Neuritin結構組成分析及其相互作用蛋白生物信息學預測

李煜　孟平平　王宿潔　朱禮彥　朱金輝　陳仁偉　楊磊

摘要：目的 對Neuritin的理化性質及結構組成，蛋白質相互作用網絡進行生物信息學預測分析，為進一步研究Neuritin的功能和作用機制提供新的思路與方向。方法 應用Protscale 和ProtParam、TMHMM、SignalP、PSORTⅡ、NetNGlyc、NetOGlyc 和 Netphos等軟件，分析Neuritin的理化性質、跨膜結構、信號肽結構、亞細胞定位以及翻譯后修飾位點；利用Protean、tFold以及AlaphFold等軟件和數據庫，分析Neuritin的二級和三級結構；同時，利用STRING數據庫構建Neuritin蛋白質相互作用網絡。結果 Neuritin的相對分子質量為15 332.77，理論等電點（PI）為6.54。不穩定系數27.26，屬于較穩定蛋白；脂肪系數98.31；總平均親水性0.208，屬于疏水性蛋白；Neuritin表達產物N端27個氨基酸為信號肽，C端27個氨基酸為GPI錨定序列，為跨膜區；其亞細胞定位及可能性分別為胞外（34.8%）、細胞膜（34.8%）、內質網（17.4%）及高爾基體（13.0%）；無N糖基化及O糖基化位點，存在11個磷酸化位點；由5段α-螺旋構成其主體結構；相互作用蛋白網絡包括離子型谷氨酸受體AMPA（Gria）家族、嗅覺介導素（Olfm）家族等10個蛋白。結論 Neuritin為經典的分泌蛋白，具有多個磷酸化氨基酸殘基的潛在位點，整體呈現疏水性質，可能通過Gria蛋白家族發揮興奮性突觸傳遞作用，通過Cacng2蛋白調控胞內鈣通路產生生物學效應，本研究為進一步探討Neuritin的功能及發揮作用的機制提供了依據。

關鍵詞：Neuritin；理化性質；結構預測；蛋白質相互作用網絡；生物信息學

中圖分類號：R34中圖分類號文獻標志碼：A文獻標識碼

Structural composition analysis of Neuritin and bioinformatics prediction of

its interactive proteins

LI? Yu1，MENG? Pingping1，WANG? Sujie1，ZHU? Liyan1，ZHU? Jinhui1，CHEN? Renwei2，YANG? Lei2*

（1 School of Medicine， Shihezi University， Shihezi，Xinjiang 832000，China; 2 Department of Medicine， Hangzhou Normal

University， Hangzhou，Zhejiang 310036，China）

Abstract： ?Objective To predict and analyze the physical and chemical properties， structural composition and protein-protein interaction network of Neuritin by bioinformatics， so as to provide new ideas and directions for the further study of the function and mechanism of Neuritin. Methods The physicochemical properties， transmembrane structure， signal peptide structure， subcellular localization and post-translational modification sites of Neuritin were analyzed by using Protscale and Protparam， TMHMM， Signalp， PSORTⅡ， NetNGlyc， NetOGlyc and Netphos software. Analyze the secondary and tertiary structure of Neuritin by using Protean， tFold， AlaphFold and other software and databases; Meanwhile， the Neuritin protein interaction network was constructed by using string database.Results The relative molecular weight of Neuritin was 15 332.77， the theoretical isoelectric point （PI） was 6.54and the theoretical isoelectric point （PI） was 6.54. The instability coefficient is 27.26， which belongs to a relatively stable protein. The fat coefficient is 98.31. The total average hydrophilicity is 0.208， which belongs to hydrophobic protein. The N-terminal 27 amino acids of Neuritin expression product are signal peptides， and the C-terminal 27 amino acids are GPI anchored sequences， which are transmembrane regions. The subcellular localization and possibility were extracellular （34.8%）， cell membrane （34.8%）， endoplasmic reticulum （17.4%） and Golgi apparatus （13.0%）. There were 11 potential phosphorylation sites of amino acid residues without N-glycosylation and O-glycosylation sites. By five α-paragraphs the spiral forms its main structure. The interacting protein network includes 10 proteins such as glutamate AMPA ion channel receptor （Gria） family and olfactory mediators （Olfm） family. Conclusion Neuritin is a classic secretory protein with multiple phosphorylation sites and hydrophobic properties. It may play the role of excitatory synaptic transmission through Gria protein family and regulate the intracellular calcium pathway through Cacng2 protein to produce biological effects. This study provides a basis for further exploring the function and mechanism of Neuritin.

