阿魏酸-煙酰胺共晶的氫鍵作用及紫外光照穩定性

摘要：制備了阿魏酸（FA）-煙酰胺（NIC）共晶，分析了FA 與NIC 在共晶時及溶液中的氫鍵作用，并研究了FA-NIC 共晶中FA 的水溶性和紫外光照穩定性。紅外光譜和Hirshfeld 表面分析結果表明，FA-NIC 共晶中FA 與NIC 在4 處位置存在氫鍵作用，其強弱順序為Ⅲ（O?H···O）gt;Ⅰ≈Ⅱ（ O···H?N） gt;Ⅳ（ O···H?C）。FA-NIC 共晶中的FA 比純FA 具有更低的紫外吸收和熒光強度，這說明FA-NIC 共晶在水溶液中并沒有完全解離，FA 與NIC 之間仍然存在氫鍵作用。相比純FA， FA-NIC 共晶中FA 在水中的溶解度提高了88%， FA 的紫外光照穩定性提高了12.7%，兩者的提高歸因于FA 與NIC 之間的氫鍵作用。

關鍵詞：阿魏酸；共晶；Hirshfeld 表面分析；氫鍵；紫外光照

中圖分類號：O641.3 文獻標志碼：A

阿魏酸（Ferulic Acid，FA） 是一種天然植物酚酸，廣泛存在于阿魏草、當歸等中草藥及谷物植物的種子和葉片中 [1]。由于分子中存在活潑的酚羥基和甲氧基，FA 具有抗氧化、抗衰、抗炎等重要生物活性，在醫藥、保健品、化妝品等領域有著廣泛的應用 [2-3]。FA的羧基和羥基易于水化，但苯環及含雙鍵的側鏈具有較高疏水性，這使得FA 在水中的溶解度很低[3-4]。在光照條件下，FA 側鏈中的雙鍵易發生翻轉，引起反式-順式光異構化，從而導致FA 對光不穩定[5]。通過使用固體分散劑、表面活性劑膠束，以及納米包載系統等可以改善FA 的水溶性和光穩定性[6-8]。

活性物共晶是利用晶體工程原理將活性物分子與配體分子通過氫鍵、π-π 共軛、范德華力等弱相互作用形成的晶體[9]。在不改變活性物分子結構的前提下，活性物共晶能夠改善活性物的溶解性和穩定性等物理化學性質。已有文獻報道FA 能與煙酰胺（NIC）、異煙酰胺、吡喹酮等形成共晶[10-11]。José等[12]用旋蒸法制備了FA-NIC 共晶，研究了FA-NIC 共晶在不同pH 溶液中的溶解性。Aitipamula 等[10]開發了具有良好水溶性、穩定性及緩釋效果的FA-異煙酰胺共晶。牛慧慧[13] 通過緩慢溶劑蒸發法制備了FA-4， 4 聯吡啶共晶，并利用粉末Ｘ射線衍射、紅外光譜和差示掃描量熱技術對共晶結構進行了表征。目前，通過共晶方式改善難溶性活性物的水溶性、穩定性及生物利用度已獲得廣泛認可[14]。但是，活性物共晶研究大多還集中于共晶制備、結構表征和性質測試等方面，關于共晶組分之間不同弱相互作用關系的研究還較少，活性物共晶溶解后的存在狀態也鮮有報道。

本文旨在對FA 與NIC 在共晶和溶解狀態下的氫鍵作用進行研究，考察其與FA 的水溶性和紫外光照穩定性之間的關系。使用紅外光譜和Hirshfeld 表面分析法研究了FA-NIC 共晶中存在的氫鍵作用，采用CrystalExplorer 17.5 軟件計算了FA-NIC 共晶的能量框架圖。相比于純FA，FA-NIC 共晶中FA 具有明顯增強的水溶性和紫外光照穩定性。

1 實驗部分

1.1 試劑和原料

FA（ 批號C14549352， 純度≥99%） 、NIC（ 批號201706271，純度≥99%）和乙醇（批號C15465664，純度≥99%），均購自上海麥克林生化科技有限公司，實驗用水為超純水。圖1 所示為FA 和NIC 的分子結構式。

