菌-藻體系中無(wú)機(jī)碳源對(duì)小球衣藻生長(zhǎng)和聚集的影響研究

吳雪菲, 陳國(guó)煒, 方志鵬, 賈 偉, 劉 麗

(合肥工業(yè)大學(xué) 土木與水利工程學(xué)院,安徽 合肥 230009)

為了應(yīng)對(duì)化石燃料的不可持續(xù)問(wèn)題及其引發(fā)的全球變暖和環(huán)境污染等問(wèn)題,發(fā)展可持續(xù)能源是當(dāng)前能源行業(yè)面臨的主要挑戰(zhàn)之一[1-3]。微藻是生物質(zhì)燃料的一種潛在來(lái)源,也是化石燃料的一種可行替代品[4-6]。微藻具有的生物量和脂質(zhì)生產(chǎn)力,是傳統(tǒng)作物生產(chǎn)生物柴油的10～300倍[7-8],同時(shí)具有環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)、生長(zhǎng)周期短、產(chǎn)油率高、養(yǎng)殖面積小等優(yōu)點(diǎn)[9-13]。此外,微藻還可以吸收二氧化碳,儲(chǔ)存光合能量,理論上每生成1 kg干微藻的生物量至少需要消耗1.83 kg二氧化碳[14-15]。

盡管微藻具有這些明顯的優(yōu)點(diǎn),但微藻體積較小、游離藻類的沉降能力較差,水力停留時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)[7,16],導(dǎo)致在藻類生物制品行業(yè),微藻的收集成本占總生產(chǎn)成本[17-18]的20%～30%,大大增加了運(yùn)營(yíng)成本[19-20]。因此,開(kāi)發(fā)一種經(jīng)濟(jì)高效的微藻收集方法是一個(gè)艱巨的挑戰(zhàn)[21]。

目前,微藻可通過(guò)物理、化學(xué)和生物技術(shù)等方法進(jìn)行收集。物理收集技術(shù)包括沉降、離心、浮選、過(guò)濾、電、磁和超聲等方法,但由于高成本和操作技術(shù)要求較高,它們的應(yīng)用潛力有限[22-23]。化學(xué)絮凝技術(shù)是采用無(wú)機(jī)或有機(jī)絮凝劑進(jìn)行微藻收集,其缺點(diǎn)是需要投加大劑量的化學(xué)絮凝劑,致使收集成本提高,還會(huì)產(chǎn)生不必要的副產(chǎn)品,甚至化學(xué)絮凝劑中的一些重金屬離子很容易對(duì)環(huán)境造成一定的污染,這些缺點(diǎn)制約了其在微藻收集中的大規(guī)模使用[24]。相對(duì)于上述物理、化學(xué)的方法,生物方法是最經(jīng)濟(jì)的,且不會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染[18]。藻類和細(xì)菌聯(lián)合培養(yǎng)與單一藻類相比,可以降低微藻的收集成本[25-26],而共培養(yǎng)體系水力停留時(shí)間較短[27-28],與單一藻類相比具有較好的沉降性能,被認(rèn)為是有效的解決方案之一。因此,本文從菌藻互作出發(fā),以菌-藻共生體系為研究對(duì)象,選取生長(zhǎng)快、產(chǎn)油高的小球衣藻和活性污泥細(xì)菌,探究無(wú)機(jī)碳源對(duì)菌-藻共生體系中小球衣藻生長(zhǎng)規(guī)律和聚集趨勢(shì)的影響,解析不同菌藻數(shù)量接種比例下碳源質(zhì)量濃度對(duì)微藻生長(zhǎng)和聚集的影響,以期對(duì)微藻的應(yīng)用提供理論指導(dǎo)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藻種

實(shí)驗(yàn)微藻為小球衣藻(Chlamydomonasmicrosphaera),編號(hào)FACHB-52,購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院淡水藻種庫(kù),培養(yǎng)于BDP-250人工氣候培養(yǎng)箱(上海百典儀器設(shè)備有限公司)中,設(shè)置溫度為(25±1) ℃,光照強(qiáng)度為2 000 lux,光暗比為12 h/12 h,接種后瓶口用已滅菌的透氣膜進(jìn)行封口處理。微藻培養(yǎng)時(shí)每天定時(shí)搖動(dòng)2～3次,培養(yǎng)基為SE(Selenite Enrichment)液體培養(yǎng)基。

