川陳皮素調節CCL2-CCR2信號軸對牙周炎大鼠炎性損傷的影響

喻錦嫻, 俞 梅, 李 娜

(湖北省武漢市中醫醫院口腔科, 湖北 武漢 430000)

牙周炎是一種常見的慢性炎癥性疾病,其特征是牙槽骨缺失和牙齒松動[1],如果不及時治療,將最終導致牙齒脫落。目前常通過清除牙菌斑,藥物消除牙齦炎癥對牙周炎進行干預,常用抗生素消除炎癥,然而抗生素長期使用會產生耐藥性[2],為了解決此問題,中藥因副作用相對較小走進人們視野。川陳皮素是一種多甲氧基黃酮,具有抗炎、抗氧化、抗病毒功能,據報道,川陳皮素可抑制白細胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)刺激的人牙周韌帶細胞中的炎癥反應[3]。但川陳皮素對體內牙周炎模型的研究尚未見報道。趨化因子在炎癥過程中至關重要,它們可使免疫炎癥細胞充分募集到微生物感染部位,例如牙齦。然而,在C-C趨化因子配體2(C-C Chemokine ligand 2,CCL2)等趨化因子的調節下,大量免疫細胞聚集在炎癥部位,導致炎癥反應持續放大,因此CCL2已成為包括牙周炎在內的炎癥性疾病的治療靶點[4]。有研究表明與牙周健康部位相比,人和大鼠牙周炎部位的牙齦中發現更高水平的CCL2[5]。因此,抑制CCL2表達有可能為牙周炎治療提供新的思路。本文通過構建牙周炎大鼠研究川陳皮素在牙周炎大鼠中發揮的抗炎作用及其可能機制,以期為牙周炎的治療提供實驗參考。

1 材料與方法

1.1實驗動物:SPF級雄性SD大鼠50只,體重(200±20)g,購自三峽大學(許可證號SCXK(鄂)2022—0012)。大鼠飼養溫度在18～24℃,相對濕度在40%～70%,每日光照12h,不限飲水,定時供給普通飼料。本研究經武漢市中醫醫院動物倫理委員會審核批準(批準號20220315)。

1.2主要試劑:川陳皮素(純度>98%)購自成都瑞芬思生物科技有限公司;蘇木素伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色試劑盒購自碧云天公司;DAB顯色劑購自中衫金橋;Anti-CCL2抗體購自Abcam公司;C-C趨化因子受體2(C-C Chemokine acceptor 2,CCR2)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、IL-6、β-actin抗體購自CST公司。

1.3方 法

1.3.1牙周炎大鼠模型建立:采用絲線結扎聯合10%蔗糖飲水建立牙周炎模型:戊巴比妥鈉將大鼠進行麻醉并將大鼠固定好,在大鼠上頜左邊第二和三磨牙間穿過3-0的絲線,結扎第二磨牙,并將大鼠飲水換為10%蔗糖水溶液,每天檢查結扎是否在原位置,如果發現脫落應重新及時結扎,4周后觀察大鼠出現牙齒松動、牙齦紅腫出血和牙槽骨吸收現象,表明牙周炎大鼠模型構建成功。

1.3.2分組:將50只大鼠分為對照組、模型組、川陳皮素低劑量組、川陳皮素中劑量組、川陳皮素高劑量組,每組10只。除對照組外,其他4組建立牙周炎模型。造模成功后開始給藥,川陳皮素低劑量組、川陳皮素中劑量組、川陳皮素高劑量組每天分別灌胃25、50、100mg/kg川陳皮素;對照組、模型組每天灌胃等量生理鹽水。

1.3.3HE染色檢測各組大鼠牙周組織病理形態變化:灌胃結束后,取各組大鼠上頜組織,PBS漂洗后固定于10%甲醛中,48h后進行脫鈣處理,1個月后進行石蠟切片,HE染色,觀察牙周組織病理形態變化,包括炎性細胞浸潤以及牙槽骨吸收情況。

1.3.4免疫組織化學染色檢測各組大鼠牙周組織CCL2表達:取石蠟切片,抗原修復,滴加3%雙氧水溶液,山羊血清封閉,加入一抗CCL2(1∶100),4℃下過夜孵育,加入HRP標記二抗(1∶200),37℃下孵育1h,DAB顯色,蘇木素復染,封片,光鏡下觀察拍照,CCL2陽性染色為棕黃色。

1.3.5qPCR檢測各組大鼠牙周組織CCL2、CCR2、TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA水平:Trizol裂解各組大鼠牙周組織,提取細胞總RNA,將RNA反轉錄得到cDNA,以cDNA為模板進行熒光定量PCR檢測CCL2、CCR2、TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA表達,內參為β-actin。引物如下:CCL2正向5'-AAACCAGCCAACTCTCACT-3';反向5'-GTAGTTCTCCAGCCGACTC-3'。CCR2正向5'-TGTGAAGCAAATTGGAGCTTGG-3';反向5'-GAATGGGAGTGTGAGCAGGAA-3'。TNF-α正向5'-TCTTCTCATTCCTGCTCGTG-3';反向5'-GAGGCTGACTTTCTCCTGGT-3'。IL-1β正向5'-CTATGTCTTGCCCGTGGAG-3';反向5'-CTGCTTGAGAGGTGCTGATG-3'。IL-6正向5'-CCACTGCCTTCCCTCTTCA-3';反向5'-TCTTGGTCCTTAGCCACTCC-3'。β-actin正向5'-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3';反向5'-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3'。采用2-ΔΔCT計算CCL2、CCR2、TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA的相對表達量。

