腸道菌群失調作為始發因素參與腹瀉型腸易激綜合征的發生與發展分析

董昌昊，李超，王少鑫，王廣祥，冼銳，劉曉娜，崔立紅

腸易激綜合征（irritable bowel syndrome， IBS）是一種以腹痛、腹脹等為主要癥狀，且伴隨排便習慣或糞便性狀改變的常見的胃腸道疾?。?］。臨床上按照糞便性狀將IBS 分為腹瀉型（IBS-D）、便秘型（IBS-C）、混合型（IBS-M）和不定型。據報道，在中國人群中IBS-D 約占IBS 總患者的66.3%，是最常見的亞型［2］。IBS-D 的病因和發病機制尚不明確，目前被認為可能與腦腸調控異常、腸道微生態失衡、腸黏膜低度炎癥和精神心理等多種因素共同作用有關［3］。多個研究報道了IBS-D 患者中出現腸道菌群的變化［4-6］。然而，腸道菌群失調是IBS-D 的伴隨現象還是作為IBS-D 的誘發因素尚不十分清楚。本研究擬通過糞菌移植實驗，探討腸道菌群在IBS-D 發生發展中的具體作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 小鼠購自北京天融慧通科技有限責任公司［實驗動物生產許可證號：SCXK（京）2019-0010］，飼養環境溫度25 ℃，濕度40%～45%。取10 只SPF 級C57BL/6J 小鼠，并隨機取其中5 只采用避水應激法構建IBS-D 小鼠模型，通過檢測其糞便含水量、腸道傳輸時間、腸道敏感性等方法驗證造模是否成功，其余5 只置于相同環境中正常飼養作為健康對照小鼠。造模成功后另取10 只小鼠（SPF 級， C57BL/6J）進行糞菌移植實驗。首先，按照氨芐西林1 g/L、新霉素1 g/L、甲硝唑1 g/L、萬古霉素500 mg/L 的濃度配制成四聯抗生素水溶液，給小鼠喂食含有上述4 種抗生素及甜味劑的水，共10 d，模擬腸內無菌條件，飲用水2 d 更換1 次。然后，將經過抗生素清掃的小鼠隨機分為實驗組和對照組，每組5 只。將IBS-D 小鼠和健康小鼠的糞便標本分別配制成菌群PBS 混懸液（50 mg/ml）。在抗生素清掃的第11 天，通過灌胃法分別給予實驗組和對照組小鼠來源于IBS-D 和健康小鼠的菌群PBS 混懸液，200 μl/d，連續5 d。糞菌移植結束1 周后記錄小鼠的腸道傳輸時間、腸道敏感性及糞便含水量。

1.2 實驗試劑 β-actin（貨號：BM0627）和HRP 標記羊抗兔二抗（貨號：BA1054）購自武漢博士德生物工程有限公司。兔多抗核因子κB（nuclear factor kappa-B， NF-κB）、Toll 樣受體4（toll like receptor 4，TLR4）、髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88， MyD88）、白細胞介素-1β（interleukin-1β， IL-1β）、白細胞介素-6（interleukin-6， IL-6）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α， TNF-α）購自Affinity公司。反轉錄試劑及實時熒光定量PCR（qRTPCR）試劑購自VAZYME 公司。

1.3 糞便含水量 采用Bristol 糞便分級量表對小鼠糞便進行分級。隨后檢測小鼠糞便含水量，在鼠筐底部鋪上一張濾紙收集小鼠4 h 內的糞便，此過程中應時刻注意保持濾紙完整。收集的糞便首先稱量濕重，記為W1，然后將糞便放入烘箱中，干燥后稱量干重，記為W2。糞便含水量（%）=（W1-W2）/W1×100%。

1.4 腸道傳輸時間 通過灌胃法給予未禁食的小鼠6%的胭脂紅溶液（溶于0.5%的甲基纖維素中）并觀察傳輸時間。從灌胃開始到糞便中胭脂紅首次出現的時間記作該小鼠的腸道運輸時間。

