巨噬細胞ADAM8誘導血管平滑肌細胞去分化

鄧潔鋒, 米婭麗, 侯連杰, 趙國軍

1.大理大學藥學院,云南大理 671003;2.廣州醫科大學附屬第六醫院 清遠市人民醫院中心實驗室,廣東清遠 511518

胸主動脈瘤夾層(thoracic aortic aneurysm and dissection,TAAD)是兇險的心血管疾病之一,主要病理特點為主動脈持續的局限性擴張,其直徑超過正常主動脈內徑的150%,由于血管直徑變化,其所受到的張力也變大,在高血壓的沖擊下易發生夾層[1]。主動脈內血流通過破損的主動脈內膜,進入主動脈中膜,并且沿著血管延伸,撕裂原有的主動脈壁,形成血管假腔大血管疾病,若不及時治療死亡率極高[2]。因此,深入研究主動脈夾層發生的機制將為臨床上預防和治療主動脈夾層提供新的靶點和新策略。

TAAD作為血管中膜的退行性病變[3],與血管中膜巨噬細胞浸潤、炎癥因子分泌和基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)的產生密切相關[4]。具體而言,炎癥介質和MMP促使其附近的細胞外基質降解,誘導血管平滑肌細胞去分化。平滑肌細胞去分化是指平滑肌細胞分化標志基因α-actin和α-tropomyosin表達下調,細胞收縮舒張能力丟失,變為間充質細胞的過程,最終導致主動脈管壁變薄,在血壓的作用下,引起主動脈管腔擴張及其內膜破裂,從而誘發TAAD[5]。

去整合素金屬蛋白酶8(recombinant a disintegrin and metalloprotease 8,ADAM8)又名CD156a或MS2,是一種主要在單核細胞上表達的新型細胞表面蛋白[6]。本課題組通過生物信息學分析發現胸主動脈夾層患者和小鼠腹主動脈瘤模型中ADAM8表達顯著增加,但在巨噬細胞炎癥反應和平滑肌細胞去分化過程中的作用不明。本研究利用生物信息學分析巨噬細胞ADAM8過表達對血管平滑肌細胞去分化的影響。

1 材料和方法

1.1 生物信息學分析

從GEO數據庫下載微陣列數據集GSE147026(胸主動脈夾層患者測序數據)和GSE17901(腹主動脈瘤小鼠測序數據),利用GEO2R篩選與胸主動脈夾層相關的候選基因并繪制熱圖顯示差異表達基因。

1.2 主要材料

人單核巨噬細胞系THP-1、人主動脈血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells,VSMC)和人臍靜脈內皮細胞系(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)(ATCC公司),Lipo3000(Life公司,美國),胎牛血清、DMEM高糖培養基、RPMI 1640培養基和胰蛋白酶(Gibco公司,美國),pcDNA3.1質粒(Promega公司,美國),ADAM8 pcDNA3.1過表達質粒及其引物均由北京擎科生物公司構建或合成。

1.3 細胞培養及處理

THP-1巨噬細胞按照5×105個/孔接種于6孔板,佛波酯處理48 h誘導巨噬細胞貼壁,100 μg/L脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)處理24 h誘導炎癥反應(LPS組),對照組細胞添加與LPS組等體積的磷酸鹽緩沖液,收集細胞用于檢測ADAM8基因表達水平。THP-1巨噬細胞按照5×105個/孔接種于6孔板,佛波酯處理48 h誘導巨噬細胞貼壁,轉染質粒,繼續培養48 h,收集細胞和培養基用于后續實驗。血管平滑肌細胞按照3×105個/孔接種于6孔板,待細胞貼壁后,按照1∶1的比例分別在平滑肌細胞完全培養基(含10%胎牛血清的DMEM高糖培養基)中添加轉染空質粒的巨噬細胞培養基(空質粒組)或轉染ADAM8過表達質粒(過表達組)的巨噬細胞培養基,觀察不同培養基對血管平滑肌細胞增殖和遷移的影響。

