2型糖尿病合并結直腸癌患者癌組織中Ras ERK1/2蛋白表達及意義

牛 姝, 董麗娜, 吳 笛, 馮 嵐, 張夢瑤, 孫 政, 趙志剛, 郝慧斌

(1.河北省石家莊市人民醫院, 河北 石家莊 050011 2.河北省石家莊市中醫院質控科, 河北 石家莊 050000)

結直腸癌的發病呈現越來越年輕的趨勢,其死亡率亦逐年上升。有研究顯示,與一般人群相比,患有2型糖尿病的人群患結直腸癌的風險明顯增加,并且血糖控制情況會影響結直腸癌的發展和預后[1]。我們前期研究表明,結直腸癌的發病及預后與是否合并糖尿病密切相關。但是,其潛在的機制尚不明確。Ras蛋白是一種小型GTP酶,其被認為是ERK/MAPK信號通路的控制開關,Ras及其下游信號效應器ERK/MAPK均可調節PI3K、mTOR和AMPK通路的激活[2]。因此,Ras、ERK1/2蛋白在調節多種細胞反應中均發揮著關鍵作用,如細胞增殖、分化、凋亡、衰老、代謝,甚至癌癥的發生和進展[3]。為進一步探究機體高血糖狀態與Ras、ERK1/2蛋白之間的關系,本文將檢測結直腸癌合并2型糖尿病患者Ras、ERK1/2蛋白的表達水平,以探究其與臨床指標的相關性以及其對生存期的影響。通過初步探討Ras、ERK1/2蛋白在結直腸癌合并2型糖尿病患者中的作用,從而為這類患者的診療提供了新的思路。

1 資料與方法

1.1研究對象:選擇石家莊市人民醫院2019年3月到2021年1月期間行結腸癌手術治療患者59例,女性22例,男性37例;其中有55例患者的年齡大于50歲,有4例患者的年齡小于50歲;有40例患者最大瘤徑大于或等于5cm;有19例患者最大瘤徑小于5cm;其中7例患者為T1～T2期,52例患者為T3～T4期;癌組織分化:47例患者為中高分化,12例患者為低分化;其中34例患者未發生淋巴結轉移,25例患者有淋巴結轉移。入選條件:①滿足2010《WHO消化系統腫瘤分類》[4]中結直腸癌的診斷條件,且手術后病理證實為結直腸癌;②實施外科手術切除結直腸癌;③在手術之前沒有進行過放療、化療和其它抗癌藥物治療。排除條件:①有1型糖尿病的患者;②患有其它惡性疾病的患者;按照有共患無2型糖尿病,分為糖尿病組(n=29)和非糖尿病組(n=30)。

1.2臨床數據收集:收集患者年齡,性別,腫瘤直徑,臨床病理分期,病理分化程度,淋巴結轉移與否等信息。

1.3免疫組織化學染色:ERK1/2鼠抗人單克隆抗體,RAS鼠抗人單抗((Ras1∶200、ERK1/2 1∶100,購自abcam公司),從北京中杉金橋生物股份有限公司采購了DAB顯色劑、SP試劑盒。取4微米厚結直腸的標本,用乙二胺四乙酸作為緩沖劑,用3%雙氧水和5%～10%的普通羊血清作保護劑。一抗體(Ras 1∶200、ERK1/2 1∶100)可以在4℃的冷藏室中保存24h。依次滴入高分子增強劑-酶標法標記的抗鼠-兔多肽,DAB溶液顯色法,顯微鏡下觀察,陽性對照來自于已有的病理切片,陰性對照是磷酸鹽緩沖液。

1.4結果判定標準:對所有切片會進行雙盲評估,這項工作由兩名經驗豐富的病理科醫生完成評估。當兩位病理科醫生的意見不一致,請第三位專家評估確定結果。ERK1/2的表達主要以細胞漿為主,呈棕黃色顆粒。Ras的表達主要以細胞漿為主,呈棕褐色顆粒。并以陽性細胞的百分數以及染色強度為依據來對其進行打分:0分為陽性細胞百分數<5%,1分為陽性細胞百分數<10%,2分為陽性細胞百分數<50%,3分為陽性細胞百分數<75%,4分為陽性細胞百分數>75%;染色強度:0分為無色,1分是淺黃色,2分是棕黃色,3分是棕褐色。評分用陽性細胞百分數與著色強度分數相乘,即可得出最終分值:陰性為分值≤3分,陽性為分值>3分。

