南疆棉桿黃腐酸制備及對土壤性質(zhì)的影響

陸淑芬 胡紹啟 嚴(yán)成旭 時春輝*

1 新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第一師環(huán)境監(jiān)測站 阿拉爾 843300

2 塔里木大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院 阿拉爾 843300

本試驗(yàn)對新疆棉桿中生化黃腐酸的提取進(jìn)行了探究。經(jīng)閱讀國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，發(fā)酵法與硝解法均可以作為制備生化黃腐酸的方法，由于發(fā)酵法較硝解法具有更環(huán)保、更綠色的優(yōu)勢，通過比較，本文選用微生物發(fā)酵法制備生化黃腐酸，硝解法作為對照試驗(yàn)。試驗(yàn)中探尋了發(fā)酵法對新疆棉桿中生化黃腐酸的提取，總結(jié)得出了發(fā)酵法對應(yīng)的最佳提取條件，并對提取的生化黃腐酸進(jìn)行了實(shí)際應(yīng)用，總結(jié)得出了生化黃腐酸對土壤多方面性質(zhì)的影響，以期為棉桿中生化黃腐酸的制備及其在土壤改良方面的應(yīng)用提供合理的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

棉桿取自于距離塔里木大學(xué)北門外2 公里處隸屬十團(tuán)的商用棉花地；新疆維吾爾自治區(qū)阿拉爾市周邊的農(nóng)田土壤（以下簡稱新疆土壤）、湖北省恩施苗族土家族自治州利川市團(tuán)堡鎮(zhèn)周邊的農(nóng)田土壤（以下簡稱湖北土壤）、甘肅省隴南市武都區(qū)隆興鎮(zhèn)周邊的農(nóng)田土壤（以下簡稱甘肅土壤）、四川省米易縣白馬鎮(zhèn)黃草回族村十四社周邊的農(nóng)田土壤（以下簡稱四川土壤）。

電熱恒溫培養(yǎng)箱DHP-9162（上海善志儀器設(shè)備有限公司）、紫外-可見分光光度儀UV1700PC（上海奧析科學(xué)儀器有限公司）、FTIR-紅外光譜儀LP-FTIR-300（智南精工儀器工廠）、臺式離心機(jī)TDL80-2B9（上海安亭科學(xué)儀器廠）、數(shù)顯恒溫水浴鍋HH-1（上海梅香儀器有限公司）、pH 計(jì)E-201F（雷磁凱利玻儀器有限公司）。鄰菲羅啉，分析純（AR）（上海山浦化工有限公司）；硝酸，分析純（AR）（天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司）；生化黃腐酸標(biāo)樣，分析純（AR）（上海阿拉丁控股集團(tuán)）。

主要菌種：芽孢桿菌（BacillusC.）、木霉菌（Trichoderma sppP.）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiaeH.），均由河南沃寶生物科技有限公司生產(chǎn)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 生化黃腐酸的形成

本研究先采用發(fā)酵法將棉桿發(fā)酵成富含生化腐植酸的發(fā)酵物，在棉花進(jìn)行機(jī)械采摘過程后，截取根部以上棉桿，除去殘留葉片與花苞。修剪棉桿至5 ～8 cm 小段，使用鼓風(fēng)干燥箱在60 ℃恒溫烘干。烘干后剪碎并用粉碎機(jī)粉碎，過40 目篩[1]，得到棉桿粉末。取粉碎好的棉桿50 g 置于培養(yǎng)皿中，菌種采用芽孢桿菌、木霉菌、釀酒酵母的混合菌種，其用量比例為2 ∶1 ∶2，菌種活化采用混合菌種20 g、玉米粉40 g、超凈水200 mL，30 ℃恒溫培養(yǎng)3 d，取懸液。每一份樣品取5 mL 菌液，用超凈水調(diào)節(jié)棉桿粉含水量至60%～70%，置于恒溫培養(yǎng)箱中分別在不同的溫度梯度下以及不同的發(fā)酵時間梯度下進(jìn)行恒溫發(fā)酵。

1.2.2 生化黃腐酸的提取及收率測定

發(fā)酵后的提取過程采用堿溶酸析法[2，3]，生化黃腐酸粗品利用容量法測定，其中黃腐酸收率的計(jì)算公式如下[4]：

式中，V1——樣品消耗硫酸亞鐵銨標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積，mL；V0——空白對照消耗硫酸亞鐵銨標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液體積，mL；K——不同黃腐酸來源碳系數(shù)，本次試驗(yàn)黃腐酸碳系數(shù)為0.49[4]；c——硫酸亞鐵銨標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液濃度，mol/L；m——試樣質(zhì)量，g；x——生化黃腐酸收率，%。

