m6A RNA甲基化修飾在心血管疾病中的進展

顧天舒,梁 雪,蔡嘉庚,李廣平

(1.天津市心血管病離子與分子機能重點實驗室 天津醫科大學第二醫院心臟科 天津心臟病學研究所,天津 300211;2.北京大學第三醫院心內科 血管醫學研究所 衛生部心血管分子生物學與調節肽重點實驗室 分子心血管學教育部重點實驗室 心血管受體研究北京市重點實驗室,北京 100191)

N6-甲基腺苷 (N6-methyladenosine,m6A) 是20世紀70年代發現的真核mRNA上最豐富的內部表觀修飾,它是在腺苷的N6位點上添加一個由S-腺苷甲硫氨酸 (S-adenosyl methionine,SAM) 提供的甲基基團的一種表觀遺傳修飾[1]。在7000多個人類基因的轉錄本中,已鑒定出12000多個典型m6A位點[2]。m6A修飾可以促進mRNA剪接、翻譯起始和衰減的關鍵步驟的進行[3],在RNA代謝的各個方面發揮著基礎性作用。最近在動物、細胞模型及人類樣本水平上的研究揭示了m6A修飾在心血管功能穩態方面的關鍵作用。提示m6A可能是心血管疾病 (cardiovascular disease,CVD)潛在的生物標志物和治療靶點。全面了解m6A在CVD中的調控復雜性,將有助于我們了解CVD的發病機制。本文就m6A對CVD的調控作用做一綜述。

1 m6A RNA甲基化

m6A甲基化在編碼RNA (如mRNA) 和非編碼RNA (如rRNA、tRNA、小核RNA和環狀RNA) 上均有表達[4]。催化m6A甲基化的蛋白質成分被稱為甲基轉移酶或m6A書寫器,能夠識別這種甲基化的蛋白質家族被稱為甲基化閱讀蛋白或m6A閱讀器,最終參與RNA中甲基基團去除的酶被稱為去甲基酶或m6A修改器[4]。

1.1m6A甲基轉移酶 m6A甲基轉移酶是參與甲基轉移酶復合物形成的蛋白質,包括甲基轉移酶樣蛋白 (methyltransferase like,METTL)3和 METTL14及其輔因子WT1相關蛋白 (WT1 associated protein,WTAP)、RNA結合基序蛋白(RNA binding motif protein,RBM)15/15b、病毒樣m6A甲基轉移酶相關蛋白 (virlike m6A methyltransferase associated protein,VIRMA)、鋅指CCCH域含蛋白1等[5]。

已經在mRNA上鑒定出的最典型的甲基轉移酶是甲基轉移酶復合體,也稱為m6A書寫復合體,它的異源二聚體核心由METTL3 和METTL14 構成。METTL3是一個催化亞基,METTL14是一個促進RNA連接的復雜亞基[6]。甲基轉移酶復合體中第三個重要的甲基轉移酶是與METTL3-METTL14相互作用的WTAP[7]。在m6A書寫復合體中,METTL3是具有催化m6A甲基轉移酶的酶活性的亞基,它作為一個RNA甲基化的全局調節器,在METTL14的幫助下與目標RNA結合,其作用的特異性取決于mRNA不同區域的原動力,且與細胞狀態轉換相關聯,當細胞失去穩態時,METTL3觸發細胞內mRNA的整體甲基化,通過調節mRNA的不同亞群來決定細胞的功能和命運[8]。

值得注意的是,除了上述以復合物形式發揮作用的甲基轉移酶外,METTL3的一個同源物：METTL16已被鑒定為一種新的獨立的RNA甲基轉移酶,它調節細胞SAM水平和U6小核RNA甲基化;最近發現,METTL16還對DRACH基序外環或二級結構中的腺苷基具有特異性的催化作用[9]。此外,還有一個m6A書寫器,VIRMA,也被稱為KIAA1429,是m6A在3'UTR和停止密碼子周圍沉積所必需的[10]。