1.2 實(shí)驗(yàn)菌種

采用活性污泥混合菌為實(shí)驗(yàn)菌種,以氣單胞菌屬Aeromonas、鄰單胞菌屬Plesiomonas、克雷白氏桿菌屬Klebsiella為主,活性污泥取自合肥工業(yè)大學(xué)市政工程系序批式反應(yīng)器(sequencing batch reactor,SBR)。取出1 mL活性污泥混合液,接種到500 mL內(nèi)裝有250 mL滅菌LB肉湯的錐形瓶中,37 ℃恒溫培養(yǎng)16 h后,從中取2份上清液各30 mL,分別放入50 mL的離心管中,在5804高速離心機(jī)(美國(guó)Eppendorf集團(tuán))中以8 000 r/min在4 ℃下離心10 min,棄去上清液,然后用培養(yǎng)液將每個(gè)離心管的底物溶解定容到30 mL;重復(fù)上述操作2次后,各取1 mL分別稀釋500倍、1 250倍、2 500倍,用于測(cè)試細(xì)菌的數(shù)量[29]。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

為了考察無(wú)機(jī)碳源(inorganic carbon,IC)對(duì)菌-藻體系中微藻生長(zhǎng)和聚集的影響,設(shè)置2個(gè)實(shí)驗(yàn)組和1個(gè)對(duì)照組,其中實(shí)驗(yàn)組1考察在初始菌藻數(shù)量比為3∶1時(shí)無(wú)機(jī)碳質(zhì)量濃度ρIC對(duì)菌-藻體系中微藻生長(zhǎng)和聚集的影響,實(shí)驗(yàn)組2初始菌藻數(shù)量比為15∶1,對(duì)照組為純?cè)?3組實(shí)驗(yàn)的具體設(shè)計(jì)如下所述。

1) 實(shí)驗(yàn)組1(菌藻數(shù)量比3∶1)。準(zhǔn)備3個(gè)體積為500 mL的玻璃錐形瓶(其編號(hào)分別為1#、2#、3#),向3個(gè)錐形瓶中各加入完全相同的315 mL且生長(zhǎng)已經(jīng)達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的微藻(6.8×105個(gè)/mL),然后向3個(gè)錐形瓶中各加入0.25 mL的細(xì)菌(8.5×108個(gè)/mL),保證初始的菌藻數(shù)量比[30]為3∶1。向1#瓶中加入培養(yǎng)液350 mL(1#瓶,不加IC);向2#瓶中同時(shí)加入7 mL碳酸氫鈉溶液(ρIC=1 880.0 mg/L)、343 mL培養(yǎng)液,混勻,使2#瓶中ρIC=37.6 mg/L(2#瓶,ρIC=37.6 mg/L);向3#瓶中同時(shí)加入35 mL碳酸氫鈉溶液(ρIC=1 880.0 mg/L)、315 mL培養(yǎng)液,混勻,使得3#瓶中ρIC=188.0 mg/L(3#瓶,ρIC=188.0 mg/L)。在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)觀察,光照培養(yǎng)箱條件與微藻培養(yǎng)條件一致。

2) 實(shí)驗(yàn)組2(菌藻數(shù)量比15∶1)。將初始菌藻數(shù)量比由3∶1變成15∶1,其余條件與實(shí)驗(yàn)組1完全相同。

3) 對(duì)照組(純?cè)?。初始無(wú)細(xì)菌,其余條件與實(shí)驗(yàn)組1相同。

每組樣品設(shè)置3個(gè)平行樣,以減小實(shí)驗(yàn)誤差。

培養(yǎng)液成分[31]如下:

ρ(NaNO3)=121.43 mg/L,

ρ(KH2PO4)=18.00 mg/L,

ρ(MgSO4·7H2O)=90.00 mg/L,

ρ(CaCl2·2H2O)=14.00 mg/L,

φ組分A=1.25 mL/L,φ組分B=1.25 mL/L。

組分A、組分B的成分見(jiàn)表1所列[31]。

表1 組分A和組分B的成分

1.4 分析方法

1.4.1 SEM表征

采用掃描電子顯微鏡(scanning electron microcope,SEM)觀察微藻聚集體表面和內(nèi)部結(jié)構(gòu)。吸取適量微藻樣品置于5 mm×5 mm硅片(艾思科技有限公司)上,放入-4 ℃冰箱冷凍4 h,然后放入BT2KXL真空冷凍干燥機(jī)(美國(guó)VirTis公司)冷干8 h。冷干結(jié)束進(jìn)行樣品預(yù)處理[32]。將處理好的樣品置于Supra 40場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡(德國(guó)Zeiss集團(tuán))下觀察分析。

