基于超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質譜篩查茶葉中166種農藥殘留方法研究

方俊蘭，張丹陽，伊岳星，劉穎穎，柴云峰，李祖光*，陳紅平*

（1.中國農業科學院茶葉研究所，浙江 杭州 310008；2.浙江工業大學 化學工程學院，浙江 杭州 310014）

茶葉是世界上僅次于水的消費最廣泛的飲料。茶葉中富含茶多酚、氨基酸、黃酮、茶多糖等營養功能性物質，不僅形成了茶葉特色風味品質，而且賦予茶葉降血壓、抗菌、預防腫瘤等功效［1-2］。茶樹喜溫濕環境，易發生病蟲草害，不可避免使用化學農藥以提高茶葉產量與質量［3-4］。茶葉中化學農藥殘留問題一直備受關注，包括我國在內的許多國家和地區通過規定茶葉中的最大殘留限量（MRLs）［5］對茶葉農藥殘留進行監測，以避免不合格茶葉產品被消費者飲用。我國國家標準GB 2763.1-2022［6］規定了茶葉中110 種農藥的MRLs，歐盟、日本分別規定了508 種、236 種農藥的MRLs，并采用“一律標準”規定其他農藥的MRLs 為0.01 mg/kg［7-8］。因此，建立茶葉中農藥殘留的高通量檢測與篩查技術是確保茶葉飲用安全與出口安全的基本技術條件。

色譜和質譜結合的方法是茶葉中農藥殘留檢測的通用方法，包括氣相色譜-質譜（GC-MS）和液相色譜-質譜（LC-MS）等。目前，氣相色譜或液相色譜串聯三重四極桿質譜（LC-MS/MS 或GC-MS/MS）由于其高靈敏度和選擇性，已廣泛用于茶葉中農藥的多殘留分析［9-10］。三重四極桿串聯質譜能夠在一次運行中對100 多種目標分析物進行高選擇性和高靈敏度的定量和確認，但需對大量化合物的相關參數進行優化且同時監測的化合物數量有上限，不適用于非靶向高通量篩選［11］。高分辨質譜儀（HRMS），包括飛行時間質譜（TOF MS）和四極桿/靜電場軌道阱質譜（Orbitrap MS），具有質量范圍廣、分辨率和質量精度高、分析速度快的優點，可在全掃描模式下采集多組分、多離子信息，實現化合物的非靶向篩選和可追溯性分析［11］，因而廣泛用于環境、食品等不同基質中農藥的高通量檢測與篩查［12-13］。

基于液相色譜-高分辨質譜技術檢測茶葉中農藥殘留的研究較多，農藥殘留檢測數量與種類不斷擴增，定性定量功能更加完善，并逐漸由靶向篩查過渡到非靶向篩查的新階段，顯著提升了茶葉中農藥殘留高通量檢測水平。盧巧梅［14］建立了茶葉中18 種農藥的高效液相色譜-飛行時間質譜（HPLC-TOF MS）檢測方法，Zhang 等［15］建立了茶葉中8 種新煙堿類與4 種氟蟲腈農藥的超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質譜（UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS）檢測方法，金莉莉等［16］建立了UHPLC-QExactive Orbitrap MS 測定茶葉中21 種農藥的檢測方法，張蓉等［17］建立了茶葉中95 種農藥的UHPLC-QExactive Orbitrap MS 檢測方法，Chen 等［18］建立了茶葉中117 種農藥的UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS 檢測與篩查方法。上述方法的線性范圍、精密度與靈敏度等關鍵指標可與LC-MS/MS 方法相媲美，但UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS 在定性分析、陽性樣品確證等性能上優于LC-MS/MS。

茶葉富含非揮發性化學成分，在電噴霧離子源中會增強或抑制靶標物質離子化，在定量分析中易產生基質效應（ME）［19］，成為液相色譜-電噴霧離子源質譜用于農藥殘留痕量分析的難點。由于加工工藝差異，導致茶葉的基礎物質在不同種類茶葉之間存在較大差異，如發酵工藝顯著影響茶多酚、茶多糖等特征組分含量，從而呈現出不同茶葉中農藥殘留電噴霧質譜檢測的基質效應差異，然而目前UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS 分析不同茶葉中農藥殘留的基質效應研究甚少，農藥殘留高分辨質譜數據庫有待進一步完善。本文根據我國新修訂的國家標準GB 2763.1-2022［6］規定的茶葉中農藥最大殘留限量、茶樹上已登記農藥、國內外茶葉質量安全通報的農藥，建立了針對茶葉樣品的農藥殘留高通量篩查與定量分析方法。通過對農藥標準物質的分析，建立農藥質譜數據庫。采用UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS 結合TraceFinder 軟件進行篩查分析、方法學驗證及基質效應評價，并應用建立的方法分析市場上部分茶葉的農藥殘留情況。本方法可用于茶葉中農藥殘留的高通量篩查分析，具有快速、高效的特點，可為化學污染物殘留的高通量篩查檢測提供參考。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

