化學發光法定量檢測抗雙鏈DNA IgG 抗體的方法學性能驗證

王麗娟，路穎，韓燕聰，劉妮妮

抗雙鏈DNA IgG 抗體（Anti-dsDNA IgG）是系統性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus， SLE）的特異性抗體，存在于SLE 患者的血清中。相關研究指出該抗體的滴度與SLE的活動性存在相關性，并與狼瘡性腎小球腎炎的發病密切相關［1-4］。美國風濕病學會（American College of Rheumatology，ACR）已將Anti-dsDNA IgG 陽性作為SLE 患者的重要診斷標準之一［5-6］。大量實踐表明，Anti-dsDNA IgG 檢測對于SLE 患者的早期診斷和治療具有重要意義［7-8］。目前臨床實驗室檢測Anti-dsDNA IgG 的方法主要有間接免疫熒光法、酶聯免疫吸附法、免疫印跡法、放射免疫法和化學發光免疫分析法等。其中化學發光免疫分析法操作簡便、無放射性、檢測速度快、靈敏度高等，近幾年與該類檢測相關的設備得到較快發展［9-10］。本研究主要參考美國臨床和實驗室標準化協會（Clinical and Laboratory Standards Institute， CLSI）的系列標準文件、中國合格評定國家認可委員會（China National Accreditation Service for Conformity Assessment， CNAS）的相關應用說明和指南，以及Anti-dsDNA IgG 測定試劑盒說明書，對Maglumi2000 P 檢測系統檢測Anti-dsDNA IgG 的性能進行驗證，以明確其是否滿足實驗室用途和臨床需求，為SLE 患者尋求Anti-dsDNA IgG 定量檢測的可靠方法。

1 材料與方法

1.1 材料

收集2021 年4-6 月海軍第九七一醫院開展Anti-ds-DNA IgG 檢測的血清樣本66 份，2019-2020 年國家衛生健康委臨床檢驗中心的Anti-dsDNA 室間質評標本共20 份，以及健康體檢正常血清標本20 份。

1.2 儀器和試劑

本研究采用的儀器和試劑為深圳新產業生物醫學工程股份有限公司的Maglumi2000 P 檢測系統，配套Anti-ds-DNA IgG 測定試劑盒（批號：129210111）、校準品（批號：129210111）和質控品（批號：129210111）。

1.3 方法

1.3.1 精密度驗證 參照CLSI 的EF15-A2 方案［11］，采用高、低2 個水平的質控品（一個生理水平，一個病理水平）進行精密度驗證；在檢測系統處于優良的條件下，2 組質控品分別分裝5 管，2～8 ℃冷藏保存。每天取1 管上機連續檢測3 次，連續5 d，計算平均值及變異系數CV，得到中間精密度及重復性精密度。最后與廠家聲明的精密度進行比較，低于廠家說明書聲稱的數值，則驗證通過。

1.3.2 準確度驗證 （1）回收率實驗：參照CLSI 的EF9-A2方案［11］，選擇合適濃度的低值檢測樣本，其中取1 份900 μl低值檢測樣本加入已知濃度為800 IU/ml 的校準品100 μl制成回收分析樣本。在另一份同等濃度900 μl 低值檢測樣本中加入100 μl 無待測分析物的校準品S0，制成基礎樣本。每個樣本檢測3 次，計算均值濃度，按如下公式計算回收率：

式中，R為回收率，V為加入的校準品體積，V0為低值檢測樣本的體積，C為回收分析樣本的濃度均值，C0為基礎樣本的濃度均值，Cs 為校準品的濃度。

廠家聲稱的數值在90%～110%范圍內。

（2）符合率驗證（每個樣本重復檢測不少于3 次）：與國家衛生健康委臨床檢驗中心的Anti-dsDNA IgG 質評物進行比對，20 份標本中，有19 份及以上符合，則驗證通過。