1.4.2 微藻聚集率

從反應(yīng)器中取50 μL樣品放在載玻片上,置于BA410光學(xué)顯微鏡(麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司上海分公司)下觀察拍攝,采用Motic Images Plus 2.0軟件對(duì)微藻圖像進(jìn)行采集拍攝,并隨機(jī)攝取15個(gè)視野進(jìn)行圖像分析,圖像中2個(gè)及2個(gè)以上聚集在一起的微藻即判定為聚集體[33],聚集率G計(jì)算公式為:

G=(B1/B0)×100%

(1)

其中:B1為視野中聚集的藻細(xì)胞數(shù);B0為視野中藻細(xì)胞總數(shù)。

1.4.3 微藻生物量

搖勻錐形瓶中樣品后,取4 mL樣品放入5 mL離心管中,在8 000 r/min下離心10 min,棄去上清液,將剩余物重新懸浮在4 mL的90%丙酮(分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)中,放入冰箱,在4 ℃下避光保存24 h。以8 000 r/min離心10 min,取上清液用紫外分光光度法測(cè)定630、645、663、750 nm波長(zhǎng)下的吸光度A,以90%丙酮溶液作為空白對(duì)照,葉綠素a的質(zhì)量濃度計(jì)算公式[34]為:

ρ葉綠素a=[11.64(A663-A750)-2.16(A645-A750)+0.10(A630-A750)]V

(2)

其中,V為提取樣品的體積。

由式(2)得到ρ葉綠素a后,再通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線將ρ葉綠素a換算成微藻的細(xì)胞數(shù)。

1.4.4 胞外聚合物的提取和分析

從錐形瓶中取4 mL樣品放入5 mL的離心管中,先以4 000 r/min離心5 min后,去除上清液,再加入4 mL去離子水,然后在80 ℃水浴加熱1 h,取出樣品,以8 000 r/min離心5 min后,將上清液通過(guò)0.22 μm濾膜過(guò)濾,用于測(cè)量胞外聚合物(extracellular polymeric substances,EPS)中的多糖和蛋白質(zhì)[35]。

1) 多糖的測(cè)定。采用硫酸-蒽酮法,以葡萄糖作標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線[36-37]。取1 mL合理稀釋的濾后樣品放入試管中,加入3 mL的0.2%蒽酮-硫酸溶液,然后放入冷水中冷卻,充分振蕩并立即放入沸水浴中,15 min后取出,冷水浴5 min;以超純水空白樣作參比,在620 nm波長(zhǎng)下,使用UV2600紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海尤尼柯科學(xué)儀器有限公司)測(cè)其吸光度。

2) 蛋白質(zhì)的測(cè)定。采用Lowry法,以牛血清蛋白作標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線,在750 nm波長(zhǎng)下測(cè)蛋白質(zhì)量濃度[38]。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 SEM表征分析

聚集體的形成過(guò)程和SEM下的菌藻聚集體如圖1所示。

圖1 聚集體的形成過(guò)程和SEM下的菌藻聚集體

從圖1可以看出,純?cè)宕蠖嗵幱诜稚顟B(tài),而加入細(xì)菌后的微藻從第2天開(kāi)始,具有明顯的聚集趨勢(shì),此時(shí)沒(méi)有較大的聚集體出現(xiàn),到第4天時(shí)微藻形成的聚集體開(kāi)始變大,聚集體尺寸約為50 μm,到第6天時(shí)聚集體變得更大,尺寸接近100 μm。這說(shuō)明細(xì)菌有助于微藻的聚集,且隨著時(shí)間增加,聚集體逐漸增大,有利于微藻的沉降和收集。

由此可知,細(xì)菌和EPS將藻細(xì)胞聯(lián)系在一起,形成了菌藻聚集體。

2.2 微藻聚集率分析

不同初始質(zhì)量濃度碳酸氫鈉下微藻的聚集率如圖2所示。圖2中,a、b、c表示顯著性羞異。

西藏藏中電網(wǎng)是以拉薩、山南、日喀則、林芝、那曲五個(gè)地區(qū)電網(wǎng)聯(lián)網(wǎng)形成的系統(tǒng)，目前阿里、昌都地區(qū)電網(wǎng)仍然獨(dú)立運(yùn)行。西藏藏中電網(wǎng)內(nèi)變壓器中性點(diǎn)接地方式，由區(qū)調(diào)繼電保護(hù)處統(tǒng)一安排部署，各地區(qū)電網(wǎng)根據(jù)區(qū)調(diào)調(diào)度員的指令執(zhí)行。