四極桿/靜電場軌道阱高分辨質譜儀（Q-Exactive-Orbitrap HRMS，美國Thermo Fisher 公司）；超高效液相色譜儀（Ultimate 3 000 UHPLC，美國Thermo Fisher 公司）；多管渦旋混合儀（杭州米歐儀器有限公司）；高速冷凍離心機（德國Sigma 公司）；Milli-Q 去離子水發生器（美國Millipore 公司）。使用Xcalibur? 2.2.1版本和TraceFinder 3.3版本（Thermo Fisher Scientific 公司）處理數據。

166 種農藥標準品（1 000 mg/L）購自農業農村部環境質量監督檢驗測試中心（天津）；乙腈（HPLC級，上海Sigma-Aldrich貿易有限公司）；實驗用水由Milli-Q 去離子水發生器（美國Millipore公司）純化。醋酸鈉、無水硫酸鎂（分析純，浙江醫藥股份有限公司）；異丙基乙二胺（PSA）和石墨化炭黑（GCB）（Bonna-Agela Technologies，天津）。樣品來源：茶葉樣品從流通市場抽取采集，包括綠茶和紅茶。

1.2 儀器分析條件

色譜條件：采用Waters Acquity UPLC HSS T3 色譜柱（100 mm × 2.1 mm，1.8 μm），柱溫為35 ℃。流動相為含0.1%甲酸和1 mmol/L 甲酸銨的水溶液（A 相）及乙腈（B 相），洗脫程序為：0～5 min，95%～50% A；5～18 min，50%～5% A；18～23.1 min，5%～95% A。流速為0.3 mL/min，進樣量為1 μL。

質譜條件：采用可加熱電噴霧離子源（HESI）；檢測模式為正離子模式，電磁頻率為50 Hz，噴霧電壓為3 kV，毛細管溫度為320 ℃，加熱電壓器溫度為300 ℃，鞘氣（N2＞99%）流速為35 arb，輔助氣（N2＞99%）流速為12 arb，掃描模式為全掃描（Full MS）以及全掃描/二級掃描（Full MS/dd-MS2）模式，質譜掃描范圍為m/z75～750 ，Full MS 與dd-MS2分辨率分別為70 000 與35 000 FWHM（m/z200），階梯標準化碰撞能量（NCEs）為30、50、70 eV。

1.3 實驗步驟

1.3.1 數據庫的建立采用UPLC Q-Exactive Orbitrap MS 對200 μg/L 農藥的混合標準溶液進行分析，在Full MS 模式下獲得精確質量信息。Xcalibur 軟件采集質量數和保留時間。將所有農藥的名稱、分子式、保留時間、精確質量數、碎片離子質量數等信息制作成Excel 表格，導入TraceFinder3.3 軟件，建立農藥質譜數據庫。

1.3.2 樣品前處理茶葉樣品采用改良QuEChERS 前處理方法。稱取研磨后的茶葉試樣2 g（精確至0.01 g）于50 mL離心管中，每個離心管中加入5 mL水和10 mL乙腈。超聲15 min后加入6 g無水硫酸鎂和1.5 g醋酸鈉，在10 000 r/min條件下離心5 min。取2 mL上清液加入含有200 mg PSA和50 mg GCB的2 mL離心管中，渦旋1 min，在10 000 r/min條件下離心5 min。最后將上清液過膜轉移至進樣瓶。

1.3.3 農藥化合物的篩查與鑒定凈化后的樣品在“1.2”條件下進行分析，將數據導入TraceFinder與建立的農藥數據庫對比。

1.3.4 標準曲線及線性范圍測試綠茶和紅茶2個品種的空白樣品經前處理后得到空白提取液，配制質量濃度分別為2、4、10、20、40、100、200 μg/L的基質標準溶液。以色譜峰面積與對應的質量濃度進行線性回歸，考察線性關系并評價基質效應。

