DLBCL患者血Th22細胞、IL-22水平及IL-22對DLBCL細胞株增殖和侵襲的影響

張靈, 范凌, 郝杰, 張陽, 靳艷麗, 高炳華

河北北方學院附屬第一醫(yī)院血液科,河北張家口 075000

彌漫性大B細胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL)是一種來源于成熟B細胞的侵襲性腫瘤,是最常見的非霍奇金淋巴瘤,約占全部非霍奇金淋巴瘤的30%～40%[1]。DLBCL臨床異質(zhì)性大,發(fā)病機制和發(fā)展較復雜,具體機制尚不清楚,探究DLBCL的發(fā)病機制、尋找新的治療靶點具有重要意義。大量研究表明免疫細胞在DLBCL發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用[2]。輔助性T細胞22(helper T cell 22,Th22)是最新發(fā)現(xiàn)的輔助性T細胞亞群,由幼稚的CD4+T細胞在白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)以及漿細胞樣樹突狀細胞協(xié)同下分化而來,其主要分泌IL-22和TNF-α等細胞因子[3]。其中,IL-22是Th22細胞亞群的主要效應(yīng)細胞因子。Th22細胞已被揭示在先天免疫性疾病、感染性疾病、慢性炎癥性疾病及腫瘤中發(fā)揮重要作用[4],Th22細胞及其細胞因子IL-22與血液病發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。然而關(guān)于Th22細胞及其分泌的細胞因子在DLBCL中作用的文獻報道較少。因此,本文分析DLBCL患者血Th22細胞、IL-22水平及IL-22對DLBCL細胞株增殖和侵襲的影響,為臨床提供參考。

1 資料和方法

1.1 一般資料

選擇本院2022年1月—2022年12月收治的40例DLBCL患者(DLBCL組),男性22例,女性18例,年齡33～75歲;按照臨床分期分為不同亞組,Ⅰ期7例,Ⅱ期12例,Ⅲ期13例,Ⅳ期8例。納入標準:①符合《淋巴漿細胞淋巴瘤/華氏巨球蛋白血癥診斷與治療中國指南(2022年版)》[5]診斷標準;②患者及家屬簽署知情同意書。排除標準:①由其他淋巴瘤轉(zhuǎn)化而來的、原發(fā)縱隔的、原發(fā)中樞的、原發(fā)皮膚的DLBCL,有其他惡性腫瘤史;②心腦血管、肝、腎、自身免疫性疾病及造血系統(tǒng)其他嚴重原發(fā)性疾病;③幽門螺桿菌、巨細胞病毒、乙肝病毒感染。同期選取40例體檢健康成年人為對照組。兩組性別、年齡比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),具有可比性。本研究經(jīng)本院倫理審查委員會批準。

1.2 主要試劑與儀器

人淋巴細胞分離液購自美國Sigma-Aldrich公司;CD4-PerCP、γ干擾素(interferon-γ,IFN-γ)-FITC、IL-22-PE、IL-17-Alexa Fluor抗體由eBioScience公司提供;酶聯(lián)免疫試劑盒由英國Abcam公司提供;人DLBCL細胞株SU-DHL-4和TOLEDO購自中國科學院北京細胞庫;胎牛血清由美國Gibco公司提供;RPMI-1640培養(yǎng)基由瑞士Lonza公司提供。二氧化碳細胞培養(yǎng)箱由上海力康公司提供;流式細胞儀由美國貝爾曼庫爾特公司提供;酶標儀由美國Thermo公司提供。

1.3 流式細胞術(shù)檢測Th22細胞亞群

DLBCL組新診、化療前后,以及復發(fā)者于來院第2日清晨空腹取外周血;對照組于體檢當日取外周血。每管加入等體積PBS稀釋,稀釋后的血液加入到人淋巴細胞分離液中,采用密度梯度離心法分離出單個核細胞,PBS沖洗并沖懸,加入CD4-PerCP、IFN-γ-FITC、IL-22-PE、IL-17-Alexa Fluor抗體染色,4 ℃避光孵育30 min,采用流式細胞儀檢測分析CD4+IFN-γ-IL-17-IL-22+(Th22)細胞占CD4+IFN-γ-T細胞的比例。