1.2 FA-NIC 共晶制備

采用冷卻結晶法制備FA-NIC 共晶[15]。稱取FA0.194 1 g 和NIC 0.122 2 g，按1∶1 的物質的量之比溶于45 ℃ 的乙醇。所得溶液分別采用一步法、兩步法和三步法降溫冷卻。在一步法中，溶液由45 ℃ 直接降溫至5 ℃，然后恒溫5 h。在兩步法中，溶液首先由45 ℃ 降溫至15 ℃，恒溫1 h；再繼續降溫至5 ℃，恒溫5 h。在三步法中，溶液首先由45 ℃ 降溫至25 ℃，恒溫1 h；繼續降溫至15 ℃，恒溫1 h；再繼續降溫至5 ℃，恒溫5 h。最終析出的晶體經過濾和干燥后，得到FA-NIC 共晶。FA-NIC 共晶收率為所得共晶質量與初始添加FA 和NIC 總質量的比值。

1.3 共晶結構表征

采用D-max2550 型粉末X 射線衍射儀（ XRD，日本Rigaku 公司）、HCT-1 型差示掃描量熱儀（DSC，北京恒久公司）分別測定FA-NIC 共晶、FA 及NIC的晶體結構和熔點。X 射線衍射測定范圍為5°～40°，差示掃描量熱溫度測定范圍為25～200 ℃。

1.4 FA-NIC 共晶中的氫鍵和分子間作用能分析

采用INVENIO 型傅里葉變換紅外光譜儀（FTIR，美國Bruker 公司）分別測定FA-NIC 共晶、FA 及NIC 的紅外光譜，掃描范圍為4 000～500 cm?1。采用CrystalExplorer 17.5 軟件繪制FA-NIC 共晶中FA 的3D Hirshfeld 表面，計算不同弱相互作用占比及能量框架圖，能量計算方法為B3LYP，基組為 6-31G （d， p）。

1.5 紫外吸收和熒光光譜測定

使用Shimadzu UV-1800 型紫外光譜儀測定FANIC共晶和純FA 水溶液的紫外吸收曲線，掃描范圍為260～350 nm。使用RF5301 型熒光光譜儀測定FA-NIC 共晶和純FA 水溶液的熒光光譜，激發波長為320 nm，掃描范圍為350～500 nm。

1.6 溶解度測定

將FA-NIC 共晶和純FA 分別加入到10 mL 水中，超聲30 min 并靜置24 h。上層清液用0.45 μm 濾膜過濾，測定濾液在310 nm 處的紫外吸光度。根據FA 紫外吸光度-濃度標準曲線，計算FA-NIC 共晶中的FA 和純FA 在水中的溶解度。

1.7 紫外光照穩定性測定

使用4.5 W 紫外燈對FA-NIC 共晶及純FA 的水溶液進行照射，紫外光波長為290～320 nm。在不同的紫外光照時間，測定樣品在310 nm 處的紫外吸光度。

2 結果與討論

2.1 FA-NIC 共晶的制備條件和共晶結構

在溶液降溫冷卻過程中，活性物分子和配體分子在氫鍵等弱相互作用下共同析出，從而生成活性物共晶。活性物共晶的晶核形成和晶體生長受到溶液溫度、降溫速率、恒溫時間等條件影響[16]。在一步法、兩步法和三步法中，FA-NIC 共晶的收率分別為49.96%、51.01% 和51.21%，表明溶液在不同的降溫冷卻條件下FA-NIC 共晶收率沒有明顯差異，但FANIC共晶出現不同的晶體形貌。如圖2 所示，一步法得到的FA-NIC 共晶為粒徑約1～2 mm 的球狀顆粒，兩步法的共晶顆粒變小并出現少量絮狀晶體，而三步法得到的大多為絮狀晶體。在一步法中，溶液溫度由45 ℃直接降至5 ℃，過飽和度的突變會使晶核形成和晶體生長速度快，容易生成粒徑較大的球狀顆粒，甚至出現顆粒聚集現象。在兩步法和三步法中，中間冷卻時溶液也會析出少量粒徑較小的球狀顆粒。相比直接降溫至5 ℃，中間降溫階段會促使FA-NIC 共晶在二維方向上生長并產生一定的交聯。因此，溶液多步降溫冷卻條件有利于生成絮狀FA-NIC 共晶。在硝仿肼結晶工藝研究中，汪惠英[17]報道過晶體形貌隨降溫冷卻條件變化的類似結果。

