殼寡糖對中華絨螯蟹非特異性免疫的影響

高榆嘉，徐 美，許云舒，徐田田，張敏娜，許青松

(大連民族大學生命科學學院，生物技術與資源利用教育部重點實驗室，遼寧 大連 116600)

中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)，俗稱河蟹、大閘蟹，是中國重要的水產養殖經濟物種之一，因生長快速、營養豐富、經濟價值高，其養殖規模逐年攀升。但隨著企業集約化養殖的發展壯大，養殖密度增加等因素導致中華絨螯蟹發病率上升。此外，環境惡化，細菌、病毒等對中華絨螯蟹養殖的威脅不斷增加，如愛德華氏菌、嗜水氣單胞菌等致病菌使中華絨螯蟹養殖產業造成巨大的經濟損失[1]。因此，豐富中華絨螯蟹免疫防御基礎理論知識、尋找安全有效的病害防控方法成為中華絨螯蟹養殖產業中亟待解決的問題。

殼寡糖(Chitosan oligosaccharides，COS)，又稱低聚殼聚糖，是由2～10個氨基葡萄糖經β-1，4-糖苷鍵連接而成的低分子量聚糖，可由甲殼素生物酶解而獲得。殼寡糖因含有多個活潑的氨基和羥基基團，而具有抗氧化、抗菌、增強免疫、調節腸道、保護肝臟等多種生物學活性，現已在醫藥及農業等多個領域被廣泛研究和應用[2]。作為飼料添加劑或免疫增強劑，殼寡糖不僅能調節動物生理功能，加快新陳代謝，而且具有替代抗生素的潛質，對提高動物生長速度、降低死亡率、改善產品品質等方面均有明顯的作用[3-4]，因而其在畜、禽、水產養殖中的應用研究不斷增多。Zhang B Z[5]將殼寡糖應用到泥鰍(Paramisgurnusdabryanus)的養殖中，發現殼寡糖不僅能改善泥鰍的生長性能、體蛋白含量、腸道消化酶活力和抗氧化能力，還提高了泥鰍對嗜水氣單胞菌的抗性。Rahimnejad S等[6]發現殼寡糖能顯著提高凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)肝胰臟谷胱甘肽過氧化物酶、超氧化物歧化酶活性和總抗氧化能力，同時上調其crustin、Pen3和proPo等抗菌肽基因的表達。李振達等[7]在三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)基礎飼料中添加一定量的殼寡糖，可以顯著提高其血清中酸性磷酸酶、溶菌酶、總超氧化物歧化酶和過氧化物酶等活力。袁春營等[8]發現在中華絨螯蟹飼料中適量添加低聚殼聚糖，可以改善其免疫功能，增強機體抵御病原菌的能力。張干等[9]發現飼料中添加低聚殼聚糖，可以提高中華絨螯蟹生長性能、抗氧化能力和非特異性免疫力，減少機體脂肪的沉積。目前，殼寡糖在中華絨螯蟹上的研究多停留在現象描述，如生長性能、抗氧化能力和免疫指標的測定上，而免疫調節分子機制研究并未見報道。因此，本實驗通過研究中華絨螯蟹非特異性免疫和抗氧化能力，以及免疫調節機制，旨在為殼寡糖在中華絨螯蟹中的研究和應用提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與設計

實驗用殼寡糖為本實驗室通過生物酶解殼聚糖制備而獲得，脫乙酰度≥90%，聚合度分布在2～8，其中殼二糖至殼八糖的占比分別為5.5%、21.1%、31.5%、26.7%、10.9%、2.9%、1.3%。實驗用(20±2)g中華絨螯蟹購自江蘇省連云港市中華絨螯蟹養殖場，在20～22 ℃淡水中暫養，每天定時更換養殖水體并投喂適當的餌料。暫養7 d后，選擇45只附肢完整、個體均勻、健康的中華絨螯蟹，隨機分為3組，每組15只，第1組分別注射0.1 mL生理鹽水(對照組)，第2組分別注射0.1 mL 50 μg·mL-1殼寡糖，第3組分別注射0.1 mL 200 μg·mL-1殼寡糖。

1.2 樣品采集

中華絨螯蟹注射殼寡糖24 h后，使用一次性無菌注射器從第三步足基部插入，采集血淋巴并按1∶1與抗凝劑(氯化鈉510 mmol·L-1、檸檬酸200 mmol·L-1、葡萄糖100 mmol·L-1、檸檬酸三鈉30 mmol·L-1，pH 7.3)混勻，800 g，4 ℃離心10 min，收集血淋巴細胞，液氮速凍，-80 ℃保存備用。

1.3 血清免疫指標檢測

取中華絨螯蟹血淋巴離心后的上清液，用于超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)、丙二醛(MDA)、溶菌酶(LZM)、堿性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP)、一氧化氮(NO)等活性或含量的檢測。以上指標均采用試劑盒(南京建成生物工程研究所)進行檢測。