1.5 腸道敏感性 采用結直腸擴張實驗測試小鼠腸道敏感性。小鼠禁食24 h 但不禁水，測試當天用乙醚鎮靜小鼠，將液體石蠟油潤滑后的導尿管（6 Fr）置于直腸中，使氣囊末端距離肛門約2 cm 并固定。然后將小鼠放置在固定器內，待其蘇醒適應30 min后分別注入0.2、0.3、0.4 和0.5 ml 空氣（每個體積持續20 s，中間間隔4 min）。記錄觀察小鼠腹部回撤反射（abdominal withdrawal reflex， AWR）情況并進行評分。

1.6 qRT-PCR 檢測 檢測小鼠結腸組織中NF-κB（P65）、TLR4、MyD88、IL-Iβ、IL-6、TNF-α 的mRNA表達水平。利用Trizol 法提取總RNA，然后進行cDNA 的合成和qRT-PCR 檢測。PCR 檢測條件為95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s、95 ℃ 15 s，共40 個循環。通過2-ΔΔCt法計算mRNA 相對表達量。PCR 引物序列見表1。

表1 PCR 引物序列

1.7 蛋白質印跡法檢測 檢測結腸組織中NF-κB（P65）、NF-κB（P-P65）、TLR4、MyD88、IL-Iβ、IL-6、TNF-α 的表達水平。取小鼠結腸組織置于裂解液中，勻漿后取上清液。利用BCA 試劑盒測定蛋白濃度。制備SDS-PAGE 凝膠，將制備好的凝膠固定到電泳槽上，上樣進行電泳。電泳完成后將凝膠轉移到PVDF 膜上。用含5% 脫脂奶粉的TBST 浸泡PVDF 膜，室溫搖床封閉2 h。孵化抗體，洗滌并去除多余的抗體，最后顯影曝光。

1.8 統計學處理 采用SPSS 26.0 統計軟件進行數據分析。計量資料以±s表示，組間比較分析采用t檢驗。P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 避水應激小鼠模型構建 與健康小鼠相比較，避水應激小鼠腸道傳輸時間短于健康小鼠（P＜0.05），糞便含水量高于健康小鼠（P＜0.01）。見表2。避水應激小鼠腸道敏感性高于健康小鼠，見圖1。提示造模成功。

圖1 避水應激小鼠與健康小鼠不同壓力下AWR 評分

表2 避水應激小鼠與健康小鼠糞便含水量、腸道傳輸時間比較（± s）

表2 避水應激小鼠與健康小鼠糞便含水量、腸道傳輸時間比較（± s）

類別健康小鼠避水應激小鼠P 值例數5 5糞便含水量（%）58.93 ± 4.39 67.28 ± 2.61＜0.01腸道傳輸時間（min）204.20 ± 25.15 170.80 ± 16.51 0.04

2.2 實驗組與對照組小鼠糞便含水量、腸道傳輸時間、AWR 評分比較 與移植健康糞便的小鼠相比，移植IBS-D 糞便的小鼠出現IBS-D 相關表現包括糞便含水量和AWR 評分均增加（P＜0.05）；腸道傳輸時間縮短（P＜0.05）。見表3、圖2。

圖2 實驗組與對照組小鼠不同壓力下AWR 評分

表3 實驗組與對照組小鼠糞便含水量、腸道傳輸時間比較（± s）

表3 實驗組與對照組小鼠糞便含水量、腸道傳輸時間比較（± s）

組別對照組實驗組P 值例數55糞便含水量（%）53.82 ± 3.84 63.58 ± 4.53＜0.01腸道傳輸時間（min）181.80 ± 13.77 111.20 ± 38.90＜0.01

2.3 實驗組與對照組小鼠qRT-PCR 檢測結果 實驗組與對照組小鼠結腸組織中IL-6、IL-1β、MyD88、TNF-α、NF-κB（P65）、TLR4 6 種mRNA 表達水平見圖3。實驗組小鼠結腸組織中上述指標的mRNA表達水平均高于對照組小鼠，差異有統計學意義（P＜0.05）。

圖3 實驗組與對照組小鼠TNF-α、IL-6、IL-1β、TLR4、MyD88、NF-κB（P65）的mRNA 表達水平比較

2.4 實驗組與對照組小鼠蛋白質印跡法檢測結果 通過對比β-actin 計算得出的相對表達量見圖4、5。實驗組小鼠結腸組織中IL-6、IL-1β、MyD88、TNF-α、NF-κB（P65）、TLR4 蛋白表達量高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。