1.2.3 生化黃腐酸的紫外定性分析

本研究采用紫外-可見分光光度儀測量樣品黃腐酸的吸光度。將此次研究所得到的不同條件下的黃腐酸溶于0.05 mol/L 的碳酸氫鈉溶液中，配成濃度為100 mg/L 的溶液，用紫外-可見分光光度儀，在波長為190 ～350 nm 下測定出黃腐酸的相應(yīng)吸光度，以探究制備的棉桿黃腐酸和標(biāo)準(zhǔn)品性質(zhì)是否相同。

1.2.4 生化黃腐酸E4/E6測定及紅外測定

將此次研究所得到的不同條件下的黃腐酸溶于0.05 mol/L 的碳酸氫鈉溶液中，配成濃度為100 mg/L 的溶液在紫外- 可見分光光度儀上對比465 nm（E4）和665 nm（E6）吸光度，以探究生化黃腐酸的縮合程度和芳構(gòu)化程度。另外，通過紅外吸收光譜的測定分析，以探究所得產(chǎn)品出現(xiàn)的芳香化結(jié)構(gòu)及共軛結(jié)構(gòu)。

1.2.5 對初始土壤性質(zhì)的測定

將取回的土壤去除其中的枯枝、根系、殘留物等雜質(zhì)，研磨后過2 mm 篩裝入密封袋中備用。采用烘干法測定每種土壤的含水量，先稱取10 g土壤，將土壤裝入試管中放入140 ℃的烘箱內(nèi)烘干4 h，稱量剩余土壤的重量，濕重與干重的差值即為土壤含水量；取25 mL 1 mol/L KCl 溶液，加入質(zhì)量比為1 ∶5 的土壤，搖勻，靜置30 min 后，用pH 計(jì)測定浸出液pH 值，即為土壤pH 值。

1.2.6 利用生化黃腐酸培養(yǎng)土壤的方法

將4 種土壤每組分別稱取100 g 于燒杯中，每類土壤共稱取7 組。每組土壤中依次加入0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 g 生化黃腐酸，將生化黃腐酸與土壤充分?jǐn)嚢瑁旌暇鶆颍缓髮胖迷谑覝亍⑼L(fēng)的條件下模擬自然環(huán)境進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)40 d。培養(yǎng)完成后，再測定土壤各項(xiàng)指標(biāo)變化。

1.2.7 探究生化黃腐酸對土壤飽和導(dǎo)水率的影響

土壤飽和導(dǎo)水率系在單位水壓梯度下，通過垂直于水流方向的單位土壤截面積的水流速度，又稱土壤滲透系數(shù)。本法可在田間進(jìn)行測定，但易受下層土體性質(zhì)的影響。在飽和水分的土壤中，土壤的飽和導(dǎo)水率（滲透系數(shù)）是根據(jù)達(dá)西（H. Darcy）定律，在預(yù)定時間將滲透筒取出，掛在適當(dāng)位置，漏斗下接一燒杯。在滲透筒在上部加8 cm 深的土層，在土層上方加入蒸餾水使之一直保持水層深度為10 cm，待漏斗下面滴下第1 滴水時開始用秒表計(jì)時，記錄30 min 每種土樣的滲水量并分別用量筒計(jì)量滲透過水量Q1、Q2、Q3……Qn。試驗(yàn)所用的土壤在培養(yǎng)土樣40 d[5]之后，測定土壤飽和導(dǎo)水率變化情況。其中，生化黃腐酸對土壤飽和導(dǎo)水率的影響采用滲透筒法進(jìn)行探究，按下式進(jìn)行計(jì)算[6，7]。

式中，Q——流量，滲透過一定截面積S（cm2）的水量，mL；L——飽和土層厚度，滲透經(jīng)過的距離，cm；S——滲透筒的橫截面積，cm2；t——滲透過水量Q時所需的時間，s；h——水層厚度，水頭（水位差），cm；K——飽和導(dǎo)水率（滲透系數(shù)），cm/s。

