基于生物信息學(xué)篩選膿毒癥中性粒細(xì)胞活化的關(guān)鍵基因

陸洲成, 鐘樹武, 言彩紅, 張群峰

南華大學(xué)衡陽醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科,湖南衡陽 421001

膿毒癥為宿主對感染的免疫反應(yīng)失調(diào)引起的危及生命的器官功能障礙,是引起重癥監(jiān)護(hù)病房(intensive care unit,ICU)患者死亡的主要原因之一[1-2]。目前,膿毒癥的治療手段主要是抗感染和對癥支持治療,但其特異性療法仍缺乏[3]。中性粒細(xì)胞是一種重要的免疫細(xì)胞,位于病原微生物入侵的第一線,對感染的控制起著重要作用[4]。在膿毒癥發(fā)病的過程中,中性粒細(xì)胞積極響應(yīng)并發(fā)揮著抗感染作用,然而,失調(diào)和過度活化的中性粒細(xì)胞也引起劇烈的炎癥反應(yīng)和嚴(yán)重的組織損傷,導(dǎo)致膿毒癥患者預(yù)后不良[5]。因此,對中性粒細(xì)胞活化的調(diào)控是治療膿毒癥的重要方面[6],中性粒細(xì)胞活化的關(guān)鍵基因有望成為診斷和治療膿毒癥的生物標(biāo)志物。本研究通過生物信息學(xué)方法,篩選出膿毒癥中性粒細(xì)胞活化的關(guān)鍵基因,以期為未來膿毒癥的早期診斷、預(yù)后判斷及治療提供新思路。

1 材料和方法

1.1 數(shù)據(jù)獲取與整理

從GEO數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)下載4個成人膿毒癥芯片數(shù)據(jù)集(GSE69528、GSE28750、GSE57065、GSE95233)及1個兒童膿毒癥芯片數(shù)據(jù)集GSE66099。GSE69528包含83例膿毒癥和55例對照樣本;GSE28750包含10例膿毒癥樣本和20例對照樣本;GSE57065包含82例膿毒癥樣本和25例對照樣本;GSE95233包含102例膿毒癥樣本和22例對照樣本。GSE66099包含199例膿毒癥樣本和47例對照樣本。所有數(shù)據(jù)集所取樣本為全血樣本。

1.2 差異表達(dá)基因篩選

采用Perl語言(perl軟件v5.32.0版本)合并數(shù)據(jù)集,采用R語言(R軟件3.6.3版本)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化及表達(dá)值計算等處理。差異表達(dá)基因(differentially expressed gene,DEG)分析使用R語言,采用Fold-change和T-test進(jìn)行DEG篩選,篩選條件為|logFc|≥1、P<0.05,結(jié)果用火山圖顯示。

1.3 重疊DEG鑒定

采用韋恩圖(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny)識別重疊的DEG。

1.4 DEG富集分析

對4個成人數(shù)據(jù)集重疊DEG進(jìn)行基因本體論(gene ontology,GO)功能分析,包括生物過程(biological process,BP)、細(xì)胞成分(cell composition,CC)和分子功能(molecular function,MF)。

1.5 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

重疊的DEG在STRING數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站(https://cn.string-db.org/)中進(jìn)行多個蛋白質(zhì)搜索,以預(yù)測蛋白互作(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò),運用Cytoscape軟件(https://cytoscape.org/)將PPI網(wǎng)絡(luò)結(jié)果可視化并進(jìn)行模塊分析,使用Ctyohubba插件MCC算法提取PPI網(wǎng)絡(luò)中樞紐基因即為關(guān)鍵基因。

1.6 關(guān)鍵基因診斷價值的鑒定

通過ROC曲線下面積(area under the curve,AUC)確定關(guān)鍵基因?qū)δ摱景Y的診斷價值。

1.7 免疫浸潤分析

采用CIBERSORT算法評估22個免疫細(xì)胞比例,分析各數(shù)據(jù)集膿毒癥組與對照組之間的免疫細(xì)胞分布。Wilcoxon秩和檢驗比較免疫細(xì)胞在兩組中的表達(dá)差異。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.8 外部數(shù)據(jù)集驗證

通過兒童膿毒癥芯片數(shù)據(jù)集GSE66099 199例膿毒癥和47例對照組全血樣本進(jìn)行關(guān)鍵基因表達(dá)的驗證,以同樣的生物信息分析方法進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1 膿毒癥重疊DEG篩選及GO富集分析