Key words： Neuritin;physical and chemical properties;structural prediction;protein protein interaction network;bioinformatics

隨著脊髓損傷（Spinal cord injury， SCI）、阿爾茲海默病（Alzheimers disease， AD），腦血管意外（Cerebrovascular accident， CVA）等疾病呈現高發生率、高致殘率等特點，神經退行性疾病已成為威脅人類生存質量的主要疾患［1-3］。提高受損神經的修復能力，改善患者的生存質量，成為亟待解決的嚴重社會問題和科學問題。治療神經系統疾患的關鍵是有效地維持神經元的存活、促進突起生長并建立新的突觸聯系，各種神經營養因子在上述過程中發揮著非常重要的作用。Neuritin是在神經發育和可塑性中發揮重要作用的神經營養因子，能夠明顯促進神經突起的生長及其分支形成和突觸的發育成熟［4］，調節突觸回路的形成［5］；并可抑制凋亡，維持神經元的存活，可能是胚胎發育中唯一維持神經元存活的神經營養因子［6］。研究顯示Neuritin與損傷后的神經再生和修復、學習記憶密切相關，是神經生長因子（Nerve growth factor， NGF）、腦源性神經營養因子（Brain-derived neurotrophic factor， BDNF）、雄激素發揮作用的重要效應因子［7］，且能改善AD模型鼠的認知功能。由此可見，Neuritin與神經網絡和突觸環路的形成密切相關，是影響生物體學習記憶的重要因子。但當前對Neuritin的研究主要集中在其表達水平與生物學功能方面，對其結構與功能的關系尚待進一步研究，對其發揮生物學功能的具體機制及下游相互作用蛋白尚不清楚。為進一步研究Neuritin的性質，探討其發揮生物學功能的方式及下游相關相互作用蛋白，對其進行結構組成分析及生物信息學預測研究。

本研究通過應用多種生物信息學軟件對Neuritin的理化性質、結構、功能及相互作用等進行分析，通過組成分析明確Neuritin蛋白的基本性質，通過結構預測判斷Neuritin主要的功能基團，觀察其結構骨架，通過相互作用蛋白分析預測Neuritin的作用靶點，推測其可能發揮作用的機制，為進一步研究Neuritin的功能與作用機制提供新的思路與方向。

1 材料與方法

1.1 Neuritin理化性質及序列分析

在National Center for Biotechnology Information（NCBI）網站獲取Neuritin的氨基酸序列，其GeneBank登錄號為AAF62371.1。應用在線軟件ExPASY ProtParam（https：//web.expasy.org/ protparam /）分析Neuritin理化性質和一級結構，應用ExPASY ProtScale分析Neuritin親疏水性（https：//web.expasy.org/protscale/）［8］。此外，利用SignalP 5.0 Server對Neuritin進行信號肽序列分析，判斷標準為SP值是否高于0.5；同時利用CS值尋找剪切位點［9］。通過TMHMM Server v. 2. 0進行 PLAC8 跨膜區域分析（https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？TMHMM-2.0）［10］。利用 PSORTⅡ進行PLAC8 亞細胞定位分析（https：//psort.hgc.jp/form2.html）。

1.2 Neuritin二級及三級結構預測

應用Protean軟件Garnier-Robson、Chou-Fasman及Karplus-Schulz方法預測Neuritin蛋白二級結構。使用tFold利用從頭合成原理預測Neuritin蛋白三級結構［11］；同時，利用Alaphfold開源數據庫獲取Neuritin蛋白全長預測結構［12-13］。

1.3 Neuritin翻譯后修飾位點分析

利用在線軟件NetNGlyc 1.0 Server［14］及NetOGlyc 4.0 Server［15］進行N-糖基化位點和O-糖基化位點分析，利用Netphos 2. 0 Server［16］對Neuritin的磷酸化位點進行分析。

1.4 Neuritin相互作用蛋白預測

通過STRING數據庫尋找與 PLAC8 相互作用的蛋白并構建蛋白質相互作用網絡，設置為高置信度，置信度score值為0.9，蛋白數量少于10［17］。

2 結果

2.1 Neuritin活性片段的理化性質

ExPASY ProtParam分析結果顯示，Neuritin全長142個氨基酸，相對分子質量為15332.77，理論等電點（PI）為6.54。組成Neuritin的氨基酸共20種，其中亮氨酸（Leu）含量最高，為14.8%，含量最少為組氨酸，僅0.7%（圖1）。當Neuritin 6個半胱氨酸全部游離情況下、消光系數為1.465；在6個半胱氨酸全部形成二硫鍵情況下、消光系數為1.489；不穩定系數27.26，屬于較穩定蛋白，脂肪系數98.31；總平均親水性0.208，整體親水。此外，ExPASY ProtScale分析Neuritin親疏水性結果顯示，可見Neuritin總體疏水區大于親水區，其中疏水性最大的為第14位亮氨酸，分值為2.533；親水性最大的為第96位賴氨酸，分值為-2.633（圖2）。