1.3.5 方法學驗證選取綠茶與紅茶空白樣品進行回收率實驗，分別添加10、20、25、50 μg/kg的混合標準溶液，每個濃度平行5 次，按照“1.3.2”進行前處理后在“1.2”條件下進行儀器分析，并評價該方法的精密度和準確度。

1.4 實際樣品篩查檢測

選取20份實際茶葉樣品（包括14份綠茶、6份紅茶），應用本方法進行定性及定量檢測。

2 結果與討論

2.1 高分辨質譜數據信息采集與數據庫構建

UHPLC Q-Exactive Orbitrap MS 包含多種監測模式，一般采用Full MS 和Full MS/dd-MS2模式進行定性篩選和定量分析［20］。其中，Full MS/dd-MS2可提供更多的碎片離子信息，有利于目標化合物的鑒定，但會導致單個碎片離子的掃描時間下降，進而使得靈敏度下降［21］。因此采集農藥化合物的數據信息時首先選擇Full MS模式以獲得更高的靈敏度，但在陽性樣品確證時采用Full MS/dd-MS2掃描模式。

構建農藥化合物數據庫是進行高通量篩選的基礎，前體離子的精確質量、碎片離子的精確質量和保留時間是數據庫中的關鍵參數。采集農藥混合標準品數據，獲得總離子流圖（如圖1）。對于每種農藥，將質子化離子（［M+H］+）的精確質量數輸入Xcalibur Qual Browser，作為特征離子信息。對于確定的前體離子，一般選取至少兩個碎片離子的理論質量。開發的質譜數據庫見表1，包含166 種農藥的名稱、化學式、保留時間、前體離子的精確質量、碎片離子的精確質量信息。質量精度是高分辨率質量測量的一個重要參數，SANTE 文件建議m/z＞200 的質量精度＜5 ppm，m/z＜200 的精度＜1 mDa［22］。經計算，數據庫中所有農藥化合物的質量精度均小于5 ppm。將這些信息整合在Microsoft Excel 模板中，然后導入TraceFinder 3.3創建可使用的篩查方法。

圖1 166種農藥混合標準溶液（200 μg/L）的總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram（TIC） of 166 pesticides in the mixture standard solution at 200 μg/L

2.2 基質效應

選取紅茶、綠茶兩個茶葉樣品，作為空白基質進行前處理凈化，獲得空白基質提取液。分別使用乙腈和空白基質提取液配制7個質量濃度的混合標準溶液，按照“1.3.3”進行篩查分析，得到溶劑和不同茶葉基質中農藥殘留的線性方程及相關系數。

（續表1）

通過比較由空白基質配制的標準溶液和乙腈制備的標準溶液得到的標準曲線斜率來評估基質效應（ME）。計算公式為：ME（%）=(基質標準溶液曲線的斜率/溶劑標準溶液曲線的斜率-1）×100。

根據制作工藝的不同茶葉可分為六大類，受遺傳、環境和生產加工等因素的影響，不同類型茶葉中基質成分存在明顯差異。因此，不同茶葉中農藥的基質效應不盡相同［15］。如圖2 所示，綠茶和紅茶中不同農藥的基質效應分別為-56%～63%、-19%～110%。綠茶和紅茶基質中分別有79 種農藥（48%）和20 種農藥（12%）的基質效應介于-20%～20%。根據SANTE/11312/2021［23］，ME在±20%的范圍內表明基質效應可忽略，可通過溶劑標準曲線進行定量?？傮w上，紅茶比綠茶的基質增強效應更強，表明不同加工方式對茶葉基質效應具有影響。因此本研究采用空白基質溶液定量，以校正基質效應產生的定量偏差。

圖2 綠茶與紅茶中166種農藥在不同基質中的基質效應Fig.2 Matrix effects of 166 pesticides in green tea and black tea

2.3 方法驗證

按照“1.3.4”方法進行線性關系評價，結果表明，綠茶中氟環唑、乙嘧硫磷、丁苯嗎啉、魚藤酮、噻嗪酮、乙霉威、喹螨醚、仲丁威、苯銹啶、唑螨酯、抗蚜威、烯丙苯噻唑、氟唑環菌胺、蟲酰肼和甲基硫菌靈15 種農藥在4～200 μg/L 范圍內線性良好，其余151 種農藥在2～200 μg/L 范圍內線性良好；紅茶中166種農藥在2～200 μg/L范圍內線性良好；相關系數（r）均大于0.99。