1.4 實時定量PCR

按照廣州美基生物科技公司RNA快速提取試劑盒操作說明提取THP-1巨噬細胞RNA。按照TaKaRa公司反轉錄試劑盒操作說明將細胞總RNA反轉錄為cDNA用于后續定量PCR實驗。相關基因引物序列見表1。qPCR檢測ADAM8對巨噬細胞炎癥因子白細胞介素(interleukin,IL)-6、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor,TNF-α)和MMP表達的影響。qPCR檢測過表達ADAM8的巨噬細胞培養基對血管平滑肌細胞分化標志基因α-actin和α-tropomyosin表達水平的影響。

表1 引物序列

1.5 Western blotting檢測

蛋白提取試劑盒提取細胞總蛋白,Bradford法進行蛋白定量,12% SDS-PAGE分離,轉移至PVDF膜,加入GAPDH(ab8245,1∶1 000)和ADAM8(ab236949,1∶1 000)抗體孵育過夜,PBS洗膜后加入過氧化物酶耦聯的二抗,37 ℃下孵育2 h,PBS清洗后,用Bio-Rad化學發光系統檢測目的條帶,以GAPDH作內參。

1.6 Edu檢測細胞增殖

血管平滑肌細胞以1×105個/孔接種于24孔板,在細胞匯合度達到70%時,使用BeyoClick Edu-488細胞增殖檢測試劑盒進行檢測。將細胞置于倒置顯微鏡下觀察、拍照,隨機挑選若干視野拍照。Edu陽性細胞率(%)=Edu陽性細胞數/總細胞數×100%。

1.7 細胞劃痕實驗

接種于6孔板的血管平滑肌細胞匯合度達到90%時,用10 μL移液器槍頭在孔內豎直劃擦,DMEM高糖培養液洗滌細胞,去除懸浮細胞后照相,用不含FBS的DMEM高糖培養液繼續培養。劃痕后第18 h與36 h分別在鏡下觀察劃痕處細胞遷移狀態,并拍照。細胞遷移率通過Image J軟件計算。

1.8 統計學分析

采用SPSS 22.0軟件進行統計學分析。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 ADAM8在巨噬細胞內特異性表達且受LPS引起的炎癥反應調控

生物信息學分析結果顯示,在胸主動脈夾層患者和小鼠腹主動脈瘤模型中,ADAM8顯著上調(圖1A)。Western blotting結果顯示,ADAM8在巨噬細胞高表達,但在血管內皮細胞和血管平滑肌細胞幾乎不表達(圖1B),且ADAM8在LPS誘導巨噬細胞炎癥反應過程中表達顯著增加(圖1C和圖1D)。

圖1 ADAM8在巨噬細胞內特異性表達且受LPS引起的炎癥反應調控A為熱圖顯示胸主動脈夾層患者和腹主動脈瘤小鼠病理變化過程中差異表達基因(FC為fold change);B為Western blotting檢測不同血管細胞ADAM8蛋白含量;C為qPCR檢測巨噬細胞炎癥反應狀態下ADAM8 mRNA水平;D為Western blotting檢測巨噬細胞炎癥反應狀態下ADAM8蛋白含量。a為P<0.05,與對照組比較。

2.2 ADAM8促進巨噬細胞炎癥反應和MMP表達

與空質粒組比較,過表達組巨噬細胞ADAM8 mRNA和蛋白水平、IL-6、TNF-α、MMP-9、MMP-12和MMP-13顯著增加(圖2),提示ADAM8促進巨噬細胞炎癥反應和MMP表達。

圖2 ADAM8促進巨噬細胞炎癥反應及MMP表達A為Western blotting檢測巨噬細胞ADAM8蛋白含量;B為qPCR檢測巨噬細胞ADAM8 mRNA水平;C為qPCR檢測巨噬細胞過表達ADAM8對炎癥因子和MMP表達變化的影響。a為P<0.05,與空質粒組比較。

2.3 過表達ADAM8巨噬細胞培養基促進血管平滑肌細胞去分化

過表達ADAM8的巨噬細胞培養基顯著促進血管平滑肌細胞遷移和細胞增殖(P<0.05);但顯著抑制血管平滑肌細胞標志基因α-actin和α-tropomyosin的表達(P<0.05;圖3);提示過表達ADAM8的巨噬細胞培養基誘導血管平滑肌細胞去分化。