不同的降溫冷卻條件得到的FA-NIC 共晶具有相同的X 射線衍射特征和熔點。圖3 所示為FANIC共晶的X 射線衍射和差示掃描量熱曲線。在13.7°和16.2°， FA-NIC 共晶出現了2 個新的X 射線衍射峰，而FA 和NIC 原來的特征衍射峰強度減弱，甚至部分消失。X 射線衍射曲線的變化表明FANIC共晶具有不同于原成分的晶體結構[10，12]。FA 和NIC 的熔點分別為169.8 ℃ 和127.6 ℃，而FA-NIC共晶的熔點為122.8 ℃。在FA-NIC 共晶樣品中，單一熔點的出現說明FA 和NIC 并不是物理混合，而是形成了共晶結構。相比于FA 和NIC，FA-NIC 共晶的熔點較低與其X 射線衍射峰強度減弱相一致。Schultheiss 等[18] 報道約39% 活性物共晶的熔點低于原成分的熔點。在共晶樣品中，活性物分子與配體分子之間的弱相互作用會改變原成分的晶體結構，有利于生成結晶度低、晶體強度弱的共晶結構。

2.2 FA-NIC 共晶中的氫鍵作用

紅外光譜技術可以用來檢測FA-NIC 共晶中成分之間的氫鍵作用[14]。FA 和NIC 分子中存在羥基、羰基和胺基，這些活潑基團之間能夠形成氫鍵作用。如圖4 所示，FA 在3 436 cm?1 處的羥基吸收峰與NIC 在3 366 cm?1 處的胺基吸收峰共同偏移至FA-NIC 共晶的3 428 cm?1 處，FA 在1 692 cm?1 和NIC在1 698 cm?1處的羰基吸收峰共同偏移至FA-NIC 共晶的1 679 cm?1 處。這些紅外特征吸收峰的變化說明，FA 的羥基、羰基與NIC 的胺基、羰基發生了氫鍵作用。同時，在FA-NIC 共晶的3 515 cm?1處出現新的紅外吸收峰，這與文獻[19] 報道的活性物共晶的紅外光譜結果一致。

在晶體工程領域，Hirshfeld 表面分析是一種可視化并定量檢測晶體成分分子間相互作用的重要手段[20]。圖5 示出了FA-NIC 共晶分子的3D Hirshfeld表面，深紅色或淡紅色圓斑點表示FA 與NIC 的氫鍵作用位點，白色區域和藍色區域表示FA 與其他遠距離弱分子間作用。在FA-NIC 共晶中，FA 與NIC 有4 處存在氫鍵作用， 如圖5（ a） 所示的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ處。Ⅰ、Ⅱ處表示FA 羰基上的O 原子作為氫鍵受體與NIC 胺基上的H 原子形成氫鍵作用（O···H?N），Ⅲ位置是FA 中的羧羥基作為氫鍵供體與NIC 羰基上的O 原子存在氫鍵聯系（ O?H···O） ， Ⅳ 位置是FA 中羧羥基上的O 原子作為氫鍵受體與NIC 吡啶環上的次甲基存在氫鍵作用（O···H?C）。通過比較紅色斑點的面積大小及顏色深淺，發現4 處氫鍵作用的強弱順序為Ⅲ（ O?H···O） gt;Ⅰ≈Ⅱ（ O···H?N） gt;Ⅳ（ O···H?C） 。在純FA 的分子間作用中， O···H和C···H 兩種氫鍵作用分別占比29.7%和12.2%。在FA-NIC 共晶中，O···H 和C···H 兩種氫鍵作用分別占比34.8% 和7.9%，同時新增1.5% 的N···H 氫鍵作用。FA-NIC 共晶和純FA 中總氫鍵作用分別占比44.2% 和41.9%，這說明FA-NIC 共晶比純FA存在更強的氫鍵作用[21]。

FA-NIC 共晶的能量框架圖不僅可以顯示同一晶層和相鄰晶層的FA 與NIC 存在分子間相互作用，而且能夠展現分子間作用能[22]。采用CrystalExplorer17.5 軟件計算了FA-NIC共晶的能量框架圖，如圖5（b）所示。其中藍色圓柱的粗細代表分子間作用能的大小，圓柱越粗說明分子間作用能越大。在同一晶層內，FA 與NIC 之間的藍色粗圓柱說明，FA 與NIC 兩種分子之間形成了較強的氫鍵作用。在相鄰晶層之間，FA 與NIC 之間存在多個藍色細圓柱，這說明不同晶層之間的分子間作用能較弱。馬得佳[22]計算了4 種布洛芬-吡啶衍生物鹽的能量框架圖，發現晶層內分子間作用能大于晶層之間的次級相互作用能，與本文結果類似。