1.4 ELISA法檢測IL-22水平

對照組于體檢當日取外周血,DLBCL組于入院第2日清晨空腹取外周血,離心10 min取上清液。按照ELISA試劑盒說明書測定IL-22蛋白水平。

1.5 細胞培養(yǎng)

將人DLBCL細胞株SU-DHL-4和TOLEDO置于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中,37 ℃、5%CO2培養(yǎng),取處于對數(shù)生長期的細胞用于后續(xù)實驗。

1.6 MTT實驗檢測細胞增殖

將SU-DHL-4、TOLEDO細胞分別以1×105個/孔接種于96孔板,干預(yù)組每孔加入150 μL不同質(zhì)量濃度的IL-22(0、50、100、150、200 μg/L),對照組加入相同體積培養(yǎng)基。孵育48 h后每孔加入50 μL 0.25 g/L MTT,37 ℃孵育4 h后,加入200 μL DMSO,用酶標儀在570 nm波長處讀取每孔光密度(optical density,OD)值。

1.7 Transwell實驗檢測細胞侵襲

用基質(zhì)膠包被Transwell小室底部膜的上室面,4 ℃風干,使用前進行基底膜水化。SU-DHL-4和TOLEDO細胞中加入200 μg/L IL-22培養(yǎng)48 h,對照組未經(jīng)IL-22處理。隨后將1×105個細胞加入上室,含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基600 μL加入下室,37 ℃、5%CO2培養(yǎng)24 h。顯微鏡下觀察過膜細胞并將其用乙酸漂白染色,結(jié)晶紫洗脫,觀察細胞并進行細胞計數(shù)。

1.8 統(tǒng)計學分析

2 結(jié) 果

2.1 各組外周血Th22細胞比例、IL-22水平的比較

與對照組比較,DLBCL組外周血Th22細胞比例和IL-22水平升高(P<0.05;圖1和表1)。與臨床分期Ⅰ～Ⅱ期比較,Ⅲ～Ⅳ期DLBCL患者外周血Th22細胞比例和IL-22水平升高(P<0.05;表1)。

表1 各組Th22細胞比例及IL-22水平的比較

圖1 流式細胞術(shù)檢測Th22細胞比例

2.2 化療前后、復發(fā)和新診DLBCL患者Th22細胞比例的比較

檢測10例DLBCL患者化療1～2個周期后外周血Th22細胞比例發(fā)現(xiàn),化療后Th22細胞比例低于化療前(P<0.05;圖2A)。檢測9例復發(fā)DLBCL患者的Th22細胞比例發(fā)現(xiàn),復發(fā)患者的Th22細胞比例高于新診患者和對照組(P<0.05;圖2B)。

圖2 化療前后、復發(fā)和新診DLBCL患者Th22細胞比例的比較a為P<0.05,與治療前或?qū)φ战M比較。

2.3 IL-22對DLBCL細胞增殖的影響

IL-22作用48 h后,SU-DHL-4和TOLEDO細胞增殖OD隨IL-22質(zhì)量濃度的增加而增加(P<0.05;圖3),這說明IL-22能促進DLBCL細胞增殖。對OD值進行線性分析(圖3虛線)發(fā)現(xiàn),TOLEDO細胞增長變化斜率大于SU-DHL-4細胞,提示IL-22對TOLEDO細胞的促增殖作用可能大于SU-DHL-4細胞。

圖3 IL-22對DLBCL細胞增殖的影響a為P<0.05,與同細胞0、50 μg/L比較;b為P<0.05,與同細胞100 μg/L比較。

2.4 IL-22對DLBCL細胞侵襲的影響

Transwell實驗結(jié)果表明,與對照組比較,IL-22組SU-DHL-4和TOLEDO細胞侵襲數(shù)目明顯增加(P<0.05;表2),提示IL-22能夠促進DLBCL細胞侵襲。

