Notch抑制劑DAPT體外改善L02細胞脂肪變研究*

吳偉杰,丁雯瑾,楊蕊旭,范建高

Notch信號通路是高度保守的單次跨膜信號受體蛋白家族,包括四個受體(Notch1/2/3/4)和五個配體(Jagged1、Jagged2、DLL1、DLL3和DLL4)及靶基因編碼轉錄因子(Hes1和Hey1),涉及多種組織和器官早期發育所必需的細胞間調節,在細胞增殖、分化、凋亡等方面具有重要作用[1、2]。近幾年,有研究報道Notch 信號的活化參與肝臟再生與修復、炎癥和纖維化過程[3]。此外,Notch 基因異常表達會導致胰島素抵抗(insulin resistance,IR)、脂質異常和肥胖等多種代謝性疾病,它也能誘發非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)的發生[4,5]。我們之前的研究證實,無論是在蛋氨酸膽堿缺乏(methionine-choline deficient,MCD)小鼠模型還是棕櫚酸(palmitic acid,PA)誘導體內肝細胞脂肪變模型,均存在Notch基因家族的異常表達,并隨代謝障礙相關脂肪性肝病(metabolic dysfunction-associated fatty liver disease,MAFLD)不同發展階段而改變[6]。隨后,我們應用Notch信號通路抑制劑(DAPT)體外處理脂肪變肝細胞,發現DAPT能抑制Notch下游 Hes-1和 Hey-1基因水平,同時能有效降低甘油三酯(triglyceride,TG)和轉氨酶水平[7]。本研究在體外應用DAPT處理脂肪變的L02細胞,觀察了抑制Notch家族后細胞炎癥因子和脂質代謝相關基因水平變化。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑與儀器 人正常肝細胞L02由中國科學院上海細胞庫提供;RPMI-1640 培養基和杜氏磷酸鹽緩沖液(Dulbecco's phosphate buffered saline,DPBS)均購于美國Hyclone 公司;胎牛血清(fatal bovine serum,FBS)購于以色列Biological Industries 公司;γ分泌酶抑制劑N-[N-( 3,5-difluorophenacetyl) - L - alnyl]-S-phenylycine t- butyl ester(DAPT)和PA均購于美國默克公司;RPS-18內參引物購于中國上海生物工程公司;Trizol 試劑和預混型定量用逆轉錄試劑盒均購于日本寶日醫公司;qPCR SYBR Green Master Mix 購于中國上海翊圣生物科技有限公司;CCK-8試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、RIPA裂解液(強)和含DAPI的抗熒光淬滅封片劑均購于上海碧云天生物技術有限公司;尼羅紅染料購于上海晶純生化科技股份有限公司;抗GAPDH小鼠單克隆抗體購于美國Proteintech Group 公司;抗固醇調節元件結合蛋白1c(sterol regulatory element-binding protein 1c,SREBP1c)小鼠單克隆抗體購于美國NOVUS 公司;抗p65(NF-kappaB,NF-κB)兔單克隆抗體購于美國Abcam公司;ECL發光液購于美國Millipore 公司;凝膠成像儀(美國Bio-Rad 公司);Q3 PCR 擴增儀和Nano Drop 2000 超微量分光光度儀(美國賽默飛公司);PCR 逆轉錄儀(德國艾本德公司);Bio Tek Epoch 全波長酶標儀(美國博騰儀器有限公司)。

1.2 體外細胞脂肪變模型的建立與DAPT干預 將5 mM PA原液用RPMI-1640完全培養基(含10% FBS)稀釋成含0.1 mM、0.25 mM和0.5 mM PA的高脂培養基工作液、備用。取L02細胞,分為對照組(Con)、0.1 mM PA組、0.25 mM PA組和0.5 mM PA組。待L02細胞融合度達到60%～70%時,棄培養基,用DPBS洗1遍,加入培養基或相應濃度的高脂培養基工作液處理L02細胞24 h,收集細胞。根據前期實驗結果確定0.25 mM PA濃度作為體外細胞脂肪變的造模條件,分含或不含0.25 mM PA處理細胞。采用0μM、1μM、2μM、5μM和10 μM DAPT處理細胞,其中0.25 mM PA處理細胞在不加DAPT處理組為模型組,處理L02細胞24 h,收集細胞。

