基于生物信息學分析EDIL3基因在宮頸癌中的表達及臨床意義

王慧娟　郭炳軒　宋樹言　李楊楊　者湘漪　李洪濤　李冬妹　潘澤民

摘要：目的 探討表皮生長因子樣重復序列和盤狀蛋白I樣結構域3（EDIL3基因）在宮頸癌中表達及其對宮頸癌細胞SiHa、HeLa遷移的作用。方法 運用GEPIA、UALCAN、OncoLnc數據庫分析EDIL3 基因mRNA在宮頸癌組織中的表達水平、基因啟動子甲基化狀態和預后的意義；采用免疫組織化學染色、Western blot、qRT-PCR分別檢測宮頸癌組織和細胞中EDIL3蛋白及EDIL3基因mRNA表達水平；構建EDIL3-pcDNA3.1過表達質粒，轉染分為實驗組（轉染過表達EDIL3-pcDNA3.1質粒）和對照組NC（轉染空質粒），transwell實驗檢測宮頸癌細胞SiHa、HeLa的遷移。結果 生物信息學數據庫分析顯示EDIL3 基因mRNA在宮頸癌組織中低表達并且存在啟動子高甲基化（P＜0.05），在宮頸癌不同分期中EDIL3基因的表達無差異（P＞0.05），EDIL3高表達與宮頸癌患者不良預后相關（P＜0.05）；免疫組織化學染色、Western blot、qRT-PCR與數據庫分析結果一致，在宮頸癌組織和細胞中EDIL3 基因均低表達（P＜0.05），且其表達水平與 HPV感染無明顯相關性（P＞0.05）；Transwell實驗顯示過表達EDIL3后增強宮頸癌細胞SiHa、HeLa的遷移能力 （P＜0.05）。結論 EDIL3 基因在宮頸癌組織和細胞中低表達并不受HPV感染的影響，而EDIL3高表達影響患者預后且促進宮頸癌細胞 SiHa 、HeLa的遷移能力。

關鍵詞：宮頸癌；EDIL3基因；HPV；遷移

中圖分類號：中圖分類號R737.33文獻標志碼：A文獻標識碼

Expression and clinical significance of EDIL3 gene in cervical cancer based

on bioinformatics analysis

WANG Huijuan GUO? Bingxuan2，SONG? Shuyan2，LI Yangyang2，ZHE? Xiangyi2，3，LI? Hongtao3，LI? Dongmei2，PAN? Zemin2*

（1 Department of Laboratory Medicine， The First Affiliated Hospital of School of Medicine， Shihezi University， Shihezi，

Xinjiang 832008， China; 2 Department of Biochemistry and Molecular Biology， School of Medicine， Shihezi University/Key

Laboratory of Xinjiang Endemic and Ethnic Diseases Shihezi， Xinjiang 832002， China; 3 Department of Anatomy and Histology

and Embryology， School of Medicine， Shihezi University， Shihezi，Xinjiang 832002， China）

Abstract： ?Objective To investigate the expression of epidermal growth factor-like repeat and discoid protein i-like domain 3（EDIL3 gene） in cervical cancer and its effects on the migration of cervical cancer cells SiHa and HeLa. Methods GEPIA， UALCAN and OncoLnc databases were used to analyze the expression level， methylation status of gene promoter and prognostic significance of EDIL3 mRNA in cervical cancer. Immunohistochemical staining， Western blot and qRT-PCR were used to detect the expression levels of EDIL3 protein and EDIL3 mRNA in cervical cancer tissues and cells， respectively. Overexpression plasmid of EDIL3-pcDNA3.1 was designed and divided into experimental group （transfected with EDIL3 plasmid） and control group NC （transfected with empty plasmid）. transwell experiment was used to detect the migration of cervical cancer cells SiHa and HeLa. Results Bioinformatics database analysis showed that EDIL3 gene mRNA was low expressed and the promoter was hypermethylated in cervical cancer tissues （P<0.05）， and there was no difference in expression among different stages of cervical cancer （P > 0.05）. High EDI13 expression was associated with poor prognosis of cervical cancer patients （P<0.05）. The results of immunohistochemistry， Western blot and qRT-PCR were consistent with those of database analysis. The expression level of EDIL3 gene in both tissues and cells of cervical cancer was low （P<0.05）， and there was no significant correlation between its expression level and HPV infection （P > 0.05）. Transwell experiment showed that the overexpression of EDIL3 gene enhanced the migration capacity of cervical cancer cells SiHa and HeLa （P<0.05）. Conclusion The low expression of EDI13 gene in cervical cancer tissues and cells is not affected by HPV infection， while the high expression of EDI13 affects the prognosis of patients and promotes the migration ability of cervical cancer cells SiHa and HeLa.