1.2m6A去甲基化酶 m6A去甲基化酶是一種脫甲基酶蛋白,可以動態地去除m6A標記。肥胖基因相關蛋白(fat mass and obesity-associated protein,FTO)是第一個被證實能催化m6A去甲基化的蛋白質[11]。第二個被發現的m6A去甲基化酶是AlkB同源蛋白5 (AlkB homolog 5,ALKBH5),是FTO的同源物,與其一同維持轉錄組中m6A水平的平衡[12]。雖然FTO和ALKBH5都屬于依賴于α-酮戊二酸的雙加氧酶家族,但這兩種去甲基化酶在組織中的表達譜差異、不同的細胞內亞定位,以及兩者不同的晶體結構,共同導致了兩種蛋白的底物特異性[13]。

已知ALKBH5只作用于m6A,而FTO也可以將N6,2′-O-二甲基腺苷 (N6,2′-O-dimethyladenosine,m6Am) 和 N1-甲基腺嘌呤修飾的RNA脫甲基[14]。有趣的是,既往報道稱FTO比m6A更傾向于催化m6Am[15],而最新的生物化學研究發現,FTO的去甲基化活性對于相同 RNA 序列中的內部m6A和m6Am是相同的[16]。這些研究發現,FTO在細胞核和細胞質中表現出不同的底物偏好,在不同類型的細胞中具有不同的定位模式。值得注意的是,最新的研究發現了一種新的m6A去甲基化酶RBM33,通過與ALKBH5形成復合物,在ALKBH5介導的mRNA m6A去甲基化中起關鍵作用[17]。

1.3m6A甲基化閱讀蛋白 m6A的功能被 “m6A閱讀器”識別,即甲基化閱讀蛋白,也被稱作m6A結合蛋白。目前m6A結合蛋白包括同源域(YT521-B homology,YTH)結構域蛋白家族,即YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3、YTHDC1、YTHDC2;核異質核糖核蛋白家族(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein,HNRNP),包括HNRNP A2/B1和HNRNPC等;以及胰島素樣生長因子2 mRNA結合蛋白 (Insulin Like Growth Factor 2 mRNA Binding Protein 3,IGF2BPs)[18]。

YTH蛋白家族中進化保守的YTH結構域可以選擇性識別m6A。YTHDC2可能在調控mRNA穩定性方面發揮作用[19],且其對m6A的選擇性識別在胚胎分化過程起到重要作用[20]。YTHDF1和YTHDF3在細胞質中協同工作,以增強目標mRNA的翻譯,而YTHDF2已被證明通過使m6A修飾的RNA在mRNA衰變機制中局部化,從而影響其穩定性。YTHDC2可以促進其靶點的翻譯效率,同時通過與不同的結合蛋白相互作用降低RNA的穩定性。而YTHDC1作為唯一的核m6A閱讀蛋白,調控其靶蛋白的核加工過程,包括選擇性剪接、m6A修飾mRNA的輸出和染色質相關RNA的轉換[21]。

相比之下,HNRNPC和HNRNPG不能直接結合m6A位點,但它們可以通過識別和結合依賴于m6A的結構靶點來介導包含m6A修飾的轉錄本的選擇性剪接過程[22]。真核起始因子3通過結合mRNA的5 '-UTR中的m6A位點啟動翻譯過程,而IGF2BPs(包括IGF2BP1/2/3) 使靶基因和相應的翻譯更加穩定[23]。此外,富含脯氨酸的卷曲螺旋2a是一種新型的m6A結合蛋白,它通過與編碼序列中的一致GGACU模體結合,以依賴于m6A的方式穩定mRNA的表達[24]。

2 m6A甲基化修飾與缺血性心肌病

2.1m6A甲基化修飾與動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS) AS是心肌梗死、中風和冠心病等CVD的潛在原因[25]。AS是指由脂質和纖維成分組成的斑塊在血管壁上不斷積聚,最終形成AS壞死病變[26]。AS是冠心病的發展階段之一,隨著心肌長期缺血導致心肌收縮力下降,最終發展為心力衰竭[27]。血管內皮細胞與血管再生、血管舒張、血管炎癥等血管生理學密切相關。血管內皮細胞的增殖和侵襲影響AS斑塊的穩定性、血小板活化和AS并發癥的發生。