圖2 不同初始質(zhì)量濃度碳酸氫鈉下微藻的聚集率

從圖2可以看出,隨著碳酸氫鈉初始質(zhì)量濃度增加,微藻的聚集率增加。純?cè)宓降?天,聚集率最大可達(dá)27%;菌-藻體系前2 d微藻的聚集率沒(méi)有太大變化,初始菌藻數(shù)量比3∶1下到第4天時(shí),微藻的聚集率驟增,最高可達(dá)43%,到第6天時(shí)增長(zhǎng)到最大,高達(dá)60%;初始菌藻數(shù)量比15∶1下到第4天時(shí),微藻的聚集率驟增,最高可達(dá)52%,到第6天時(shí)聚集率達(dá)到最大值66%。由此可見(jiàn),初始投加碳酸氫鈉對(duì)微藻的聚集率有一定的促進(jìn)作用,且對(duì)菌藻共培養(yǎng)時(shí)微藻聚集率的促進(jìn)效果要遠(yuǎn)大于純?cè)迮囵B(yǎng)時(shí)。

2.3 微藻生物量分析

不同初始質(zhì)量濃度碳酸氫鈉下微藻的生長(zhǎng)如圖3所示。從圖3可以看出,初始碳酸氫鈉質(zhì)量濃度越大,微藻的生物量越大。由圖3a可知,純?cè)逶诘?天時(shí)微藻的生物量隨著ρIC增加,1#、2#、3#瓶中依次為1.028×106、1.065×106、1.103×106個(gè)/mL,第5天時(shí)3#瓶微藻生物量是1#瓶的1.08倍。由圖3b可知,初始菌藻數(shù)量比3∶1下,在第6天時(shí)微藻的生物量隨著ρIC增加,1#、2#、3#瓶中依次為0.998×106、1.140×106、1.355×106個(gè)/mL,第5天時(shí)3#瓶微藻生物量是1#瓶的1.37倍。由圖3c可知,初始菌藻數(shù)量比15∶1下,在第6天時(shí)微藻的生物量隨著ρIC增加,1#、2#、3#瓶中依次為0.967×106、1.255×106、1.681×106個(gè)/mL,2#、3#瓶分別較純?cè)迮囵B(yǎng)體系增加30%、68%。此外,在第5天時(shí)3#瓶微藻生物量遠(yuǎn)高于1#瓶,前者是后者的1.81倍。純?cè)迮囵B(yǎng)中,微藻的生物量隨著初始ρIC增加而增加的效果不顯著(P>0.05),而在菌藻共培養(yǎng)中,微藻的生物量隨著初始ρIC增加顯著增加,且初始菌藻數(shù)量比越大,增加得越顯著(初始菌藻數(shù)量比3∶1下,P<0.05;初始菌藻數(shù)量比15∶1下,P<0.001)。

圖3 不同初始質(zhì)量濃度碳酸氫鈉下微藻的生長(zhǎng)

2.4 EPS質(zhì)量濃度分析

不同初始質(zhì)量濃度碳酸氫鈉下蛋白和多糖的質(zhì)量濃度如圖4所示。

圖4 不同初始質(zhì)量濃度碳酸氫鈉下蛋白和多糖的質(zhì)量濃度

由圖4a可知:純?cè)宓鞍踪|(zhì)量濃度隨著初始ρIC增加而減小,在第6天時(shí)組間差距最大,此時(shí)最大是1#瓶,為54.54 mg/L,最小是3#瓶,為14.77 mg/L;多糖質(zhì)量濃度大致隨著初始ρIC增加而增加,在第4天時(shí)多糖質(zhì)量濃度達(dá)到最大,為67.66 mg/L。

由圖4b可知,初始菌藻數(shù)量比3∶1下,蛋白質(zhì)量濃度隨著初始ρIC增加而減小,多糖質(zhì)量濃度隨著初始ρIC增加而增加,第6天時(shí)多糖質(zhì)量濃度達(dá)到最大值82.45 mg/L。

由圖4c可知:初始菌藻數(shù)量比15∶1下,多糖質(zhì)量濃度隨著初始ρIC增加而增加,第4天時(shí)達(dá)到最大值87.35 mg/L;蛋白質(zhì)量濃度在第1天隨著初始ρIC增加而增加,第2天1#瓶的蛋白質(zhì)量濃度最大,其次是3#瓶,2#瓶最小,第4天隨著初始ρIC增加而減小,到第6天時(shí)3個(gè)瓶中的蛋白質(zhì)量濃度已無(wú)明顯差異。