Key words： Cervical cancer;EDIL3 gene;HPV;Migration

宮頸癌是一種在臨床中非常常見的女性生殖道癌癥，也是不發達國家和地區因癌癥而死亡的最常見的原因之一［1］。剛剛發布的《2020年世界癌癥報告》分析了中國癌癥病例的變化和特點，新增宮頸癌患者60萬例，因宮頸癌病死34萬例［2］。研究發現宮頸癌發生的重要原因包括高危型人乳頭瘤病毒（Human papillomavirus，HPV）持續性感染，如HPV16、HPV18和HPV52，雖然針對高危型HPV研發了疫苗，但接種疫苗的人員并沒有普及，特別是一些不發達地區的女性［3］?，F如今臨床治療宮頸癌主要采用免疫和手術等綜合治療方法，但很大一部分患者生存率依然很低，因此迫切需要探索診治宮頸癌的新策略、新方向和新靶點。

表皮生長因子樣重復序列和盤狀蛋白I樣結構域3（epidermal growth factor-like repeats and discoidin I-like domains EDIL3）又稱為發育內皮基因座-1（developmental endothelial locus-1，Del-1），位于人染色體5q14，3，分子量為52 kDa，全長約6 500 bp，EDIL3是一種細胞外基質蛋白，早期在小鼠胚胎中發現，亦是一種由胚胎內皮細胞分泌的糖蛋白。EDIL3編碼的蛋白質是整合素配體，通過與整合素αvβ5相互作用促進新血管的生長［4］。EDIL3在結直腸癌［5］和肺腺癌［6］中表達下調，相反，其在乳腺癌［7］、胰腺癌［8］中表達水平增加，并與疾病預后不良相關。

至今為止，尚未見EDIL3基因在宮頸癌中作用研究的相關報道，因此本研究探討EDIL3基因在宮頸癌中的表達情況及臨床意義，旨在為宮頸癌的預防和診治提供有價值的基礎研究和臨床指標。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑

實驗選取購自武漢普諾賽生命科技公司的宮頸癌細胞株SiHa、HeLa和人宮頸上皮永生化細胞株HaCaT作為研究對象。實驗所用試劑有美國Gibco 公司生產的培養基（DMEM）和胎牛血清（FBS）;北京中山金橋公司生產GAPDH鼠單克隆抗體;美國Promege公司生產的Lipofectamine 2000轉染試劑;兔單克隆抗體EDIL3購自武漢三鷹生物技術有限公司;Transwell小室購自美國Corning公司;EDIL3-pcDNA3.1過表達質粒由上海吉瑪制藥技術有限公司合成。

1.2 數據來源

1.2.1 GEPIA（Gene Expression Profiling Interactive Analysis）數據庫

GEPIA在線應用數據庫（http：//gepia2.cancer-pku.cn/#index）是北京大學各級專家精心研制開發的一款軟件，目前已更新到2.0版本。

該數據庫含有TCGA和GTEx 2個數據庫中正常組織樣本8 587個和腫瘤樣本9 736個，在正常組織和腫瘤組織中用以分析某基因的表達差異性、預后及相關性等。該在線工具在本研究中主要挖掘EDIL3在宮頸癌及正常宮頸組織中的ｍRNA表達差異。篩選條件如下： Expression Analysis： Expression DIY； Box Plot， Gene：EDIL3， Cancer name： CESC； Plot， 其余條件不變；Stage Plot分析宮頸癌不同分期中的基因表達。

1.2.2 UALCAN數據庫

UALCAN數據庫（http：//ualcan.path.uab.edu/index.html）主要建立在腫瘤基因組圖譜 TCGA數據庫的基礎上用于對某基因的表達譜、啟動子甲基化情況、biomarker鑒定、相關性、泛癌表達及預后等相關癌癥數據進行分析。

本研究應用該數據庫對EDIL3基因啟動子甲基化狀態進行了分析。篩選條件如下： TCGA Gene analysis： ”EDIL3”，” Cervical squamous cell carcinoma”；Methylation： ”Sample types”。