GSE69528、GSE95233、GSE57065、GSE28750數(shù)據(jù)集分別篩選出1 328、986、789、824個DEG,得到重疊DEG 299個(圖1A),其中上調(diào)112個,下調(diào)187個。重疊DEG的PPI可視化見圖1B。GO富集結(jié)果顯示,BP主要富集于中性粒細(xì)胞活化、中性粒細(xì)胞脫顆粒等;MF主要富集于肽酶調(diào)節(jié)活性、糖胺聚糖結(jié)合等;CC主要富集于特殊顆粒、囊泡腔等(圖1C)。

圖1 膿毒癥的重疊DEG篩選及GO富集分析結(jié)果A為DEG韋恩圖;B為DEG的PPI網(wǎng)絡(luò)圖(藍(lán)色為下調(diào)基因、紅色為上調(diào)基因);C為DEG的GO富集分析氣泡圖。

2.2 膿毒癥中性粒細(xì)胞活化的關(guān)鍵基因

與中性粒細(xì)胞活化相關(guān)的DEG共55個(圖2A)。55個候選DEG中的49個DEG被篩選進(jìn)入到DEG PPI網(wǎng)絡(luò)復(fù)合體中,PPI可視化見圖2B;進(jìn)一步篩選出前10位樞紐基因作為膿毒癥中性粒細(xì)胞活化相關(guān)的關(guān)鍵基因,分別為MPO、CTSG、ELANE、MMP9、LCN2、MMP8、LTF、CAMP、S100A12、DEFA4。

2.3 中性粒細(xì)胞活化的關(guān)鍵基因的表達(dá)水平及診斷價值

10個關(guān)鍵基因在4個成人數(shù)據(jù)集的膿毒癥樣本組中均上調(diào)(P<0.05);ROC AUC均大于0.7(圖3),提示具有較好的診斷價值。

2.4 膿毒癥數(shù)據(jù)集免疫細(xì)胞的差異分析

成人膿毒癥患者全血樣本中單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、M0巨噬細(xì)胞均上調(diào),其中以中性粒細(xì)胞上調(diào)最為顯著(圖4;P<0.05)。

圖4 4個成人數(shù)據(jù)集膿毒癥患者與對照組全血樣本免疫細(xì)胞的差異分析a為P<0.05,與對照組比較。

2.5 關(guān)鍵基因的驗證

采用兒童膿毒癥芯片數(shù)據(jù)集GSE66099進(jìn)行驗證,篩選到1 143個DEG,其中上調(diào)562個,下調(diào)581個(圖5A)。GO富集分析的BP、CC、MF結(jié)果驗證了成人膿毒癥數(shù)據(jù)集的富集結(jié)果(圖5B)。篩選出與中性粒細(xì)胞活化相關(guān)的125個DEG(圖5C)和10個關(guān)鍵基因(圖5D),其中8個與成人膿毒癥數(shù)據(jù)集中篩選出的關(guān)鍵基因相同。成人的10個關(guān)鍵基因在兒童膿毒癥全血樣本表達(dá)上調(diào)(P<0.05;圖5E),ROC AUC均大于0.7,驗證關(guān)鍵基因?qū)和摱景Y亦有較好的診斷價值(圖5E)。兒童膿毒癥數(shù)據(jù)集免疫細(xì)胞的差異分析提示中性粒細(xì)胞上調(diào)最為顯著(圖5F;P<0.05),與成人膿毒癥數(shù)據(jù)集中的趨勢一致。

3 討 論

膿毒癥早期階段,局部感染未得以有效控制,導(dǎo)致固有免疫細(xì)胞的過度活化,最終爆發(fā)細(xì)胞因子風(fēng)暴;在后期,因早期免疫細(xì)胞的過度活化,大量免疫細(xì)胞損傷或死亡,使免疫抑制持續(xù)、免疫功能低下,最終導(dǎo)致繼發(fā)嚴(yán)重感染或膿毒癥的復(fù)發(fā)[7]。在膿毒癥中,中性粒細(xì)胞參與抗感染、炎癥誘導(dǎo)、組織病理損傷,合并出現(xiàn)功能障礙和遷移功能異常[8]。本文GO分析結(jié)果證實中性粒細(xì)胞活化是膿毒癥發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵環(huán)節(jié),也顯示了其可能的相關(guān)通路以及生物學(xué)過程,主要包括中性粒細(xì)胞激活、中性粒細(xì)胞脫顆粒、參與免疫反應(yīng)的中性粒細(xì)胞活化、中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的免疫;提示中性粒細(xì)胞活化是膿毒癥發(fā)生發(fā)展的重要分子生物學(xué)過程。鑒定篩選膿毒癥中性粒細(xì)胞活化關(guān)鍵基因,將為膿毒癥的早期診斷、治療干預(yù)的靶點選擇提供新線索。