1.4 RNA提取及實時熒光定量PCR

參考Yu A Q等[10]RNA提取及實時熒光定量PCR(qRT-PCR)的方法，利用Trizol試劑(Invitrogen，USA)進行中華絨螯蟹血淋巴細胞總RNA的提取，然后用分光光度計Nanodrop 2000(Thermo Scientific)對提取的RNA進行定量分析，取2 μL RNA用于瓊脂糖凝膠電泳，檢測RNA的完整性。根據試劑盒PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa，Japan)的說明書進行cDNA的合成。以獲得的cDNA為模板，使用SYBR Premix Ex Taq試劑盒(TaKaRa)，按說明書要求設置PCR反應體系和程序，結合表1中基因種類和引物序列，以中華絨螯蟹的β-actin基因作為內參基因，采用ABI-Q6-Flex實時熒光定量PCR儀進行擴增，定量結果采用2-ΔΔCt計算方法進行計算。

表1 研究中采用的引物序列Tab.1 Primers used in this study

1.5 統計分析

從每組中隨機選取9只中華絨螯蟹，將3只蟹的血淋巴細胞混合為一個樣本，每組3個生物學重復樣品(n=3)。實驗數據用SPSS 20軟件進行統計分析，利用單因素方差分析方法(ANOVA)對不同處理組的差異進行比較，P<0.05表示顯著差異，P<0.01表示極顯著差異。

2 結果與分析

2.1 殼寡糖對中華絨鰲蟹抗氧化能力和非特異性免疫的影響

與對照組相比，2組殼寡糖處理均極顯著提高了中華絨螯蟹血清中SOD和CAT的活性(P<0.01)；50 μg·mL-1殼寡糖有提高GSH-PX活性的作用趨勢，但差異不顯著(P>0.05)，200 μg·mL-1殼寡糖極顯著提高GSH-PX活性(P<0.01)；2組殼寡糖處理均顯著降低了中華絨螯蟹血清中MDA含量(P<0.05)；50 μg·mL-1殼寡糖有提高LZM活性的作用趨勢，但差異不顯著(P>0.05)，200 μg·mL-1殼寡糖顯著提高LZM活性(P<0.05)；2組殼寡糖均有提高AKP和ACP活性的作用趨勢，但差異不顯著(P>0.05)；2組殼寡糖均顯著增加了中華絨螯蟹血清中一氧化氮的含量(P<0.05)(表2)。

表2 殼寡糖對中華絨鰲蟹抗氧化能力和非特異性免疫的影響Tab.2 Effects of chitosan oligosaccharides on antioxidant capacity and non-specific immunity of E.sinensis

2.2 殼寡糖對Toll樣受體表達的影響

中華絨螯蟹中存在著類似果蠅的Toll樣受體基因，并被命名為EsToll1和EsToll2[11]。與對照組相比，2組殼寡糖處理均極顯著提高了中華絨螯蟹血淋巴細胞中EsToll1和EsToll2的表達水平(P<0.01)(圖1)。

2.3 殼寡糖對Toll信號通路的影響

類似果蠅的Toll信號通路的關鍵基因在中華絨螯蟹中已被鑒定，如EsMyD88[12]、EsTube[13]、EsPelle[14]和EsDorsal[10]。與對照組相比，200 μg·mL-1殼寡糖處理極顯著提高了中華絨螯蟹血淋巴細胞EsMyD88的表達水平(P<0.01)(圖2A)；2組殼寡糖處理均顯著提高了血淋巴細胞中EsTube和EsPelle的表達水平(P<0.05)(圖2B、圖2C)；50 μg·mL-1殼寡糖處理顯著提高了血淋巴細胞EsDorsal的表達水平(P<0.05)，200 μg·mL-1殼寡糖處理極顯著提高了EsDorsal的表達水平(P<0.01)(圖2D)。

2.4 殼寡糖對免疫效應分子表達的影響

抗氧化酶和抗脂多糖因子作為重要的免疫效應分子，其基因在中華絨螯蟹中分別被命名為EsSOD[15]、EsCAT[16]、EsALF[17]和EsALF3[18]。與對照組相比，50 μg·mL-1殼寡糖處理顯著提高了中華絨螯蟹血淋巴細胞EsSOD和EsCAT的表達水平(P<0.05)，200 μg·mL-1殼寡糖處理極顯著提高了EsSOD和EsCAT的表達水平(P<0.01)(圖3A、圖3B)；50 μg·mL-1殼寡糖處理顯著提高了中華絨螯蟹血淋巴細胞EsALF的表達水平(P<0.05)，200 μg·mL-1殼寡糖處理極顯著提高了EsALF的表達水平(P<0.01)(圖3C)；2組殼寡糖處理均極顯著提高了中華絨螯蟹血淋巴細胞EsALF3的表達水平(P<0.01)(圖3D)。

