黑暗條件下28℃、180r/min搖床中培養(yǎng)，7d后通過(guò)4層紗布和兩層濾紙過(guò)濾，8000r/min離心10min，上清液即為無(wú)菌絲的粗毒素。將提取出的粗毒素用噴霧法處理小菜蛾幼蟲(chóng)，方法與1.2.3中的一致，每6h記錄一次小菜蛾幼蟲(chóng)死亡數(shù)，計(jì)算校正死亡率。培養(yǎng)觀察期間分別以對(duì)應(yīng)的粗毒素保濕，對(duì)照采用無(wú)菌水處理。

1.4.2不同初始pH值對(duì)高毒力菌株產(chǎn)毒的影響

設(shè)置pH值為5、6、7、8、9共5個(gè)處理，以PDB培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)7d后提取粗毒素，按1.4.1的方法進(jìn)行提取和處理小菜蛾幼蟲(chóng)，并記錄數(shù)據(jù)。

1.4.3不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)高毒力菌株產(chǎn)毒的影響

設(shè)置3、5、7、9d和11d共5個(gè)培養(yǎng)日寸間，以PDB培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別于不同培養(yǎng)時(shí)間提取粗毒素，按1.4.1的方法進(jìn)行提取和處理小菜蛾幼蟲(chóng)，并記錄數(shù)據(jù)。

1.5數(shù)據(jù)處理與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Microsoft Excel進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理并作圖，用SPSS 26.0軟件中Duncan's新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性比較（Plt;0.05）。

2結(jié)果與分析

2.1生防菌株篩選

死亡小菜蛾幼蟲(chóng)體表菌絲回接培養(yǎng)7～10d后觀察形態(tài)，發(fā)現(xiàn)從幼蟲(chóng)體表長(zhǎng)出的菌株形態(tài)和生長(zhǎng)狀況與接種的菌株一致，表明小菜蛾幼蟲(chóng)死因是受到接種菌株的浸染。小菜蛾幼蟲(chóng)接種不同菌株的校正死亡率如圖1所示，粉紅粘帚霉SWFUYOO、02號(hào)生赤殼屬菌株SWFUY02、淡紫擬青霉SWFUY08對(duì)小菜蛾幼蟲(chóng)均有致死作用，60h時(shí)累計(jì)校正死亡率分別為98.04%、47.06%和54.90%。綜合比較三種生防菌株對(duì)小菜蛾幼蟲(chóng)的浸染致死率，發(fā)現(xiàn)粉紅粘帚霉對(duì)小菜蛾幼蟲(chóng)的浸染致死作用較強(qiáng)。因此，選取粉紅粘帚霉進(jìn)行后續(xù)的毒力測(cè)定和產(chǎn)毒條件優(yōu)化試驗(yàn)。

2.2高毒力菌株毒力測(cè)定

高毒力菌株粉紅粘帚霉SWFUYOO對(duì)小菜蛾幼蟲(chóng)的致死情況如圖2所示。接種60h時(shí)，孢子懸浮液濃度為1.0x108個(gè)孢子/mL日寸小菜蛾幼蟲(chóng)校正死亡率可達(dá)98%以上，濃度為1.0x104個(gè)孢子/mL時(shí)校正死亡率為63.33%。可知，小菜蛾幼蟲(chóng)死亡率隨菌株孢子懸浮液濃度的增加而逐漸增高，致死率與孢子懸浮液濃度呈正相關(guān)。

選取孢子濃度為1.0x108個(gè)孢子/mL試驗(yàn)組數(shù)據(jù)（表1）計(jì)算得出，粉紅粘帚霉對(duì)小菜蛾幼蟲(chóng)的半致死時(shí)間LT50為30.88h。根據(jù)顯著性最高時(shí)間段54h時(shí)小菜蛾幼蟲(chóng)死亡率與孢子懸浮液濃度之間的回歸關(guān)系可得，粉紅粘帚霉對(duì)小菜蛾幼蟲(chóng)的半致死濃度LC50為4.365x104個(gè)孢子/mL（表2）。

2.3高毒力菌株產(chǎn)毒條件優(yōu)化

2.3.1不同培養(yǎng)基對(duì)高毒力菌株產(chǎn)毒的影響四種培養(yǎng)基培養(yǎng)的粉紅粘帚霉毒素發(fā)酵濾液——粗毒素對(duì)小菜蛾幼蟲(chóng)的致死力存在一定的差異，但均有毒殺作用（圖3）。其中，SDAY和PDB培養(yǎng)基粗毒素的毒殺作用較強(qiáng)，其次為PSA，Czapek的毒殺作用最弱。可見(jiàn)，四種培養(yǎng)基中SDAY和PDB較有利于粉紅粘帚霉產(chǎn)毒。