1.3 細胞存活率試驗 使用CCK-8試劑盒進行細胞存活率測定。

1.4 細胞mRNA提取及水平檢測 采用Trizol法提取細胞總RNA,逆轉錄后行實時熒光聚合酶鏈式反應(RT-qPCR),基因特異性引物序列為：SREBP1c-F： 5’-CGGAACCATCTTGGCAACAGT-3’; SREBP1c-R： 5’-CGCTTCTCAATGGCGTTGT-3’; FASN-F： 5’-CCGAGACACTCGTGGGCTA-3’; FASN-R： 5’-CTTCAGCAGGACATTGATGCC-3’; ACACA-F： 5’-ATGTCTGGCTTGCACCTAGTA-3’; ACACA-R： 5’-CCCCAAAGCGAGTAACAAATTCT-3’; TNF-α-F： 5’-CCTCTCTCTAATCAGCCCTCTG-3’; TNF-α-R： 5’-GAGGACCTGGGAGTAGATGAG-3’; IL-1β-F： 5’-AGCTACGAATCTCCGACCAC-3’; IL-1β-R： 5’-CGTTATCCCATGTGTCGAAGAA-3’; IL-6-F： 5’-ACTCACCTCTTCAGAACGAATTG-3’; IL-6-R： 5’-CCATCTTTGGAAGGTTCAGGTTG-3’。

1.5 細胞p65及SREBP1蛋白檢測 采用Western blot法,用RIPA裂解法提取細胞總蛋白,經BCA試劑盒測定蛋白濃度,調節上樣蛋白總量至相同。根據目的蛋白分子大小配制合適的SDS PAGE凝膠后開始上樣、電泳、轉膜,用5%脫脂牛奶封閉,按照抗體說明書相繼加入一抗和二抗孵育后,經凝膠成像儀曝光成像,應用Image J軟件對條帶的灰度值進行定量分析。

1.6 細胞脂滴觀察 在12孔細胞培養板,加入不同濃度的DAPT干預PA處理的L02細胞24 h,棄培養基,用DPBS洗2遍,加入4%多聚甲醛固定15～30 min,用DPBS洗2遍。按照尼羅紅原液：DPBS=1：500的比例配制工作液,避光染色15 min,棄去尼羅紅染色工作液,用DPBS洗2遍。在每孔中加入含DAPI的抗熒光淬滅封片液100 μL,置于熒光顯微鏡下觀察。

2 結果

2.1 各組L02細胞存活率比較 在PA干預L02細胞8 h、16 h和24 h,經CCK-8測定顯示, L02細胞存活率隨干預時間呈劑量依賴性下降趨勢;與對照組細胞存活率為100%比,在干預8 h、16 h和24 h時,0.1 mM、0.25 mM和0.5 mM PA干預L02細胞存活率均顯著下降(P均<0.05,圖1A);在無PA干預的L02細胞,經1μM、2μM、5μM和10 μM DAPT處理細胞24 h,細胞存活率均較對照組顯著下降(分別為85.2±5.3%、84.6±2.9%、84.4±6.0%和84.5±3.2%對100.0%,P均<0.05,圖1B)。

2.2 不同濃度DAPT干預PA處理細胞相關細胞因子mRNA水平和p65蛋白表達變化 與模型(0 μM DAPT處理)組比,各DAPT處理組TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA水平均顯著下調(P均<0.05,表1);與0 μM DAPT處理組比,各DAPT處理組細胞p65蛋白均顯著下調(P均<0.05,圖2A、2B)。

表1 不同濃度DAPT干預PA處理細胞相關細胞因子mRNA水平比較

圖1 不同濃度PA和DAPT干預L02細胞存活率比較A：不同濃度的PA處理L02細胞;B：不同濃度的DAPT處理L02細胞24 h; *P<0.05

圖2 不同濃度DAPT干預PA處理細胞p65蛋白表達變化A：細胞p65蛋白表達(Western blot法);B：p65蛋白表達相對水平;*P<0.05;**P<0.01

2.3 不同濃度DAPT干預PA處理細胞脂質代謝水平變化 與0 μM DAPT組相比,各DAPT處理組細胞SREBP1c mRNA水平均無顯著變化,在2μM、5μM和10 μM DAPT處理組細胞FASN和ACACAmRNA水平均顯著下降(P均<0.001,表2);在2μM、5μM和10 μM DAPT處理組,細胞脂滴紅色熒光強度較0 μM DAPT組顯著減弱[分別為(0.2±0.1)、(0.3±0.0)和(0.1±0.0)對(0.7±0.0),P均<0.001,圖3A);與0 μM DAPT組相比,5 10 μM和10 μM DAPT處理組細胞SREBP1c蛋白水平均顯著下調(P均<0.05, 圖3B和3C)。