1.2.8 探究生化黃腐酸對土壤飽和含水量的影響

土壤飽和含水量是指在自然條件下，土壤孔隙全部充滿水分時的含水量，包括毛管孔隙和非毛管孔隙含水量。它代表土壤最大容水能力，也就是土壤顆粒間所有孔隙都充滿水時的含水量[8]。首先稱量含水土樣的質(zhì)量，然后稱量去除水分后的土樣質(zhì)量，將土樣分批次放入120 ℃的烘箱中烘干6 h 除去土樣中的結(jié)合水，取10 g 干土于透明玻璃管中，裝柱后向土柱中滴加蒸餾水，待土柱下方第1 滴液體流出時停止滴加，靜止10 min 土柱，稱量濕土重量。濕土質(zhì)量減去干土質(zhì)量，即為土樣飽和含水量。

2 結(jié)果與分析

2.1 處理時間對生化黃腐酸收率的影響

發(fā)酵試驗(yàn)中通過改變發(fā)酵時間進(jìn)行單因素試驗(yàn)。隨著發(fā)酵時間的延長，生化黃腐酸收率增加，含量在10 ～15 d 出現(xiàn)最高區(qū)間。從圖1 可觀察出15 d 發(fā)酵出的生化黃腐酸最多；5 d 生化黃腐酸提取量過少是由于發(fā)酵時間過短導(dǎo)致發(fā)酵不完全；而20 d 生化黃腐酸含量低可能是由于缺氧導(dǎo)致其他微生物生長，在20 d 培養(yǎng)皿中可以明顯觀察到綠色和白色的菌絲。通過改變提取時間，進(jìn)行單因素試驗(yàn)。由圖2 可知，1.5 h 的提取結(jié)果明顯量少，2.5 h、3 h的收率并沒有很大的差距。綜合因素考慮，提取時間為2 h 在試驗(yàn)中成果最佳。

圖1 發(fā)酵時間對生化黃腐酸收率的影響Fig.1 Eff ects of fermentation time on the yield of biochemical fulvic acid

圖2 提取時間對生化黃腐酸收率的影響Fig.2 Eff ects of extraction time on the yield of biochemical fulvic acid

2.2 處理溫度對生化黃腐酸收率的影響

發(fā)酵試驗(yàn)中在不同恒溫培養(yǎng)箱設(shè)置不同溫度進(jìn)行有氧發(fā)酵，由圖3 可知，發(fā)酵溫度在35 ℃時，生化黃腐酸收率最高。25 ℃、40 ℃生化黃腐酸收率偏低，25 ℃可能是由于發(fā)酵溫度不在菌種適宜的發(fā)酵溫度區(qū)間，導(dǎo)致雜菌占據(jù)主導(dǎo)。通過改變提取溫度，進(jìn)行單因素試驗(yàn)。不同提取溫度單因素試驗(yàn)結(jié)果如圖4 所示，提取溫度愈高，生化黃腐酸收率愈大。65 ℃條件下收率突然降低，這種情況可能由于堿熱浸提溫度過高導(dǎo)致還未發(fā)酵的纖維或其他雜質(zhì)被分解成小于過濾袋縫隙的物質(zhì)，隨著濾液一起被提取。隨后酸析過程中轉(zhuǎn)變?yōu)辂}類，混入酸液中一起被烘干導(dǎo)致。綜合因素考慮，提取溫度60 ℃在試驗(yàn)成果中最佳。

圖3 發(fā)酵溫度對生化黃腐酸收率的影響Fig.3 Eff ects of fermentation temperature on the yield of biochemical fulvic acid

圖4 提取溫度對生化黃腐酸收率的影響Fig.4 Eff ects of extraction temperature on the yield of biochemical fulvic acid

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

考慮到發(fā)酵法中不同發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、提取溫度及提取時間對結(jié)果的影響不同，本研究通過SPSS（23 版）設(shè)置4 因素4 水平正交試驗(yàn)表（表1），采用正交試驗(yàn)進(jìn)行篩選。結(jié)果及直觀分析見表2，由極差分析可知4 個因素的影響大小為：發(fā)酵溫度>提取時間>發(fā)酵時間>提取溫度，通過方差分析，反應(yīng)各因素之間的顯著性差異，方差分析如表3所示，分析結(jié)果表明：4種因素中發(fā)酵溫度顯著；提取時間、發(fā)酵時間與提取溫度不顯著。通過正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)得出提取的最佳因素為：發(fā)酵溫度35 ℃、發(fā)酵時間15 d、提取溫度50 ℃、提取時間2 h，且最佳因素條件下生化黃腐酸的收率為40.39%。

表1 制備生化黃腐酸因素水平表Tab.1 Factor levels of biochemical fulvic acid preparation

表2 制備生化黃腐酸正交試驗(yàn)結(jié)果及分析Tab.2 Orthogonal experimental results and analysis of biochemical fulvic acid preparation