以綠茶和紅茶為基質，按照“1.3.5”方法進行加標回收實驗。綠茶樣品中151種農藥和紅茶樣品中166 種農藥的加標回收率均在70%～130%之間。在綠茶樣品中166 種農藥的RSD 均小于22%，其中150種（99%）農藥的RSD在20%以下；在紅茶樣品中166種農藥的RSD均小于29%，其中144種（87%）農藥的RSD 在20%以下。結果表明，該方法的準確度和精密度良好，可用于茶葉中農藥殘留的篩查。根據線性范圍、相關系數及回收率滿足70%～130%，且RSD小于20%的要求，可知綠茶中氟環唑、乙嘧硫磷、丁苯嗎啉、魚藤酮4 種農藥的定量下限為20 μg/kg，噻嗪酮、乙霉威、喹螨醚、仲丁威、苯銹啶、唑螨酯、抗蚜威、烯丙苯噻唑、氟唑環菌胺、蟲酰肼、甲基硫菌靈11 種農藥的定量下限為25 μg/kg，其余151種農藥的定量下限為10 μg/kg；紅茶中166種農藥的定量下限均為10 μg/kg。

2.4 實際樣品分析

為驗證本方法在日常茶葉中農藥殘留檢測的適用性，將其應用于綠茶與紅茶樣品的實際篩查。對20 份樣品（14 份綠茶，6 份紅茶）進行分析，有4 份綠茶樣品（28%）檢出9 種農藥，含量為0.001 1～0.137 4 mg/kg；有3 份紅茶樣品（50%）檢出9 種農藥，含量為0.001 1～0.233 7 mg/kg，均未超過國家標準最大殘留限量。綠茶中吡蟲啉的檢出率最高（25%），紅茶中吡蟲啉、啶蟲脒、噻嗪酮的檢出率均為25%。

高分辨質譜最大的優勢在于可獲得二級碎片離子以及離子精確質量數，這對于鑒定化合物十分有利。農藥化合物的鑒定過程以噻嗪酮為例，其化學式為C16H23N3OS，在電噴霧正離子模式下可獲得穩定的［M+H］+加合離子峰，精確質量為m/z306.163 6，根據精確質量數可找出保留時間為13.76 min 的色譜峰（如圖3）。在Full MS 模式下標準溶液和實際樣品的一級質譜圖中均存在精確前體離子，m/z分別為306.163 8 和306.163 6（如圖4A、B）。確證農藥化合物時采用Full MS/dd-MS2模式以獲取更多碎片信息。標準溶液和實際樣品在該模式下獲得的m/z60～240 前體離子生成的二級譜圖如圖4C、D 所示，對比可發現噻嗪酮離子的質量精度和豐度與標準溶液中噻嗪酮離子幾乎一致。實際樣品中存在m/z86.060 2、m/z106.065 4、m/z116.053 1、m/z145.043 3和m/z201.106 0的碎片離子，且其質量誤差均小于5×10-6。

圖3 實際樣品的總離子流圖及噻嗪酮保留時間為13.76 min時的色譜峰Fig.3 Total ion current diagram of a actual sample and the chromatographic peak of buprofezin at retention time of 13.76 min

根據碎片離子信息可對噻嗪酮的裂解方式進行推測（如圖5）：首先在雜原子S上加合氫離子成為前體離子，然后發生由正電荷引起的i斷裂或氫重排。所有碎片離子信息與二級譜圖信息對應，可以進一步確證化合物的存在。

3 結 論

本研究基于超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質譜技術，建立了同時測定茶葉中166種農藥殘留的分析方法。利用農藥標準品，構建了166 種農藥的分子離子、特征碎片離子以及二級質譜的譜庫。目標農藥在UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS 的Full Scan 監測模式下，采用分子離子質子化［M+H］+為定量離子，特征碎片離子及二級質譜離子為定性離子。評價了綠茶與紅茶進行UHPLC-QExactive Orbitrap MS 分析時的基質效應。方法驗證結果表明，本方法準確、可靠，操作簡便、快速，可應用于茶葉中農藥多殘留的檢測，也可為其他化學污染物殘留的高通量篩查檢測提供參考。