本研究篩選出膿毒癥中性粒細(xì)胞活化相關(guān)的前10位樞紐基因為關(guān)鍵基因,分別為S100A12、CTSG、MPO、MMP9、MMP8、LCN2、ELANE、LTF、CAMP、DEFA4。S100A12、CTSG被報道由中性粒細(xì)胞分泌[9-10]。S100A12是S100亞家族中的一種蛋白,該蛋白被認(rèn)為參與特定的鈣依賴性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,在感染性疾病中發(fā)揮重要的生物學(xué)作用。S100A12在新生兒敗血癥中顯著升高,可被視為其新的生物標(biāo)志物。在膿毒癥誘導(dǎo)的急性呼吸窘迫綜合征(aute respiratory distress syndrome,ARDS)中,S100A12可通過激活NLRP3胞質(zhì)體信號促進(jìn)膿毒癥誘導(dǎo)的ARDS中的炎癥和細(xì)胞凋亡,S100A12可能是膿毒癥誘發(fā)的ARDS臨床診斷中肺損傷的有關(guān)生物標(biāo)志物[11]。CTSG可修飾趨化因子、細(xì)胞因子和細(xì)胞表面受體而在炎癥和免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用,還能消滅中性粒細(xì)胞內(nèi)外病原體[12],GTSG在膿毒癥中暫未有研究報道,但有著潛在的研究價值。MPO是中性粒細(xì)胞激活的標(biāo)志,在炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[13]。在T?rnblom等[14]的一項研究中發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞活化標(biāo)志物MPO,MPO的升高是膿毒癥演變的早期事件,持續(xù)時間超過促炎細(xì)胞因子白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-6、IL-8反應(yīng)消退的時間,不易受到采樣時間影響,未來可能作為早期膿毒癥診斷的可靠指標(biāo)。Bonaventura等[15]研究結(jié)果表明MPO升高可提示中性粒細(xì)胞的早期過度激活并提示預(yù)后不良。ELANE是絲氨酸蛋白酶的一個亞家族,水解專門的中性粒細(xì)胞溶酶體中的蛋白質(zhì)、嗜藍(lán)粒細(xì)胞顆粒以及細(xì)胞外基質(zhì)。研究報道人類嗜中性粒細(xì)胞釋放ELANE選擇性殺死多種癌細(xì)胞[16]。研究發(fā)現(xiàn),ELANE相關(guān)的中性粒細(xì)胞減少與感染密切相關(guān)[17]。在Gu等[18]的研究中,發(fā)現(xiàn)在體外miR-608結(jié)合ELANE mRNA編碼區(qū)的靶位點,并抑制其在人單核細(xì)胞中的表達(dá),可能是診斷或治療膿毒癥的新靶點。MMP9可以保護(hù)中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶活性,還能從IL-8上分解一個62氨基酸肽,使其向中性粒細(xì)胞的趨化活性增加10倍,這種酶可能通過IV型膠原和彈性蛋白的蛋白水解在退行性和炎癥性疾病中發(fā)揮作用[19]。研究顯示MMP9在膿毒癥患者中上調(diào)[20-21],提示MMP9未來可能作為膿毒癥的一個潛在治療靶點。MMP8也被報道在膿毒癥中上調(diào),與其預(yù)后不良和介導(dǎo)白細(xì)胞黏附相關(guān)[22]。LTF存在于中性粒細(xì)胞的特定顆粒中,LTF水平升高可能是中性粒細(xì)胞活化的標(biāo)志。在Anderson等[23]的研究中,與其他病理相比,膿毒癥組中LTF的水平升高。LCN2可作為膿毒癥相關(guān)的ARDS、腎損傷及腦功能障礙的生物標(biāo)志物[24-25]。在LPS誘導(dǎo)的敗血癥模型中,LCN2敲除小鼠表現(xiàn)出鐵代謝失調(diào),白細(xì)胞凋亡,促炎細(xì)胞因子釋放和死亡率增加[26]。DEFA4是由DEFA4基因編碼的人類防御素肽,在中性粒細(xì)胞顆粒中表達(dá),可保護(hù)宿主免受細(xì)菌和病毒的侵害[27]。以上研究結(jié)果支持了本次生物信息學(xué)的篩選結(jié)果。

綜上所述,本研究篩選出膿毒癥中性粒細(xì)胞活化相關(guān)的關(guān)鍵基因10個,并進(jìn)行了驗證。10個關(guān)鍵基因可能參與中性粒細(xì)胞活化的多個信號途徑,從而在膿毒癥的發(fā)病過程中起重要作用;為未來膿毒癥的早期診斷、預(yù)后判斷及治療提供新思路。