2.2 Neuritin的序列分析

對Neuritin進行序列分析，首先是信號肽及剪切位點預測方面，SignalP 5.0 Server預測結果顯示，Neuritin為經典的分泌型蛋白，信號肽序列為1-27位氨基酸，SP均值大于0.5；27位丙氨酸（Ala）C值最大，為信號肽剪切位點（圖3）。其次為跨膜結構方面，TMHMM Server2.0預測結果提示，除前述N端27個氨基酸所構成的信號肽外，尚有116-142號位氨基酸所組成的跨膜序列，考慮為GPI錨定序列（圖4）。此外，亞細胞定位方面，PSORT II預測結果顯示，Neuritin定位于不同位置的可能性分別為胞外（34.8%）、細胞膜（34.8%）、內質網（17.4%）及高爾基體（13.0%）。

2.3 Neuritin二級及三級結構預測

應用Protean軟件Garnier-Robson、Chou-Fasman及Karplus-Schulz方法預測Neuritin蛋白二級結構，其中使用Garnier-Robson、Chou-Fasman分析Neuritin α-螺旋、β-折疊區域；應用Garnier-Robson、Chou-Fasman及Karplus-Schulz方法預測柔性區域（圖5）。使用tFold利用從頭折疊的原理預測Neuritin蛋白三級結構，同時又利用Alaphfold開源數據庫獲取了Neuritin蛋白預測結構，兩數據庫預測結果除C端GPI錨定序列處略有差別外，其余部分趨勢相同。Neuritin由五段α-螺旋構成其主體結構，其中N端27個氨基酸為信號肽，C端27個氨基酸為GPI錨定序列（圖6）。

2.4 Neuritin翻譯后修飾分析預測

應用在線軟件NetNGlyc 1.0 Server及NetOGlyc 4.0 Server進行N-糖基化位點和O-糖基化位點分析，結果顯示Neuritin無N-糖基化位點及O-糖基化位點；應用在線軟件Netphos 3.1 Server進行磷酸化氨基酸殘基的位點預測，結果顯示Neuritin具有11個磷酸化氨基酸殘基的潛在位點（圖7），具體氨基酸位點信息如下（表1）。

2.5 Neuritin相互作用蛋白預測

STRING數據庫預測結果顯示，按置信度（score）排序，從高到低選取十個相互作用蛋白構成Neuritin（142個氨基酸）蛋白質相互作用網絡（圖8），主要包括了Gria蛋白家族，OLFM蛋白家族以及Cacng2等，具體蛋白信息及置信度如下（表2）。

3 討論

Neuritin具有促進神經元突起生長，抑制凋亡，促進突觸發育成熟，維持神經元存活等生物學功能，在神經發育、損傷后修復和學習記憶中發揮重要作用［4-6］。本研究利用各種生物信息學軟件對Neuritin進行結構組成及相互作用蛋白網絡的預測分析，通過上述預測分析，明確了Neuritin的基本結構組成，包括亞細胞分布、結構骨架、信號肽、錨定位點，翻譯后修飾等，同時，建立了Neuritin相互作用蛋白網絡，發現其相互作用蛋白的功能主要集中在神經發育、突觸可塑性及抑制細胞凋亡等方面。

本研究利用的生物信息學方法均為公認可靠的方法，針對Neuritin進行一級結構分析可以明確，Neuritin位于人基因組6p25.3，全長2072bp，表達產物由142個氨基酸殘基構成，其中1-27位氨基酸殘基為信號肽，28-115位氨基酸為活性片段，116-142位氨基酸為跨膜錨定序列。從系統進化角度而言，Neuritin氨基酸序列高度保守，多種物種序列分析顯示，其氨基酸組成無明顯差異。同時，Neuritin是經典的分泌型蛋白，分泌后以錨定型形式利用GPI錨定位點錨定在細胞膜上發揮功能。

Garnier-Robson、Chou-Fasman方法廣泛應用于蛋白質二級結構預測中。Chou-Fasman方法主要根據殘基的傾向性因子，沿蛋白序列尋找二級結構的成核位點和終止位點從而進行預測，而Garnier-Robson方法不僅考慮到被預測位置本身氨基酸殘基種類對該位置構象的影響，也對相鄰氨基酸殘基序列進行綜合分析，這種方法提高了預測的置信度。針對Neuritin蛋白而言，在24-46位、98-123位氨基酸殘基處，兩種方法預測結果存在部分差異，考慮是1-27位信號肽序列以及115-142位GPI錨定序列影響了上述方法對于二級結構的預測。綜合以上兩種方法預測結果，可認為Neuritin結構骨架主要由α-螺旋及β-折疊構成，5-45位、75-82以及105-142位氨基酸殘基所形成的3個較大α-螺旋區域，維持了Neuritin蛋白的穩定結構，符合其高疏水性的特點，而45-60位氨基酸殘基及80-105位氨基酸殘基處為表面可及區域，與這部分氨基酸殘基呈現高親水性特點有關，可能參與其功能基團的形成。