表3 制備生化黃腐酸收率的方差分析（α=0.05）Tab.3 Analysis of variance for the yield of biochemical fulvic acid preparation（α=0.05)

2.4 紅外光譜分析

圖5 為最優(yōu)制備條件下生化黃腐酸與標(biāo)樣的紅外光譜圖，樣品對比生化黃腐酸標(biāo)樣可以看出，紅外峰形基本一致，這表明樣品與黃腐酸標(biāo)樣的結(jié)構(gòu)大致相同；2 種物質(zhì)在3500 ～2500 cm-1出現(xiàn)明顯羥基吸收峰，說明兩者具有類似的羥基結(jié)構(gòu)；在1622 cm-1處出現(xiàn)了羰基的伸縮振動峰，而羰基的峰小于1700 cm-1說明樣品可能存在共軛作用，表現(xiàn)出生化黃腐酸的特性之一。在1034 cm-1都出現(xiàn)醇的碳氧單鍵的伸縮振動，在1379 cm-1出現(xiàn)脂肪族中的甲基吸收峰。由圖可知，2 種物質(zhì)雖然在光譜中有細(xì)微差異，峰形結(jié)構(gòu)基本一致，表明該試驗(yàn)制得的物質(zhì)為生化黃腐酸。

圖5 生化黃腐酸樣品與黃腐酸標(biāo)樣的紅外光譜圖Fig.5 Infrared spectra of biochemical fulvic acid and standard fulvic acid

2.5 紫外-可見吸收光譜分析

生化黃腐酸是由多種化學(xué)性質(zhì)相近的物質(zhì)組成的混合物，含有大量不飽和烴的共軛結(jié)構(gòu)、羧類以及一些具有芳香性的化合物。這些官能團(tuán)在紫外-可見光區(qū)域都有吸收值。本研究測量在190 ～350 nm 波長下的紫外-可見光譜數(shù)據(jù)，測量時設(shè)置波長10 nm 為間隔測試生化黃腐酸的紫外吸收峰值。由圖6 可知，黃腐酸標(biāo)樣與最優(yōu)條件下所制得的生化黃腐酸的紫外-可見光譜變化趨勢基本一致。2 份樣品在波長為210 nm 左右呈現(xiàn)一個最高峰值，隨后則是隨著波長增加吸收度不斷減少，發(fā)現(xiàn)研究所制取的樣品與標(biāo)品中結(jié)構(gòu)類似，為同一物質(zhì)。

圖6 生化黃腐酸樣品與標(biāo)樣黃腐酸的紫外-可見吸收光譜圖Fig.6 UV absorption spectra of biochemical fulvic acid and standard fulvic acid

2.6 E4/E6 比值分析

E4/E6即生化黃腐酸在465 nm 和665 nm 的吸光度值的比值，該比值能表征生化黃腐酸的基本特征、能表示出生化黃腐酸的縮合程度和芳構(gòu)化程度，測試結(jié)果見表4。發(fā)酵法制得的生化黃腐酸發(fā)酵時間5 d 與20 d 的E4/E6值明顯小于10 d 及15 d 的樣品。10 d、15 d 樣品的E4/E6值無較大差異，標(biāo)樣的E4/E6值略小于發(fā)酵法制得的生化黃腐酸樣品。說明標(biāo)樣的芳構(gòu)化程度大于發(fā)酵法制得生化黃腐酸樣品，分子量同樣大于制得的樣品。

表4 不同時間變量下發(fā)酵法制得的生化黃腐酸與標(biāo)樣的E4/E6 值變化Tab.4 Changes in E4/E6 values of biochemical fulvic acid obtained by fermentation method and standard samples under diff erent time variables

2.7 對初始土壤含水量、pH 值測定及土壤種類劃分

試驗(yàn)結(jié)果（表5）與我國土壤系統(tǒng)分類結(jié)合可知，試驗(yàn)采用的新疆土壤為砂質(zhì)土、湖北土壤為壤土、甘肅土壤為砂質(zhì)土、四川的土壤為壤土。

2.8 生化黃腐酸對土壤含水量的影響

在各組土樣培養(yǎng)40 d 后，將所有土樣補(bǔ)水至100 g，每2 d 記錄一次土樣剩余質(zhì)量，共記錄20 d即10 組數(shù)據(jù)（圖7）。結(jié)果表明：隨著生化黃腐酸的加入量增大，土樣的含水量也會隨之上升，這可能是由于生化黃腐酸是一種大分子多官能團(tuán)結(jié)構(gòu)，能吸附土樣中的水，以減緩?fù)翗又兴恼舭l(fā)。