內皮細胞在功能和結構上的完整性對于維持血管穩態是必不可少的,血管內皮細胞的功能障礙被認為是AS起始和進展的一個因素[28]。氧化低密度脂蛋白 (oxidized low density lipoprotein,ox-LDL) 通過誘導內皮細胞的激活和功能障礙等多種機制調控AS的發展,是AS的主要危險因素[29]。Dong等[30]建立由ox-LDL處理的人臍靜脈內皮細胞 (human umbilical vein endothelial cells,HUVECS) 模型,發現METTL3在ox-LDL誘導的失調的HUVECS中高度表達,且利用生物信息學分析篩選出了JAK-STAT信號通路的相關基因。此前,JAK2/STAT3信號通路已被發現參與AS的發病機制[31],在敲除METTL3的HUVECS中,JAK2 mRNA和蛋白水平以及p-STAT3蛋白水平顯著降低。METTL3基因的下調抑制了HUVECS中的JAK2/STAT3信號通路,表明METTL3敲除通過降低JAK2的表達和mRNA的穩定性,以m6A依賴的方式抑制JAK2/STAT3信號通路。由此可見,METTL3/JAK2/STAT3軸在AS過程中的重要作用以及依賴IGF2BP1的調控機制,深入了解m6A相關基因調控網絡可能有助于更好地管理包括AS在內的m6A相關疾病。

既往研究表明,AS病變形成的主要刺激因素是內皮細胞的局部激活和通透性的增加,這可能是由血管分叉和彎曲部位的血流動力學改變觸發的[32]。Chien等[8]利用體外和體內實驗方法,證實了紊亂流動和振蕩剪切應力 (oscillatory stress,OS) 引起的METTL3表達和m6A高甲基化的增加。METTL3高甲基化m6A的多個下游靶點,上調Nod樣受體蛋白(Nod-like receptor pyrin domain,NLRP)1,下調Krüppel樣因子(Krüppel-like factor,KLF)4,引發AS反應。在OS下敲除METTL3后,NLRP1 mRNA表達下調,KLF4 mRNA表達上調。在暴露于OS的HUVECS中敲除METTL3后,單核細胞的黏附能力明顯降低,而同時過表達NLRP1和(或)敲除KLF4可增加單核細胞黏附,因此表明這兩個因素在調節單核細胞黏附中的關鍵作用,以及單核細胞與內皮細胞的黏附是AS發生的關鍵病理事件。同時,致AS動脈結扎術在誘導斑塊的形成和動脈管腔大小的減少的同時介導了METTL3和NLRP1的上調。shMETTL3可消除AS動脈結扎術誘導的血小板形成,并降低METTL3和NLRP1的表達。以上結果表明m6A甲基轉移酶METTL3是一個關鍵的調節因子,介導OS誘導的RNA轉錄本上的m6A修飾來調節AS。抑制METTL3可以抑制OS誘導的m6A甲基化,炎癥反應和單核細胞黏附,逆轉OS條件下內皮細胞 NLRP1和KLF4表達水平的變化。為RNA表觀遺傳學參與剪切應激的細胞反應和AS的發病機制提供了實驗證據。METTL3作為OS誘導的內皮細胞促炎反應的關鍵調節因子的發現,提示了一種通過靶向于METTL3治療AS的潛在方法。

2.2m6A甲基化修飾與心肌缺血再灌注 心肌缺血再灌注損傷是臨床最常見的缺血性心臟病病理狀態之一,尤其是急性心肌梗死 (acute myocardial infarction,AMI) 后經皮冠狀動脈介入治療。心肌心肌缺血再灌注損傷是AMI治療失敗和病情惡化的主要原因之一[33]。

心臟疾病如心肌缺血和心力衰竭通常伴有不可逆的心肌細胞 (cardiomyocyte,CM) 損失。心臟疾病相關的持續的CM損失和心功能不全在很大程度上歸因于其有限的再生能力[34]。因此,促進心臟缺血再灌注損傷后成人CM增殖再激活的策略尤為重要。Ke等[35]研究了m6A修飾在出生后和成人損傷期間心臟再生中的作用,發現了m6A去甲基化酶ALKBH5在CM的增殖和再生中起重要作用。敲除小鼠的ALKBH5顯著抑制了CM的增殖和再生,而AAV9介導的ALKBH5過表達促進了AMI損傷后心臟功能恢復。在機制上,ALKBH5介導的m6A去甲基化改善了YTHDF1 mRNA的穩定性,增加了其表達的同時促進了Yes相關蛋白(yes-associated protein,YAP)的翻譯。YAP通過Hippo信號通路參與調節器官大小,細胞增殖和干細胞命運的決定。在人誘導的多能干細胞來源的CM中,ALKBH5和YTHDF1表達的調節一直產生類似的結果。這一研究強調ALKBH5-m6A-YTHDF1-YAP軸在調節CM重新進入細胞周期中的重要作用。