2.3.2不同初始pH值對(duì)高毒力菌株產(chǎn)毒的影響

以PDB為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，設(shè)置5、6、7、8、9共5個(gè)pH值梯度發(fā)酵培養(yǎng)并制備粉紅粘帚霉粗毒素。結(jié)果（圖4）顯示，各粗毒素對(duì)小菜蛾幼蟲(chóng)都具有毒殺作用，但致死力存在顯著差異。粉紅粘帚霉粗毒素毒性隨pH值增大呈先增強(qiáng)后減弱趨勢(shì)，初始pH值為6時(shí)粗毒素毒殺作用最強(qiáng)，據(jù)此確定其最適產(chǎn)毒pH值為6。

2.3.3不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)高毒力菌株產(chǎn)毒的影響

以PDB為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，設(shè)置3、5、7、9d和11d共5個(gè)培養(yǎng)時(shí)間梯度發(fā)酵培養(yǎng)并制備粉紅粘帚霉粗毒素。結(jié)果（圖5）顯示，各粗毒素對(duì)小菜蛾幼蟲(chóng)都有毒性，且隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)呈先增強(qiáng)后減弱趨勢(shì)，以7d時(shí)毒力最強(qiáng)，9d和11d時(shí)減弱且兩者間差異不顯著。其原因可能是，粉紅粘帚霉在培養(yǎng)過(guò)程中逐漸分泌毒素，培養(yǎng)后期培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)減少，粉紅粘帚霉生長(zhǎng)減緩，分泌的毒素隨之減少。據(jù)此，確定粉紅粘帚霉產(chǎn)毒的最適培養(yǎng)時(shí)間為7d。

3討論與結(jié)論

本研究中，供試三種生防菌株粉紅粘帚霉、淡紫擬青霉、02號(hào)生赤殼屬對(duì)小菜蛾幼蟲(chóng)都具有毒殺作用。其中，粉紅粘帚霉對(duì)小菜蛾幼蟲(chóng)的生防毒力最強(qiáng)，接種36h時(shí)小菜蛾幼蟲(chóng)校正死亡率為58.37%，接種60h時(shí)為98.04%：淡紫擬青霉次之；生赤殼屬最弱。

半致死時(shí)間LT50和半致死濃度LC50是衡量生防菌株對(duì)寄主毒力的重要指標(biāo)。甄偉用濃度為107個(gè)孢子/mL的球孢白僵菌[Beauveria bassi-ana（Balsamo）

Vuillemin]處理小菜蛾幼蟲(chóng)，6d時(shí)的校正死亡率為87.14%。劉曼等用貴州麻江白僵菌（Beauveria majiangensis）MJ1015菌株對(duì)三種金龜子幼蟲(chóng)的毒力進(jìn)行測(cè)定發(fā)現(xiàn)，其LC50分別為4.75x106、1.29x107、2.78x107個(gè)孢子/mL，LT50范圍在3.86～13.3d之間。周立等篩選出兩株對(duì)斜紋夜蛾有高致病力的球孢白僵菌，其LT50分別為5.01d和5.98d，LC50分別為3.29×107、8.09x107個(gè)孢子/mL。本研究中，粉紅粘帚霉對(duì)小菜蛾幼蟲(chóng)的LT50為30.88h，LC50為4.365×104個(gè)孢子/mL。同比可見(jiàn)，粉紅粘帚霉對(duì)小菜蛾幼蟲(chóng)具有毒力高、致病速度快等特點(diǎn)，可作為小菜蛾生物防治的優(yōu)良微生物資源，下一步可對(duì)其進(jìn)行田間防效試驗(yàn)。

粉紅粘帚霉是自然界中一類(lèi)重要的寄生菌，可寄生于植物、昆蟲(chóng)和線蟲(chóng)活體內(nèi)，也是一種重要的重寄生菌，除了防治蟲(chóng)害，還可用于防治病害。許多研究表明，粉紅粘帚霉對(duì)草莓、番茄和玫瑰的灰霉病具有很好的防治效果。楊蕊等研究了粉紅粘帚霉對(duì)玉米莖基腐病的抑菌防病作用，發(fā)現(xiàn)其對(duì)玉米莖基腐病具有生防潛力，其孢子液還能在一定程度上提高種子的發(fā)芽率和單株鮮重。還有研究表明，粉紅粘帚霉和淡紫擬青霉具有促進(jìn)植物生長(zhǎng)、產(chǎn)生多種功能酶和降解農(nóng)藥等作用，前者還有望被用于生產(chǎn)生物燃料，具有很大的開(kāi)發(fā)前景。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，粉紅粘帚霉的最適產(chǎn)毒培養(yǎng)基為SDAY、PDB，最適產(chǎn)毒pH值為6，最適產(chǎn)毒培養(yǎng)時(shí)間為7d。本研究得出的粉紅粘帚霉的產(chǎn)毒優(yōu)化條件，可為其在生防上進(jìn)～步開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。但本試驗(yàn)只選取了培養(yǎng)時(shí)間、初始pH值和培養(yǎng)基3個(gè)條件，更多條件的優(yōu)化還有待進(jìn)行：且本試驗(yàn)只研究了粉紅粘帚霉對(duì)小菜蛾幼蟲(chóng)的毒殺作用，它在其他害蟲(chóng)上的毒力情況還有待挖掘，后續(xù)可對(duì)其生防價(jià)值展開(kāi)進(jìn)一步研究。