圖3 過表達ADAM8巨噬細胞培養基促進血管平滑肌細胞去分化A為細胞劃痕實驗檢測各組血管平滑肌細胞遷移的影響(40×);B為Edu染色評估不同來源巨噬細胞培養基對血管平滑肌細胞增殖的影響(200×);C為18、36 h后血管平滑肌細胞遷移率;D為Edu染色的統計結果;E為過表達ADAM8巨噬細胞培養基對血管平滑肌細胞標志基因表達水平的影響。a為P<0.05,與空質粒組比較。

3 討 論

TAAD的發生隱匿、死亡率高,給人類健康和社會發展造成嚴重危害。TAAD作為一種炎癥引起的血管中膜功能退化的主動脈疾病,與巨噬細胞炎癥和血管平滑肌去分化密切相關[7]。本研究結果顯示,ADAM8通過增加巨噬細胞炎癥反應和MMP表達,誘導血管平滑肌細胞去分化,提示ADAM8成為TAAD治療靶標的可能性。

ADAM蛋白是一個與再生結構相關的膜錨定細胞表面蛋白酶家族。ADAM蛋白具有兩種生物學作用:①與細胞表面蛋白脫落相關的膜錨定金屬蛋白酶;②參與切割不同細胞表面蛋白基質分子如受體、生長因子、細胞因子和基質金屬蛋白酶的可溶性蛋白酶。ADAM家族蛋白與巨噬細胞炎癥和動脈瘤發生密切相關。研究發現,血管平滑肌細胞敲除ADAM17抑制似乎可以保護小鼠免受血管緊張素Ⅱ/β-氨基丙腈誘導的腹主動脈瘤發生[8]。此外,LPS刺激促進巨噬細胞ADAM10、MMP-12和炎癥相關的TNF-α、誘導型一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)和IL-10表達;過表達的ADAM10增加MMP-12、iNOS和TNF-α基因的表達[9]。研究表明,機體內ADAM8具有免疫特異性,僅限于免疫系統和中樞神經系統中特定細胞內,且在正常組織中表達較低[10];本研究結果顯示,LPS誘導的巨噬細胞炎癥反應過程中ADAM8表達上調,巨噬細胞過表達ADAM8促進細胞炎癥反應和MMP表達。

主動脈中膜由主動脈平滑肌細胞和細胞外基質組成,主動脈平滑肌細胞擁有穩定的表型和強大的收縮能力以對抗強大血流沖擊力,維持血管管徑的穩定和血壓的穩定;而主動脈中膜的退行性病變主要表現為細胞外基質降解和血管平滑肌細胞去分化,這兩個特征與基質金屬蛋白酶表達水平密切相關[11]。研究表明MMP-9是主動脈瘤和主動脈夾層發病的重要因素[12]。高濃度的葡萄糖溶液能上調血管平滑肌細胞MMP-2、MMP-9和MMP-14活性,抑制血管收縮或舒張功能[13]。血管平滑肌細胞過表達MMP-9促進血管平滑肌細胞增殖,抑制血管壁正常平滑肌細胞的收縮或舒張功能[14]。車前草皂苷通過抑制MMP-2、MMP-9和MMP-13表達抑制血管平滑肌細胞遷移和增殖[15]。本研究結果顯示,巨噬細胞過表達ADAM8顯著增加巨噬細胞MMP-9表達,該培養基處理血管平滑肌細胞后,誘導細胞增殖和遷移。

綜上所述,ADAM8基因在胸主動脈瘤夾層和腹主動脈瘤病變過程中顯著上調,且在LPS誘導巨噬細胞炎癥反應過程中ADAM8表達也增加;此外,ADAM8上調巨噬細胞炎癥因子以及MMP表達,且過表達ADAM8巨噬細胞培養基促進血管平滑肌細胞增殖和遷移;提示ADAM8具有成為TAAD治療靶標的可能性。