蛋白三級結構預測是生物信息學研究中的一個重要的研究方向，提高蛋白結構預測的準確度，對藥物作用靶點的發現，蛋白質相互作用的具體機制以及蛋白結構的解析具有重要意義。騰訊AI Lab科研團隊利用“從頭折疊”的原理研發AI工具“tFold”，用以預測蛋白的三級結構，并將其用于“分子置換”的初始構型來解析晶體數據，有效提升了蛋白結構預測精度［11］。Alaphfold是一個基于神經網絡的計算模型，該方法結合蛋白的物理和生物學方法，利用多序列比對來設計深度學習算法，其準確度可達到原子水平［12-13］。tFold以及從AlaphFold開源數據庫所獲取的Neuritin三級結構預測分析結果主要趨勢一致，與前述親疏水性分析及二級結構預測所得到的結果相符，僅tFold預測結果在C端116-142位氨基酸殘基增加了部分β-折疊區域。

最后，我們對與Neuritin相互作用蛋白進行了預測和分析，眾所周知，蛋白質相互作用是蛋白質分子發揮其生物學功能的主要方式，構建蛋白質相互作用網絡有利于明確與目的蛋白有相互作用的分子，這為研究目的蛋白的生物學功能和發揮生物效應的機制提供重要依據。Neuritin主要具有抑制細胞凋亡、促進神經突起的生長及其分支形成、促進突觸的發育成熟并維持突觸的可塑性，維持神經元的存活的作用［4-6］，但尚未明確其發揮作用的受體及具體機制。本研究利用數據庫按照置信度從高到低選取10個蛋白構建Neuritin相互作用蛋白網絡，主要包括Gria蛋白家族，OLFM蛋白家族及Cacng2等，其中，Gria家族成員（Gria 1、2、3、4）為谷氨酸AMPA離子通道型受體，在中樞神經系統中起配體門控離子通道的作用，在興奮性突觸傳遞中起重要作用［18］。有趣的是，Subramanian等［19］發現Neuritin可促進興奮性突觸的穩定及成熟，Neuritin利用其GPI錨與AMPA受體發生相互作用，促進新生棘突的穩定與突觸成熟。Cacng2是一種電壓依賴性鈣通道蛋白，主要參與細胞內鈣通路以及谷氨酰胺信號通路［20］。無獨有偶，Zhao等發現Neuritin可增強胞內鈣水平，上調細胞表面Cav1.2及Cav1.3的表達，此過程受胰島素受體（IR）、ERK以及鈣調神經磷酸酶（CaN）介導［21］。Dlg4屬于膜關聯鳥苷酸激酶蛋白家族，與 NMDA 受體信號傳導相關的突觸可塑性有關。Dlg4表達異常會改變海馬神經元中興奮性突觸與抑制性突觸的比例［22］，而Neuritin可以激活ERK通路促進Cav3.3α表達，增加小鼠內側前額葉皮質興奮性突觸后電流頻率和谷氨酸釋放，影響神經元興奮性或突觸活動，從而改變神經網絡的興奮性［23］。Olfm1、3是嗅素結構域家族（OLFM）中的成員，OLFM蛋白的生物學功能尚不清楚，但較多證據顯示其可在正常發育和病理過程中起重要作用。Olfm1在小鼠視網膜中有表達，Olfm1的突變會阻斷其分泌；抑制Olfm3及其同家族蛋白成員的活性，會導致視網膜病變［24-25］。有趣的是，有文獻報道，Neuritin基因表達高峰出現在視覺發育關鍵期，同時其在受損視神經中表達上調［26］。綜上，Neuritin蛋白可能通過與上述蛋白因子互作在神經元發育、突觸可塑性、鈣調通路以及視覺發育過程中發揮重要的作用，但具體機制仍需進一步研究證實。

本研究綜合多種生物信息學手段，探討了Neuritin的基本理化性質及其結構組成，構建了高可信度的Neuritin相互作用蛋白網絡，為研究其在神經退行性疾病中發揮作用的機制，探索Neuritin的作用靶點提供了新的思路與方向。

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（責任編輯：編輯唐慧）

收稿日期：中文收稿日期2022-04-14

基金項目：國家科技重大專項（民口）重大新藥創制項目（2019ZX09301-161）;浙江省重點研發項目（2019C03060）

作者簡介：李煜（1997—），男，碩士研究生，專業方向為基礎醫學，e-mail：lybiochem@163.com。

*通信作者：楊磊（1962—），男，教授，博士生導師，從事蛋白質功能與疾病方面的研究，e-mail：20080009@hznu.edu.cn。