2.3 FA-NIC 共晶的紫外吸收和熒光光譜

使用紫外吸收和熒光光譜技術研究了FANIC共晶在水溶液中的存在狀態。FA 分子含有苯環和雙鍵，分子結構具有高度共軛性，因此FA 具有特征紫外吸收和熒光光譜。如圖6 所示，純FA 水溶液在310 nm 和289 nm 處有2 個紫外吸收峰，分別對應于肉桂酰基和酚羥基的π-π*躍遷，同時在425 nm 附近有較強的熒光發射峰[23]。當FA-NIC 共晶溶于水后，FA-NIC 共晶同樣具有較強的紫外吸收和熒光光譜，但其強度均比純FA 低。由FA-NIC 共晶的能量框架圖可知，FA-NIC 共晶在不同晶層之間具有較弱的分子間作用能，這有助于FA-NIC 共晶在水中的溶解。但是，FA-NIC 共晶比純FA 表現出較低的紫外吸收和熒光強度，這說明FA-NIC 共晶在水溶液中并沒有完全解離，FA 與NIC 之間仍然保持氫鍵作用。在FA 與NIC 形成的Ⅰ～Ⅳ處氫鍵作用中，FA 側鏈中的羧基與NIC 的胺基及羰基的氫鍵聯系會降低FA 分子的共軛性，也會對FA 的熒光產生淬滅效應，從而減弱FA 的紫外吸收和熒光強度[23-24]。

2.4 FA-NIC 共晶的溶解度

FA 分子的高度共軛疏水結構導致其水溶性很差。純FA 在水中的溶解度為0.52 mg/mL，而FANIC共晶中FA 在水中的溶解度為0.98 mg/mL，FANIC共晶中的FA 比純FA 在水中的溶解度提高了約88%。相比純FA，FA-NIC 共晶的晶體強度較弱、晶層間作用能較低，這有助于FA-NIC 共晶在水中的溶解。同時，FA 與NIC 之間的氫鍵作用會增強FANIC共晶與水的整體親和力，促進FA 的溶劑化程度。所以，FA-NIC 共晶中FA 溶解度的提高與FANIC的共晶結構和FA 的溶劑化密切相關[25]。

2.5 FA-NIC 共晶的紫外光照穩定性

紫外光照會誘導FA 發生光異構化，由共軛程度較高的反式構型轉變為共軛程度較低的順式構型，這會導致FA 發生光降解[5]。圖7 所示為FA-NIC 共晶及純FA 在310 nm 處的相對紫外吸收強度隨紫外光照時間的變化曲線。310 nm 處FA 紫外吸光度的降低用來表示FA 的降解率[26]。在初始10 min，約21% 的純FA 發生降解，而FA-NIC 共晶中FA 僅有約11% 發生降解。在60 min，FA-NIC 共晶中FA 及純FA 的降解均接近平衡，兩者降解率分別為18.5%和31.2%。相比于純FA，FA-NIC 共晶中FA 的紫外光照穩定性提高了12.7%。在紫外光照下，FA 側鏈雙鍵中的兩個sp2 碳原子沿碳碳鍵旋轉，2 個p 軌道由sp2 態轉變為垂直方向的p2 態[5]。所以，紫外光照會誘導FA 側鏈雙鍵翻轉而發生光異構化， 導致FA 對紫外光照不穩定。在FA-NIC 共晶中， 由于FA 的羧基與NIC 的羰基及胺基存在氫鍵作用，這會對FA 的光異構化帶來空間阻礙，從而提高FA 的紫外光照穩定性[27]。

3 結 論

（1）Hirshfeld 表面分析結果表明，在FA-NIC 共晶中，FA 與NIC 之間在4 個位置處存在氫鍵作用，其強弱順序為Ⅲ（ O?H···O） gt;Ⅰ≈Ⅱ（ O···H?N） gt;Ⅳ（O···H?C）。

（2）紫外吸收和熒光光譜結果表明，FA-NIC 共晶在水溶液中并沒有完全解離，FA 與NIC 之間仍然保持氫鍵作用。

（3）FA 與NIC 之間的氫鍵作用會提高FA 的溶劑化程度，阻礙FA 的光異構化，從而顯著提高FANIC共晶中FA 的水溶性和紫外光照穩定性。

（4）上述研究結果不僅證實了FA-NIC 共晶的氫鍵作用及其對FA 的水溶性和紫外光照穩定性的影響，還為通過共晶方式提高難溶性活性物的水溶性及穩定性等物理化學性質提供有益指導。

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（責任編輯：張欣）

基金項目： 國家自然科學基金（22273022）