3 討 論

由于碳酸氫鹽在水中溶解度較高,且與HCO3-相比,CO32-對(duì)光合作用沒(méi)有明顯的促進(jìn)或抑制作用,因而HCO3-易被微藻大量吸收利用[45-46]。在加入碳酸氫鈉后,微藻的生物量隨著初始ρIC增加而增大,在純?cè)迮囵B(yǎng)時(shí)微藻的生物量增加得不顯著,而在菌藻共培養(yǎng)時(shí)出現(xiàn)明顯的大幅度增加。隨著初始ρIC增加,微藻的生長(zhǎng)和聚集都得到促進(jìn),一方面是由于在無(wú)機(jī)碳充足的情況下,微藻能夠給細(xì)菌提供的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)相對(duì)變多,細(xì)菌本身在這種無(wú)有機(jī)碳環(huán)境下追尋微藻獲取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的程度加大,從而更多地與微藻結(jié)合在一起,因此對(duì)微藻生長(zhǎng)和聚集都起到促進(jìn)作用。

細(xì)菌會(huì)刺激微藻分泌多糖[47],在無(wú)碳酸氫鈉情況下,隨著初始菌藻數(shù)量比增加,多糖的質(zhì)量濃度不斷減小,這是由于細(xì)菌數(shù)量越多,其消耗營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)多糖的量會(huì)越大;初始加入低質(zhì)量濃度碳酸氫鈉后,微藻自身的營(yíng)養(yǎng)條件變得更加充足,前2 d隨著初始菌藻數(shù)量比增加,細(xì)菌刺激微藻分泌更多的多糖來(lái)作為其營(yíng)養(yǎng)物,同時(shí)微藻也隨著初始菌藻數(shù)量比的增加生長(zhǎng)得更快,到第4天和第6天時(shí),隨著初始菌藻數(shù)量比增加,多糖的質(zhì)量濃度不斷減小,這是由于隨著碳酸氫鈉的消耗,微藻的生存壓力相對(duì)增加,同時(shí)細(xì)菌的數(shù)量增加,加大了對(duì)多糖的消耗,分泌的多糖量少于細(xì)菌消耗的多糖量。多糖可能是引發(fā)菌藻聚集的主要原因,在以往的研究中,通常只關(guān)注了蛋白質(zhì)量濃度對(duì)微生物聚集的影響[16,48-49],而忽視了多糖的作用[50-51]。有研究采用激光掃描共聚焦顯微鏡(confocal laser scanning microscope,CLSM)技術(shù)分析發(fā)現(xiàn),β-多糖(即β-(1,3)-葡萄糖的高聚物)均勻分布在聚集體內(nèi),對(duì)聚集體內(nèi)部穩(wěn)定性起到支撐作用[52]。此外,微藻所分泌的膠鞘多糖與細(xì)胞表面密切相關(guān),其所含有的纖維素可作為黏附劑幫助細(xì)胞附著[53]。

4 結(jié) 論

1) 外源無(wú)機(jī)碳的出現(xiàn)對(duì)于純培養(yǎng)小球衣藻的生長(zhǎng)沒(méi)有顯著影響,但在菌-藻混合體系中可以顯著促進(jìn)微藻的生長(zhǎng)。在低質(zhì)量濃度IC水平下,初始菌藻數(shù)量比為15∶1時(shí),經(jīng)過(guò)6 d培養(yǎng),微藻生物量較純?cè)迮囵B(yǎng)體系增加30%;當(dāng)ρIC升高至188.0 mg/L時(shí),微藻生物量較純?cè)迮囵B(yǎng)體系增加68%。

2) 菌-藻共生體系有助于微藻發(fā)生聚集,并且隨著體系中ρIC增加,其聚集效果變得更明顯。

3) 在IC不充足時(shí),菌-藻體系中EPS的質(zhì)量濃度隨初始菌藻數(shù)量比的增加而減小,當(dāng)IC較充足時(shí),菌-藻體系中EPS的質(zhì)量濃度隨初始菌藻數(shù)量比的增加而增大,細(xì)菌會(huì)促進(jìn)微藻分泌多糖且利用多糖作為自身的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),多糖質(zhì)量濃度與微藻聚集有重大關(guān)系。