1.5觀察指標:比較兩組患者病理組織標本中Ras、ERK1/2蛋白表達情況;分析Ras、ERK1/2蛋白表達與淋巴結轉移的關系;分析Ras、ERK1/2蛋白表達與生存期的相關性。

1.6隨訪:對患者隨訪術后3年的生存情況,截止至2023年1月,術后到患者的死亡的時間即生存時間。通過電話隨訪跟蹤以掌握患者的病情、預后情況。

1.7統計學方法:數據處理采用SPSS20.0統計軟件。采用χ2檢驗對兩組間計數數據進行比較,采用Log-rank法分析不同表達情況下淋巴結轉移的差異,spearman相關性分析法分析Ras、ERK1/2表達與生存期相關性。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.12型糖尿病合并結直腸癌和單純結直腸癌組癌組織中Ras蛋白的表達水平:Ras蛋白的陽性表達主要以細胞漿為主,呈棕褐色顆粒(圖1)。在2型糖尿病合并結直腸癌組中,Ras蛋白的陽性表達率為(19/29),即65.5%(見表2)。在單純結直腸癌組癌組織中,Ras蛋白的陽性表達率為(11/30),即36.7%(見表1)。與單純結直腸癌組相比,2型糖尿病合并結直腸癌Ras的陽性率明顯升高(χ2=4.390, P=0.036)。

表2 2型糖尿病合并結直腸癌組癌組織中Ras-ERK1/2的表達與患者臨床病理特征的關系(n)

圖1 2型糖尿病合并結直腸癌組和單純結直腸癌組癌組織Ras、ERK1/2的表達

2.22型糖尿病合并結直腸癌和單純結直腸癌組癌組織中ERK1/2蛋白的表達水平:ERK1/2蛋白的陽性表達主要以細胞漿為主,呈棕黃色顆粒(圖1)。在2型糖尿病合并結直腸癌組中,ERK1/2蛋白的陽性表達率為(21/29),即72.4%(見表2)。在單純結直腸癌組癌組織中,ERK1/2蛋白的陽性表達率為(5/30),即16.6%(見表1)。與單純結直腸癌組相比,2型糖尿病合并結直腸癌ERK1/2的陽性率明顯升高(χ2=18.592, P=0.000)。

2.32型糖尿病合并結直腸癌和單純結直腸癌組臨床資料情況比較:2型糖尿病合并結直腸癌組和單純結直腸癌組在年齡、性別、病理分期、腫瘤直徑、病理分化程度方面差異無顯著差異(P>0.05);在所有患者中發生淋巴結轉移者總共25例,2型糖尿病合并結直腸癌組患者的淋巴結轉移率為62%(18/29)(見表2),單純結直腸癌組淋巴結轉移率為23.3%(7/30)(見表1),2型糖尿病合并結直腸癌組患者淋巴結轉移率較單純結直腸癌組明顯升高(χ2=7.766, P=0.005)。

2.4Ras-ERK1/2信號表達與淋巴結轉移的關系:Ras-ERK1/2信號表達與淋巴結轉移密切相關:Ras陽性表達組淋巴結轉移率為60%(18/30),明顯高于陰性表達組的24.1%(7/29),(χ2=15.632, P=0.000)。ERK1/2陽性表達組淋巴結轉移率為61.5% (16/26),明顯高于陰性表達組的27.2%(9/33) ,(χ2=6.993, P=0.008)(見表3)。

表3 所有患者癌組織中Ras-ERK1/2的表達與患者淋巴結轉移的關系(n)

2.5Ras-ERK1/2信號表達與生存期的相關性:結直腸癌患者術后生存時間與Ras-ERK1/2信號表達呈負相關:Ras陽性表達組術后生存時間(19個月)顯著小于Ras陰性表達組術后生存時間(26個月)(見表4);ERK1/2陽性表達組術后生存時間(18個月)顯著小于ERK1/2陰性表達組術后生存時間(24個月)(見表4);Ras-ERK1/2信號陽性表達術后生存時間明顯小于陰性表達組( P<0.05)。