既往研究發現,缺血后再灌注過程中發生凋亡和內質網應激等變化[36]。內質網應激可以轉錄激活一系列由應激反應轉錄因子家族緊密控制的適應通路,包括激活轉錄因子4 (activating transcription factor 4,ATF4),它控制內質網應激相關基因的表達[37]。Wang等[38]探討了m6A甲基轉移酶WTAP在缺血再灌注損傷中的作用及其對m6A修飾ATF4 mRNA、內質網應激和凋亡的影響,在AC16細胞中沉默WTAP后進行缺氧/復氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)發現,沉默WTAP顯著抑制H/ R引起的m6A水平升高,且顯著抑制H/ R誘導的細胞凋亡。進一步研究顯示,沉默WTAP對凋亡標記蛋白和內質網應激標記蛋白表達的上調都有抑制作用,表明H/R通過上調WTAP使AC16細胞m6A水平升高,促進細胞凋亡和內質網應激。在注射WTAP shRNA載體的心肌梗死大鼠模型中,缺血/再灌注(ischemia and reperfusion,I/R)處理顯著降低了大鼠的射血功能、縮短部分和收縮壓,而WTAP的下調逆轉了這一趨勢。沉默WTAP顯著改善I/R誘導的CM凋亡,且可以降低I/R誘導的m6A水平,也可以降低I/R誘導的CM中ATF4的上調。這些結果表明,ATF4可以結合WTAP的啟動子區域調控其轉錄,且下調WTAP通過減弱ATF4的mRNA穩定性,進而降低ATF4的表達,最終對CM凋亡和內質網應激產生保護作用。通過靶向WTAP/ATF4消除內質網應激,明確了心肌梗死的一個新的分子機制,為I/ R誘導的損傷提供了一種新的潛在的治療途徑。

3 m6A甲基化修飾與心臟重構

3.1m6A甲基化修飾與心肌纖維化(myocardial fibrosis,MF) MF是CVD的常見病理結果,也是心力衰竭的重要危險因素[39]。纖維化組織由于缺乏傳導電信號和引起機械收縮的能力而導致心臟功能的嚴重損害。因此,抗纖維化治療已經成為一種改善致MF心臟疾病預后的有效手段。Li等[40]利用生物信息學工具分析circCELF1序列發現,circCELF1具有miR-636的結合位點,而miR-636的一個重要靶基因是Wnt信號通路抑制因子2 (Dickkopf2,DKK2)。DKK2是Wnt/β-cateninn信號通路的拮抗劑,可抑制多種纖維化過程。因此,circCELF1可能通過miR-636/DKK2通路在MF中發揮調控作用。血管緊張素(angiotensin,Ang )Ⅱ和相關介質的信號系統,在促纖維化過程中起核心作用[41]。本研究中,AngII誘導的成纖維細胞激活與circCELF1表達下調有關。Ang II導致miR-636表達增加,提示circCELF1/miR-636是MF的重要途徑。過表達circ-CELF1或miR-636抑制劑可顯著逆轉Ang II對DKK2的抑制作用,提示Ang II通過circCELF1/miR-636通路抑制DKK2的表達。進一步研究發現,circCELF1通過影響FTO的表達降低了DKK2的m6A水平。綜上所述,circCELF1通過上調FTO的表達降低了DKK2的m6A水平,從而抑制了miR-636與DKK2的結合,最終促進了DKK2的表達。FTO通過對circCELF1-miR-636-DKK2軸進行m6A甲基化修飾,從而抑制MF的進展。