圖7 不同土樣含水量的變化Fig.7 Changes in water content of diff erent soils

2.9 生化黃腐酸對土壤飽和含水量的影響

隨著最優(yōu)條件下制備的生化黃腐酸的加入，4種土壤的飽和含水量均有所提高，其中對四川土壤的影響最大，對新疆土壤的影響最小（圖8）。結(jié)果表明：生化黃腐酸可使土壤飽和含水量增大。

圖8 不同生化黃腐酸加入量對土壤飽和含水量的影響Fig.8 Eff ects of diff erent additions of biochemical fulvic acid on soil saturated water content

2.10 生化黃腐酸對飽和導(dǎo)水率的影響

隨著最優(yōu)條件下制備的生化黃腐酸的加入，4種土壤的飽和導(dǎo)水率均呈上升趨勢，而且加入量越多，土壤的飽和導(dǎo)水率也提升得越多（圖9）。其中，對甘肅土壤飽和導(dǎo)水率的提升效果最為明顯，當(dāng)加入量達(dá)到1.5 g 時，甘肅土壤的飽和導(dǎo)水率明顯上升；而對新疆土壤飽和導(dǎo)水率的提升效果最小。結(jié)果表明：生化黃腐酸能夠增加土壤的飽和導(dǎo)水率。

圖9 不同生化黃腐酸加入量對土壤飽和導(dǎo)水率的影響Fig.9 Eff ects of diff erent additions of biochemical fulvic acid on soil saturated hydraulic conductivity

2.11 生化黃腐酸對土壤pH 值的影響

每種、每組土壤均采用100 g，分別加入0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 g 生化黃腐酸，以探究添加不同比例生化黃腐酸對土壤pH 值的影響。

如圖10 所示，新疆土壤具有偏堿性，生化黃腐酸本身是弱酸，二者發(fā)生酸堿中和反應(yīng)，降低了新疆土壤的pH 值，使之趨于中性；相較于新疆土壤的偏堿性，其余3 種土壤具有弱酸性，而提取的生化黃腐酸中含有一定量的生化黃腐酸鹽，具有弱堿性，與3 種酸性土壤發(fā)生了酸堿中和反應(yīng)，升高了土壤的pH 值，使之趨于中性。由此說明，生化黃腐酸及其鹽組成了酸堿緩沖體系[9]。

圖10 不同生化黃腐酸加入量對土壤pH 值的影響Fig.10 Eff ects of diff erent additions of biochemical fulvic acid on soil pH value

3 結(jié)論

（1）在利用發(fā)酵法提取生化黃腐酸的試驗(yàn)中，通過單因素變量試驗(yàn)得出，發(fā)酵時間單因素變量試驗(yàn)最佳條件為15 d，發(fā)酵溫度單因素變量試驗(yàn)最佳條件為35 ℃，提取時間單因素試驗(yàn)變量最佳條件為2 h，提取溫度單因素變量試驗(yàn)最佳條件為60 ℃。正交試驗(yàn)結(jié)果如下，制備生化黃腐酸的最佳條件為發(fā)酵溫度35 ℃、發(fā)酵時間15 d、提取溫度50 ℃、提取時間2 h，收率40.39%。通過極差分析得出因素對試驗(yàn)影響大小排序?yàn)椋喊l(fā)酵溫度>提取時間>發(fā)酵時間>提取溫度。

（2）在利用生化黃腐酸改良土壤性質(zhì)的試驗(yàn)中得知：隨著生化黃腐酸加入量的增加，土壤的含水量會增加，加入量為1.5 g 之前含水量變化較為顯著，同時也增大了土壤的最大容水能力；加入量繼續(xù)增加后，含水量變化不明顯。隨著生化黃腐酸加入量的增大，土樣的飽和導(dǎo)水率也會隨之增加，出現(xiàn)這種情況考慮是由于生化黃腐酸的結(jié)構(gòu)有利于形成多孔的土壤團(tuán)聚體，從而增大了土壤的飽和導(dǎo)水率。生化黃腐酸本身是弱酸，可降低堿性土壤的pH 值；生化黃腐酸鹽用于酸性土壤，發(fā)生酸堿中和反應(yīng)，升高了土壤pH 值。由此，生化黃腐酸及其鹽組成了酸堿緩沖體系。