3 討論

3.1 殼寡糖對中華絨鰲蟹抗氧化能力的影響

甲殼動物不具有類似脊椎動物的特異性免疫，在復雜的生活環境中，其主要依賴固有免疫系統阻止病原微生物的入侵。甲殼動物免疫系統主要由細胞免疫和體液免疫組成，其中體液免疫主要包括抗氧化酶釋放、體液免疫因子、抗菌肽以及凝集素分子等[19]。SOD、CAT和GSH-PX都屬于抗氧化體系中重要的生物酶，在機體受到氧化應激時起重要防御作用，反映了甲殼動物的抗應激能力。Niu J等[20]發現殼寡糖可以提高斑節對蝦(Penaeusmonodon)SOD和GSH-PX的活力，進而提升其總抗氧化能力，減少機體中MDA的含量；在中華絨螯蟹中，張干等[9]同樣發現殼寡糖提高了蟹肌肉和可食內臟中SOD和CAT的活性；在本研究中，殼寡糖顯著提高了中華絨螯蟹血清中SOD、CAT和GSH-PX的活力，降低了MDA的含量，與Niu J等、張干等的研究結果基本一致。溶菌酶、堿性磷酸酶和酸性磷酸酶都屬于體液免疫因子，在甲殼動物體液免疫過程中起非常重要的作用，反映了機體的免疫防御能力。李振達等[7]在三疣梭子蟹中證明殼寡糖可以顯著提高血清中LZM 和ACP的活力，但對AKP 活力促進效果不顯著；袁春營等[8]在中華絨螯蟹中同樣發現殼寡糖可以提高血清中LZM的活力；而在本研究中，殼寡糖顯著提高了中華絨螯蟹血清中LZM活力，對AKP和ACP活力有提高的作用趨勢，但差異不顯著，這與李振達等、袁春營等的研究結果有所不同，可能與殼寡糖作用的時間有一定的關系。一氧化氮作為細胞內重要的信號分子，在脊椎動物和無脊椎動物免疫反應中均發揮著重要作用。Jiang Q F等[21]對櫛孔扇貝(Chlamysfarreri)的研究發現，一氧化氮參與了櫛孔扇貝免疫，對其血淋巴的免疫應答、血細胞凋亡與吞噬、抗菌活性和氧化還原平衡起著重要的調節作用。Raman T等[22]在羅氏沼蝦(Macrobrachiumrosenbergii)中同樣發現，一氧化氮參與了凝集素介導的蝦血細胞吞噬反應，若使用一氧化氮抑制劑，則可有效抑制上述吞噬反應。在本研究中，殼寡糖顯著提高了中華絨螯蟹血清中一氧化氮的水平，提示其可能參與了中華絨螯蟹的免疫反應過程。

3.2 殼寡糖的免疫調節機制

Toll信號通路能夠激活多種免疫相關基因(如小分子蛋白、抗菌肽以及吞噬作用和黑化作用相關基因等)來響應細菌和病毒的入侵。在甲殼類動物中，Toll通路主要包括Toll樣受體、MyD88、Tube、Pelle和Dorsal等關鍵分子[23]。Yu A Q等[11]在中華絨螯蟹中成功克隆表達了EsToll1和EsToll2分子，并且證明兩者均參與了中華絨螯蟹對脂多糖、酵母聚糖和肽聚糖的免疫響應。本研究也發現殼寡糖可以有效誘導中華絨螯蟹血淋巴細胞Toll樣受體的表達。此外，研究學者在中華絨螯蟹中已經成功地證明存在著Toll信號通路，并鑒定了EsMyD88[12]、EsTube[13]、EsPelle[14]和EsDorsal[10]等關鍵分子，這些分子在不同的免疫刺激物作用下呈現出不同的免疫響應過程。本研究發現殼寡糖可以有效地上調EsMyD88、EsTube、EsPelle和EsDorsal的表達，提示殼寡糖可能通過開啟Toll信號通路發揮其免疫調節作用。抗氧化酶體系是甲殼動物重要的免疫防御手段，殼寡糖上調了中華絨螯蟹血淋巴細胞EsSOD和EsCAT的表達，這與中華絨螯蟹血清抗氧化酶活力變化趨勢基本一致。抗菌肽是體液免疫的重要效應分子，能有效殺滅細菌等，是機體免疫的有效屏障，同時抗菌肽的表達受到Toll信號通路的調控。在中華絨螯蟹中，研究學者先后鑒定出抗脂多糖因子EsALF和EsALF3等多種抗菌肽，這些抗菌肽在甲殼動物的免疫防御過程中發揮著不可或缺的作用[17-18]。本研究發現殼寡糖可以顯著提高EsALF和EsALF3的表達水平，提示殼寡糖的免疫調節機制可能是通過Toll信號通路介導的抗菌肽來發揮作用。

4 結論

殼寡糖可以改善中華絨螯蟹的抗氧化能力和非特異性免疫功能，增強Toll信號通路中EsToll1、EsToll2、EsMyD88、EsTube、EsPelle和EsDorsal的表達，上調抗脂多糖因子EsALF和EsALF3的表達。