表4 Ras-ERK1/2信號表達與生存期的相關性

3 討 論

2型糖尿病(diabetes mellitus,DM)是胰島素抵抗和/或胰島素分泌不足所致,以慢性高血糖為特征的慢性疾病。新診斷患者的增加表明需要提高對糖尿病的認識并防止慢性并發癥。 2型糖尿病不僅導致大血管和微血管的并發癥,還與不同類型癌癥的發生風險增加有關,特別是內分泌和胃腸道惡性腫瘤。最近一項納入了150項研究(包括3200萬人的數據)的薈萃分析證實了糖尿病和結直腸癌之間存在很強的流行病學聯系[5]。糖尿病患者預防結直腸癌的挑戰之一是這兩種疾病之間復雜的病因學關系,例如久坐的生活方式,西方模式的飲食、肥胖和代謝綜合征[6]。有證據表明,糖尿病可能通過慢性高血糖和高胰島素血癥的影響CRC發展并且存在因果關系[7]。與沒有糖尿病的患者相比,患有糖尿病的結直腸癌、結腸癌和直腸癌患者的生存期縮短了5年。根據美國糖尿病協會和美國癌癥協會的聯合建議,糖尿病患者被確定為高危人群,應進行定期癌癥篩查。

增殖的惡性腫瘤細胞具有高能量轉換和更大的葡萄糖需求[8]。在高血糖的情況下,結直腸癌組織的生長進一步加速。此外,糖尿病患者血糖控制不佳會激活多元醇和己糖胺代謝途徑,兩者都可能參與結直腸癌的發生和轉移。Ras作為G蛋白家族的一員,由不同氨基酸構成。在生理條件下,非活性Ras(GDP結合)轉變為活性形式(GTP結合),并激活MEK激酶,MEK激酶進而激活ERK激酶。ERK1/2的激活隨后磷酸化許多底物,從而調節細胞代謝凋亡[9]。盡管Ras在許多信號通路的激活中充當控制開關,但ERK1/2似乎是Ras點突變可以激活的最重要的通路之一。近幾十年來的科學研究發現了病理性過度激活的RAS-RAF-MEK-ERK1/2信號級聯與小細胞肺癌、結直腸癌之間的因果關系[10]。本研究中,通過對結直腸癌患者Ras-ERK1/2信號表達水平檢測發現:結直腸癌合并2型糖尿病組中Ras、ERK1/2陽性表達率較結直腸癌組相比顯著升高。與上述研究結果一致:高糖環境下病理性過度激活的Ras蛋白進而啟動了ERK1/2信號傳導,這個通路涉及多個級聯的激酶,包括Raf和MEK,最終導致ERK(絲/蘇氨酸蛋白激酶)的磷酸化。磷酸化ERK1/2進入細胞核,啟動控制腫瘤細胞侵襲能力的相關基因轉錄。以往研究結果還表明,糖尿病合并結直腸癌患者的不良結局可能與淋巴結轉移率的增加有關[11]。我們研究與此一致:Ras-ERK1/2信號表達與淋巴結轉移與否和術后生存時間密切相關。這提示Ras-ERK1/2是2型糖尿病合并結直腸癌發生發展的重要環節原因。我們推測:結直腸癌合并2型糖尿病組中Ras、ERK1/2可能通過調節細胞代謝凋亡,導致了淋巴結轉移率的增加,從而縮短了患者的術后生存期。

這些研究結果為我們深入了解結直腸癌合并2型糖尿病的分子機制提供了重要線索,并為開發相關治療策略和預防措施提供了新的目標。然而,需要進一步的研究來驗證這些發現,并探索相關通路在治療中的潛在應用價值。綜上所述,結直腸癌合并2型糖尿病組患者Ras-ERK1/2信號表達升高,與淋巴結轉移和生存期密切相關。但本研究觀察指標有限,今后應深入研究2型糖尿病合并結直腸癌的發生發展機制。