3.2m6A甲基化修飾與心肌肥厚 Gao等[42]發現,甲基化酶METTL3和CM的肥大以及心臟重構相關。他們檢測到主動脈縮窄模型鼠左心室的心肌肥厚相關pi-RNA (Cardiac-hypertrophy-associated piRNA,CHAPIR) 水平升高,進而研究發現,CHAPIR-PIWIL4復合物直接與METTL3相互作用并阻斷Parp10 mRNA轉錄物的m6A甲基化,上調多聚腺苷酸二磷酸核糖聚合酶10的表達,進而抑制糖原合成酶激酶-3β活性,從而導致核鈣調神經磷酸酶依賴性活化T細胞核因子4積累和病理性肥大的進展。這種機制呈現出了一個心肌肥厚和適應性不良心臟重構的新型靶向治療。

4 m6A甲基化修飾與糖尿病相關CVD

4.1m6A甲基化修飾與糖尿病后CM焦亡 焦亡是一種以caspase-1激活,焦孔素D 成熟,焦亡泡形成為特征,并伴隨胞內促炎介質(IL-1β、IL-18)大量釋放的細胞程序性死亡[43],在糖尿病和冠心病的發生和發展過程中均具有重要意義[44]。參與焦亡的主要信號通路是caspase-1激活,導致IL-1β、IL-18和焦孔素D的成熟過程。Meng等[45]探究了METTL14介導的m6A修飾在焦亡和糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy,DCM)進展中的作用。建立DCM大鼠模型,通過得失功能實驗確定METTL14-TINCR-NLRP3軸在焦亡和DCM中的作用。RNA下拉和RNA免疫共沉淀檢測被用來驗證潛在的相互作用。結果表明焦亡密切參與了DCM的進展。在DCM大鼠CM中,METTL14表達下調。在功能上,METTL14通過下調lncRNA TINCR抑制焦亡和DCM,進一步降低了焦亡相關關鍵蛋白NLRP3的表達。在機制上,METTL14增加了TINCR基因的m6A甲基化水平,導致其下調。并且,m6A解讀器蛋白YTHDF2對m6A甲基化至關重要,并介導了TINCR的降解,TINCR通過提高NLRP3 mRNA的穩定性,對其進行正向調控。此研究揭示了METTL14介導的m6A甲基化和lncRNA調控在焦亡和DCM中的新作用。

4.2DCM與FTO調控 Ju等[46]發現,DCM中總m6A水平較高,而脂肪量和FTO水平下調。FTO在DCM模型小鼠中過表達可通過減少MF和CM肥大改善心功能。該項研究以(db/ +)小鼠為對照,建立了db/db小鼠 DCM模型,并對比了兩組心臟組織樣本的m6A甲基化譜,發現db/db小鼠中的m6A RNA甲基化發生了改變。生信分析表明,差異甲基化基因與MF、心肌肥厚和心肌能量代謝特別相關。與db/+小鼠相比,db/db小鼠FTO表達下調,且db/db小鼠FTO過表達改善心功能,顯著減少MF和肌細胞肥大。這一研究提供了FTO介導的DCM的治療新思路。

5 小結與展望

靶向m6A調節因子是治療常見CVD的一種新的治療策略。通過改變m6A的調節因子來控制m6A的水平,可能是防止心臟功能惡化的一種新的有效治療方案。總的來說,m6A修飾在心臟發育、再生和疾病中起著至關重要的作用,而m6A及其調節器可能是治療心力衰竭的潛在靶點。然而,m6A與其他CVD甚至與心血管相關疾病之間的可能聯系仍未被完全探索。雖然在不同的動物或細胞模型中已經確立了RNA修飾酶在m6A修飾中的心臟保護作用,但缺乏足夠的臨床證據支持。因此,需要更多的臨床研究來進一步驗證m6A甲基化修飾在CVD中的作用以及其在診斷和治療中的應用前景。

此外,為了更好地理解m6A影響RNA命運的機制,我們必須開發新的和更好的工具或方法來更精確地操縱特定位點的特定轉錄本的m6A甲基化,以精準靶向m6A甲基轉移酶、去甲基酶、或甲基化閱讀蛋白的方式,安全有效地將m6A甲基化應用于CVD的治療。