1.2.3 OncoLnc數據庫

OncoLnc數據庫（www.oncolnc.org）包括了TCGA數據庫中8647個病人的21種腫瘤的臨床信息、生存信息及對應的mRNA和miRNA的表達譜數據和來源于MiTranscriptome項目中lncRNA的表達譜數據，因此該數據庫囊括了mRNA、miRNA和lncRNA 3種轉錄本的生存分析，使用戶探索研究腫瘤中和生存分析相關的基因更加便利。篩選條件如下： Gene：EDIL3，Submit;選擇宮頸癌（CESC），點擊Yes Please提交；在新彈出的頁面中定義Cutoff值（一般用中位數定義分組，即50%），Submit后就能看到KM生存圖和P值了;點擊Click Here下載Excel格式的原始數據，使用X-tile軟件計算Ｐ<0.05時的Cutoff值，重新分析結果。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養

復蘇液氮中凍存的細胞后將SiHa、HeLa細胞培養于含10%的FBS和1%的雙抗（青、鏈霉素）的DMEM中，HaCaT細胞培養于含15% 的FBS和1%的雙抗的DMEM中，細胞培養箱條件為5% CO2、37℃。用胰蛋白酶消化對數期的細胞3 min并1∶3傳代，連續傳三代后進行后面的實驗。

1.3.2 細胞轉染

取180uL SiHa細胞鋪板， 培養24h棄去6孔板中培養基后用1×PBS洗滌兩遍，加入800 μL DMEM備用。配置A 液：100 μL DMEM+2 μg EDIL3過表達質粒；B液：100 μL DMEM+2 μg空質粒NC；C液2份：100 μL DMEM +5 μL Lipofectamine2000，靜置5 min后，將Ａ液與一份Ｃ液混勻，Ｂ液與另一份Ｃ液混勻后共同靜置20 min不要移動，然后將混合液A+C和B+C分別散在均勻滴入上面備用6孔板細胞中，4～6 h后換完全培養基，24h后進行細胞計數鋪板。HeLa細胞轉染步驟同上。

1.3.3 qRT-PCR實驗檢測細胞中EDIL3基因 mRNA的表達水平

將處于對數期狀態的細胞使用TRIzol提取總RNA，然后把提取到的RNA逆轉錄為cDNA放入低溫冰箱備用。以2 μL cDNA為模板進行擴增（預變性90℃ 30s，95℃ 3s，60℃ 30s，40個循環）。使用實驗室22331 Hamburg型 PCR儀自帶軟件分析及獲取循環閾值ＣＴ，最后使用公式2-△△CT計算細胞mRNA的相對表達量。

1.3.4 Western blot 實驗檢測細胞中EDIL3蛋白質的表達水平

在處于對數生長期的細胞皿中加入RIPA+1%PMSF裂解液放入冰箱裂解20 min，待細胞呈流沙狀態完全裂解后用刮刀將全部細胞刮入EP管中備用，12 000 r·min-1，4 ℃離心15min。吸取部分蛋白按4∶1比例加入5×Loading Buffer后煮沸（100 ℃，10 min）放入冰箱冰凍儲存，剩余20 μL使用BCA試劑測定其濃度。用SDS-PAGE （80 V 30min后110 V 1h）分離20 mg蛋白后濕轉（110 V，60min）至PVDF膜上，加入雀巢脫脂奶粉封閉（5%，常溫，2h）后孵育一抗（1∶1 000，4℃）過夜雜交，TBST洗滌3次后孵育二抗（1∶5 000，室溫，2h）。TBST洗滌3次后由Protein-Simple公司的Fluorchen HD2化學發光儀曝光條帶及使用ImageJ軟件測定各條帶灰度值。目的蛋白質的相對表達量=目的蛋白質條帶灰度值/內參GAPDH蛋白質條帶灰度值。

1.3.5 免疫組織化學方法檢測組織中EDIL3蛋白質表達水平

選取本校第一附屬醫院收治的宮頸癌患者石蠟包埋的組織樣本72例及炎癥患者石蠟包埋的組織樣本36例，實驗獲得醫院倫理委員會的批準及患者的知情同意。使用第二代雜交俘獲 （hybrid capture system-2，HC-2） 技術檢測所收集診斷為宮頸癌疾病的樣本的 HPV感染的情況，所有組織樣本嚴格按照免疫組織化學染色實驗操作步驟進行染色。EDIL3抗體濃度為1∶3 200。使用半定量計分法判斷EDIL3陽性表達：陽性細胞數大于75%為4分，51%～75%為3分，26%～50%為2分，6%～25%為1分，小于5%為0分﹔在高倍鏡視野下根據顯色強度判斷陽性強度：棕褐色為3分，棕黃色為2分，黃色為1分，無陽性細胞為0分。求取上述兩項得分乘積：0分為陰性（－），1～2分為弱陽性（+），3～4分為中陽性（++），5～7分為強陽性（+++）。本實驗取陰性和弱陽性歸一為陰性，中陽性和強陽性歸一為陽性，結果由醫院病理科兩名副主任醫師以上以雙盲法獨立確定。