圖4 實驗組與對照組小鼠TNF-α、IL-6、IL-1β 蛋白的表達水平比較

圖5 實驗組與對照組小鼠NF-κB（P65）、磷酸化P65、MyD88、TLR4 蛋白的表達水平

3 討論

IBS-D 是最常見的功能性胃腸病之一。這種疾病雖然不會危及生命，但對患者的生活質量有著嚴重影響，同時給醫療保健系統帶來巨大負擔［7］。全球估計IBS 患病率為10%～20%［8］。據報道，與西方國家相比，亞洲國家的IBS 患病率較低［9］。然而隨著生活方式和社會經濟因素的變化，IBS-D 在亞洲地區的發病率可能不斷上升［10］。

IBS-D 的發病機制很復雜，至今尚未完全明確。研究表明，腸道菌群失調、結腸黏膜的慢性炎癥反應以及腸道內臟敏感性的增加在IBS-D 患者中很常見［11］。腸道菌群是人體內最龐大最復雜的微生態系統之一，其與人類共生共存，在參與宿主營養代謝、維持腸道屏障完整性、調節免疫等方面發揮著重要作用［12］。隨著研究的不斷深入，越來越多的研究發現相對于健康人群而言，IBS-D 患者腸道菌群的數量和組成發生了顯著變化。相關研究表明，IBS-D患者腸道菌群的豐富度顯著降低，其表現為2 個主要門的明顯變異，即擬桿菌門增加和厚壁菌門減少［13］。在屬水平上，表現為擬桿菌屬和普雷沃氏菌屬增加，雙歧桿菌屬減少［14］。但這些變化與IBS-D發生的具體因果關系尚不明確，腸道菌群改變是IBS-D 的伴隨現象還是作為始發因素誘導IBS-D 的發生值得進一步探索。

本研究通過抗生素清掃，模擬腸內無菌環境，通過糞菌移植探究腸道菌群在IBS-D 發生中的作用。與移植健康糞便的小鼠相比，移植IBS-D 糞便的小鼠表現出了明顯的腸易激癥狀，包括糞便含水量增加、腸道傳輸時間縮短以及腸道敏感性增加。同時本研究也檢測了2 組小鼠腸黏膜的炎癥因子表達情況，結果顯示接受IBS-D 糞便移植的小鼠腸黏膜炎癥因子水平高于接受健康糞便移植的小鼠。

腸道的低度炎癥和免疫激活被認為是IBS-D 發病的重要因素之一。研究表明炎癥因子水平在IBS-D小鼠中升高，抗炎治療在IBS-D 小鼠中展示了良好的臨床前景［15］。NF-κB 是一種轉錄因子，其在免疫反應、炎癥、凋亡等生物學過程中扮演著重要角色。結腸組織中NF-κB 及其通路相關分子TLR4、MyD88 的表達水平升高已被證明與IBS-D 發病相關，NF-κB 驅動的炎癥細胞因子，如IL-1β、IL-8 和TNF-α 等，可影響腸道分泌和運動并刺激內臟感覺神經末梢，導致內臟高敏感性［16］。

在健康個體中，穩定的腸道菌群在維持腸道屏障完整性和炎癥平衡方面起著關鍵作用。但這種“穩態”在某些情況下可能會被打破［17］。腸道菌群的失衡可能會導致腸道黏膜屏障被破壞及通透性增加，使得促炎微生物產物如脂多糖（lipopolysaccharides， LPS）進入腸黏膜，LPS 可以與腸道上皮細胞表面的TLR4 結合，從而激活腸道上皮細胞和免疫細胞的炎癥反應［18］。這些免疫細胞和上皮細胞通過激活NF-κB 通路產生炎癥因子，如IL-6、TNF-α和IL-1β 等，引起腸道黏膜的炎癥和一系列腸道癥狀，促進IBS-D 的發生。

綜上所述，本研究通過糞菌移植的方式成功構建出IBS-D 小鼠模型。提示腸道菌群失調在IBS-D的發生中可能起到“啟動”作用。盡管其中的具體機制有待進一步研究，但菌群紊亂導致腸黏膜低度炎癥及NF-κB 相關通路的異常激活可能在此過程中發揮關鍵作用。