表2 IL-22對DLBCL細胞侵襲(細胞數(shù)目)的影響

3 討 論

DLBCL是一組在基因?qū)W、形態(tài)學、臨床特征、治療及預(yù)后上都具有非常大異質(zhì)性的侵襲性腫瘤[6]。DLBCL在中位年齡為70歲的老年患者中更為普遍,但也發(fā)生在年輕人中,很少發(fā)生在兒童中[7]。臨床上,大多數(shù)患者表現(xiàn)為一個快速增長的腫塊,涉及一個或多個淋巴結(jié)和結(jié)外部位[8]。目前,DLBCL的常規(guī)治療方案是利妥昔單抗聯(lián)合CHOP化療,但仍有部分患者出現(xiàn)難治和復發(fā)的情況[9]。因此,對DLBCL發(fā)病機制的研究是必要的,這將為DLBCL的治療提供理論基礎(chǔ)和臨床指導。

了解免疫系統(tǒng)如何影響腫瘤的發(fā)生和發(fā)展仍然是腫瘤學中最具挑戰(zhàn)性的問題之一。Th22細胞被定義為CD4+IFN-γ-IL-17-IL-22+細胞,與已知的Th1和Th17細胞亞群比較,Th22細胞是一種新發(fā)現(xiàn)的獨立的Th細胞亞群[10-11]。研究發(fā)現(xiàn),Th22細胞在腫瘤中起著重要作用,Th22細胞能夠激活肺癌JAK-STAT3/MAPK/AKT信號通路,促進腫瘤細胞增殖和遷移[12]。此外,Th22細胞也與胰腺癌、結(jié)直腸癌的不良預(yù)后有關(guān)[13-14]。本研究發(fā)現(xiàn),與健康個體比較,DLBCL患者外周血Th22細胞比例顯著升高,說明Th22細胞可能參與DLBCL的發(fā)生、發(fā)展。

在胃癌和宮頸癌中,Th22細胞比例增加與疾病的進展相關(guān),并預(yù)示著較差的生存率[15-16]。本研究發(fā)現(xiàn),Th22細胞比例增加與DLBCL患者較差的化療效果相關(guān)。除此之外,本研究發(fā)現(xiàn),與Ⅰ～Ⅱ期比較,Ⅲ～Ⅳ期DLBCL患者外周血Th22細胞比例和IL-22水平升高。綜上,外周血Th22細胞比例可作為DLBCL患者臨床療效及預(yù)后的預(yù)測因子。

為了研究IL-22對DLBCL細胞的作用,本研究進一步設(shè)計了體外實驗發(fā)現(xiàn),IL-22能夠促進DLBCL細胞增殖和侵襲,這與文獻[17]研究結(jié)果一致,文獻[17]發(fā)現(xiàn),胰腺癌中IL-22通過活化STAT3通路促進癌細胞增殖、遷移和侵襲。因此,IL-22在DLBCL中具有促瘤效應(yīng),而不具有抗腫瘤的免疫功能。此外,本研究發(fā)現(xiàn),TOLEDO細胞比SU-DHL-4細胞對IL-22更敏感,這說明IL-22對非生發(fā)中心來源DLBCL的促瘤作用更強。阻斷IL-22可作為DLBCL患者的潛在治療靶點。

總之,DLBCL患者外周血Th22細胞比例及IL-22水平升高,Th22細胞比例與DLBCL患者臨床分期及對化療的反應(yīng)有關(guān);IL-22能夠促進DLBCL細胞增殖和侵襲,提示Th22細胞及其細胞因子IL-22可能促進DLBCL的發(fā)生發(fā)展,Th22細胞可作為DLBCL患者臨床療效及預(yù)后的預(yù)測因子,本研究為臨床DLBCL藥物研發(fā)、治療及預(yù)后提供新策略。