1.3.6Western blot檢測各組大鼠牙周組織CCL2、CCR2、TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白表達:RIPA裂解各組大鼠牙周組織,提取蛋白,將蛋白定量后進行Western blot檢測CCL2、CCR2蛋白水平,操作如下:SDS-PAGE凝膠電泳,轉膜,脫脂乳封閉,4℃過夜孵育一抗CCL2、CCR2、TNF-α、IL-1β、IL-6(均1∶1000稀釋),室溫孵育二抗(1∶2000)1h,ECL將膜顯色,凝膠成像系統保留圖像,Image J軟件分析蛋白灰度值。

2 結 果

2.1各組大鼠牙周組織病理形態比較:對照組牙周組織結構正常,未見明顯病理損傷;與對照組相比,模型組大鼠牙周組織出現牙槽骨吸收,有大量炎性細胞浸潤;與模型組相比,川陳皮素低、中、高劑量組大鼠牙周組織炎性細胞浸潤逐漸減輕,成纖維細胞數量逐漸增加,見圖1。

圖1 HE染色檢測各組大鼠牙周組織病理形態(100×)

2.2各組大鼠牙周組織CCL2、CCR2、TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA水平比較:與對照組相比,模型組大鼠牙周組織CCL2、CCR2、TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA水平顯著升高(P<0.05);與模型組相比,川陳皮素低、中、高劑量組大鼠牙周組織CCL2、CCR2、TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA水平顯著降低(P<0.05),見表1。

表1 各組大鼠牙周組織CCL2 CCR2 TNF-α IL-1β IL-6 mRNA水平比較

2.3各組大鼠牙周組織CCL2表達比較:免疫組化染色結果顯示,CCL2陽性染色為胞質內呈現棕黃色或棕色顆粒,上皮細胞及成纖維細胞中均可見CCL2陽性表達。與對照組相比,模型組大鼠牙周組織CCL2陽性細胞數目增多;與模型組相比,川陳皮素低、中、高劑量組大鼠牙周組織CCL2陽性細胞數目減少,見圖2和表2。

圖2 免疫組化染色檢測CCL2在大鼠牙周組織中的表達(200×)

表2 各組大鼠牙周組織CCL2表達比較

2.4各組大鼠牙周組織CCL2、CCR2、TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白表達:與對照組相比,模型組大鼠牙周組織CCL2、CCR2、TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白水平顯著升高(P<0.05);與模型組相比,川陳皮素低、中、高劑量組大鼠牙周組織CCL2、CCR2、TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白水平顯著降低(P<0.05),見圖3和表3。

圖3 Western blot檢測各組大鼠牙周組織CCL2、CCR2、TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白表達

表3 各組大鼠牙周組織CCL2 CCR2 TNF-α IL-1β IL-6蛋白水平比較

3 討 論

慢性牙周炎是最常見的口腔疾病之一,會導致牙周組織發炎,包括牙齦、牙周韌帶、牙骨質和牙槽骨[1]。藥物治療常用抗生素,然而過量或長期使用抗生素可能導致抗生素耐藥性。因此,本研究通過構建牙周炎大鼠模型,以探究開發新的有效藥物。

近年來,中醫因其副作用相對較小已逐漸被用作替代療法,比如魚腥草已被證明可以預防口腔傳染病[6]。川陳皮素是從中藥陳皮中提取的一類黃酮類化合物,具有抗氧化、抗炎、抗癌、抗菌、抗真菌等功效。Hosokawa等[3]首次證明川陳皮素在人牙周韌帶細胞發揮抗炎作用,可顯著抑制IL-1β誘導的炎癥反應,認為川陳皮素可能是治療牙周病的潛在藥物。TNF-α、IL-1β、IL-6是炎癥反應中常見的炎癥因子,在牙周炎進程中發揮重要促進作用[7]。在本研究中,模型大鼠牙周組織出現牙槽骨吸收、大量炎性細胞浸潤,牙周組織炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平升高,表明牙周組織出現嚴重炎癥反應,而川陳皮素干預后,模型大鼠牙周組織炎性細胞浸潤逐漸減輕,牙周組織炎性因子水平降低,表明川陳皮素可減輕牙周炎大鼠炎癥損傷。

CCL2是一種C-C型趨化因子,能夠趨化和激活單核/巨噬細胞、淋巴細胞等,從而參與炎癥與免疫反應[8]。在牙周炎中,CCL2促進單核細胞、巨噬細胞和T淋巴細胞的募集,免疫細胞位于受損牙齦處形成防線[9]。但造成牙周組織持續性破壞的原因之一,也是產生可以趨化淋巴細胞和單核細胞進入炎癥組織的趨化因子,有研究表明降低CCL2表達可減少炎癥細胞在牙周組織聚集,從而抑制牙周組織破壞[10]。本文發現牙周炎大鼠CCL2陽性細胞數目增多,牙周組織CCL2、CCR2水平顯著升高,提示抑制CCL2表達有可能是治療牙周炎的潛在策略。給予川陳皮素干預后,牙周炎大鼠牙周組織CCL2陽性細胞數目減少,CCL2、CCR2水平降低,表明川陳皮素可能通過抑制CCL2-CCR2信號軸減輕牙周炎大鼠炎性損傷。

綜上所述,川陳皮素可能通過抑制CCL2-CCR2信號軸減輕牙周炎大鼠炎性損傷,為治療牙周炎提供新的思路,但其作用機制仍需進一步探索。在未來的研究中課題組將結合體外細胞實驗對CCL2-CCR2信號軸進行干預,深入驗證川陳皮素抗牙周炎的作用與機制。