圖3 不同濃度DAPT干預PA處理細胞脂質代謝變化A：細胞脂滴形成情況(尼羅紅染色, 400×);B：細胞SREBP1c蛋白表達(Western blot法);C：細胞SREBP1c蛋白表達相對水平;*P<0.05;**P<0.01

表2 不同濃度DAPT干預PA處理細胞脂質代謝相關基因mRNA水平比較

3 討論

Notch 基因的激活不僅與異常增殖、癌癥疾病發生密切相關,也在細胞代謝過程中起著重要作用,其表達紊亂會導致多種代謝相關性疾病[8,9]。通常,MAFLD伴隨代謝綜合征的出現,目前普遍被認可的是“多次打擊”學說,胰島素抵抗、脂質過氧化、氧化應激等均參與其發病。在小鼠肝臟病理學研究發現,肝細胞特異性Notch功能喪失可緩解脂肪性肝炎相關肝纖維化,而增強Notch在肝細胞中的表達會通過上調Sox9依賴性骨橋蛋白,激活肝星狀細胞并誘導肝臟纖維化[10]。也有研究使用Notch抑制劑可改善動物因高脂高糖飲食而導致的肝纖維化[11]。結合文獻報道及我們團隊先前的研究結果,有足夠的證據表明Notch家族參與了MAFLD的發生和進展[6]。

長期高脂飲食可以導致高脂血癥、異位脂質沉積,過量的脂質沉積在肝細胞內而引起肝臟損傷,最后形成MAFLD[12]。有研究發現Notch在肝臟脂代謝過程中扮演重要角色。Notch1信號活化可以導致胰島素抵抗加重,并與FOXO1協同增強葡萄糖-6-磷酸酶表達[13,14]。Notch信號可以激活mTOR信號通路,促使其下游SREBP1c表達,促進肝細胞脂肪生成。抑制Notch基因能通過降低mTOR的穩定性,弱化下游激酶核糖體蛋白S6激酶1活化,減緩SREBP1c依賴的脂肪從頭合成,達到改善肝脂肪沉積的目的[15,16]。我們采用0.25 mM PA濃度干預L02細胞24 h成功構建體外細胞脂肪變模型,并可顯著引起細胞內的脂質沉積和穩定激活Notch信號通路[7]。在體外肝細胞脂肪變細胞,以“不影響細胞活性”為基礎,發現DAPT能緩解細胞炎癥因子(TNF-α、IL-1β和IL-6)水平上升并下調p65蛋白表達,改善程度與DAPT濃度有一定的劑量依賴性。尼羅紅染色可觀察到細胞脂滴數量明顯減少。TNF-α、IL-1β和IL-6與NF-κB 核內易位活化密切相關。NF-κB信號通路激活可能是引起細胞內炎癥反應的主要原因[17]。NF-κB的IKKα啟動子序列與Notch信號下游轉錄因子Hes1存在部分重合,表明Notch信號可能從基因轉錄層面對炎癥信號通路產生影響。因此,使用DAPT等Notch抑制劑或可抑制肝細胞內炎癥反應和脂質沉積,具有防治MAFLD進展的潛力。

作為γ-分泌酶底物的DAPT可以競爭性與γ分泌酶結合,從而實現間接抑制Notch信號轉導[18]。在非酒精性脂肪性肝炎患者肝組織往往存在Notch基因異常激活[19]。抑制Notch信號可改善糖尿病模型小鼠肝臟脂滴數量、降低血清肝酶水平并提高胰島素敏感性,抑制Notch基因后可誘導AMP活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)和ACACA磷酸化,從而激活AMPK信號通路,促進脂肪酸氧化并抑制脂肪合成[20]。本研究我們進一步檢測脂質代謝相關性基因 SREBP1、FASN和ACACA表達情況,經WB檢測結果顯示SREBP1c蛋白表達水平經過DAPT處理后明顯下調,下游的FASN和ACACA脂肪合成相關基因mRNA水平也相應出現了下降。故DAPT可能通過降低SREBP1c蛋白的表達而抑制脂肪合成,從而具有調控脂質紊亂的作用。

綜上所述,應用DAPT抑制Notch基因家族可改善MALFD的炎癥反應和脂質代謝異常。