1.3.6 Transwell體外實驗檢測SiHa、HeLa 細胞遷移能力

取兩組SiHa細胞（過表達EDIL3組和對照組NC），用胰蛋白酶消化后離心棄上清液使用PBS清洗1遍，加入無血清DMEM制成細胞懸液進行計數以調整細胞濃度為1×105 mL-1，24孔板中每孔加入含15% FBS總量為600 μl的 DMEM，用鑷子輕輕將Transwell小室放入培養基中（避免產生氣泡），吸取200 μL配置好的懸液梅花式點入 Transwell小室的上室，不要搖動放入條件為 37 ℃、5% CO2的 培養箱進行培養。36h后用1mL PBS分別清洗小室的上、下室兩次后使用40 g·L-1多聚甲醛固定 半小時及0.1%的結晶紫室溫孵育半小時，最后用清水輕柔洗滌3遍后使用干凈棉簽輕輕擦去小室內未遷移的細胞，在顯微鏡下隨機拍9個高倍鏡視野進行計數。HeLa 細胞遷移實驗同上。

1.3.7 統計學方法

本次研究所有數據均重復實驗3次并使用統計學軟件SPSS 17.0進行分析，計量實驗數據以X-±S表示。采用t檢驗比較兩組實驗結果的差異，卡方檢驗用于石蠟切片免疫組織化學結果分析，Spearman相關系數檢驗分析兩者的相關性，P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 生物信息學數據庫預測宮頸癌組織中EDIL3基因 mRNA表達水平

根據GEPIA數據庫預測EDIL3 基因mRNA在宮頸癌組織中的表達水平，結果顯示與正常宮頸組織相比較，EDIL3基因 mRNA在宮頸癌組織中低表達（P<0.05），在宮頸癌不同分期中的基因表達無差異（P>0.05）（圖1）。

2.2 生物信息學數據庫分析宮頸癌組織中EDIL3基因啟動子甲基化狀態

使用UALCAN數據庫預測EDIL3基因啟動子甲基化在宮頸癌組織中的水平，結果顯示EDIL3基因啟動子在宮頸癌組織中高甲基化，P=1.62E-12，差異具有統計學意義（P<0.05）（圖2）。

2.3 生物信息學數據庫分析EDIL3基因表達水平與宮頸癌預后的關系

OncoLnc數據庫選取患宮頸癌疾病263例病人分析其預后，其中126例患者EDIL3高表達和 137例患者EDIL3低表達。結果顯示EDIL3高表達的宮頸癌患者生存率較低表達的宮頸癌患者低，預后不良，（P<0.05）（圖3）。

2.4 免疫組織化學分析EDIL3在宮頸癌組織中的表達水平

采用免疫組織化學分析宮頸組織樣本中EDIL3蛋白質表達水平，檢測到EDIL3定位在細胞質中（圖4）。染色結果統計顯示與正常宮頸組織相比，EDIL3在宮頸癌組織中低表達（P<0.05）（表1）。

2.5 蛋白質印跡法和實時熒光定量PCR分析EDIL3在宮頸癌細胞中的表達水平

采用Western blot和qRT-PCR分別對宮頸細胞中EDIL3蛋白質和mRNA表達水平進行分析。統計結果顯示EDIL3蛋白質和mRNA的表達水平在SiHa、HeLa中相對HaCaT較低（P<0.05）（圖5）。

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（責任編輯：編輯唐慧）

收稿日期：中文收稿日期2022-10-13

基金項目：國家自然科學基金項目（82060518，U1503125）;新疆生產建設兵團國際科技合作計劃基金項目（2019BC007）;石河子大學科研基金項目（ZZZC2021107）

作者簡介：王慧娟（1986—），女，碩士研究生，主管技師，專業方向為人體重要功能蛋白的克隆與基因工程。

*通信作者： 潘澤民（1966—），男，教授，博士生導師， 從事人體重要功能蛋白的克隆與基因工程的研究，e-mail：panteacher89@sina.com。