1.3.3 檢出限驗證 采用S0校準品重復測定20 次，計算平均值（M）和標準差（SD），得出M+2SD，代入工作曲線，求出相應的濃度值，即為檢出限。

1.3.4 線性范圍驗證 選取高濃度（800 IU/ml）和低濃度（0.5 IU/ml）的定值校準品，將高濃度（H）與低濃度（L）樣本按預定比例稀釋，稀釋后的濃度覆蓋試劑說明書給定的線性范圍，按5L，4L+H，3L+2H，2L+3H，L+4H，5H 的比例配制成6 個系列濃度樣本，以200 μl 為一個單位，每個濃度水平的樣本量為1.00 ml，每個樣本重復檢測3 次，取其平均值。以理論值為橫坐標（X），以檢測均值為縱坐標（Y），擬合一次曲線Y=a+bX，進行回歸分析，求相關系數r2。0.95≤r2≤1.05 被認為線性良好。

1.3.5 生物參考區間驗證 選取20 份體檢健康者（體檢報告診斷無異常者）新鮮血清，其中男10 例，年齡18～89 歲，女10 例，年齡18～88 歲。將20 份標本的檢測結果與廠家提供的生物參考區間進行比對，不超過1 例的測定值落在廠家提供的參考區間之外，則驗證通過。

1.4 統計學處理

本研究基礎數據由Maglumi2000 P 檢測系統生成，連續變量符合正態分布的數據采用±s表示。采用Microsoft Office Excel 2016 軟件進行統計學分析，計算相關系數、擬合回歸方程。

2 結果

2.1 精密度驗證結果

Anti-dsDNA IgG 高、低水平的重復性精密度CV＜8%，中間精密度CV＜15%。見表1。均在廠家說明書聲稱的可接受范圍內，表明精密度驗證通過。

表1 抗雙鏈DNA IgG 精密度實驗

2.2 準確度驗證結果

（1）通過3 次實驗檢測，計算均值得出回收率為94.09%，在90%～110%范圍內，表明回收率實驗驗證通過。見表2。

表2 抗雙鏈DNA IgG 回收實驗結果（IU/ml）

（2）通過和國家衛健委室間質評物比對，符合率為100%，表明符合率驗證通過。見表3。

表3 抗雙鏈DNA IgG 符合率驗證結果（IU/ml）

可見，回收率和符合率均符合廠家提供的標準，表明準確度驗證通過。

2.3 檢出限驗證結果

計算結果顯示，檢出限結果為0.443 IU/ml，＜0.500 IU/ml表示檢出限驗證通過。見表4。

表4 抗雙鏈DNA IgG 檢出限驗證結果（IU/ml）

2.4 線性范圍驗證結果

高、低濃度校準品混合后的檢測均值和理論值見表5，相應的散點圖見圖1。擬合的一次曲線為Y=0.980X-2.610，相關系數r2=0.998，b=-2.610＜0.970，均在范圍內，表示線性良好。

圖1 抗雙鏈DNA IgG 線性范圍

表5 抗雙鏈DNA IgG 線性范圍驗證（IU/ml）

2.5 生物參考區間驗證結果

20 份體檢健康者血清檢測結果顯示，Anti-dsDNA IgG檢測值范圍為6.942～15.910 IU/ml，廠家提供的生物參考區間為≤30 IU/ml，表示驗證通過。見表6。

表6 抗雙鏈DNA IgG 生物參考區間

3 討論

隨著污染的加重、壓力的增加，以及自身抗體檢測的普及等，自身免疫病的發病率出現上升趨勢［2-3］。SLE 是一種多發于青年女性的器官非特異性自身免疫病，主要侵犯結締組織并影響多個器官［12-13］。Anti-dsDNA 多見于SLE 患者中，陽性率為40%～90%，特異度超過90%［5,14］。患者體內Anti-dsDNA IgG 的濃度與SLE 的活動度成正比，并且與患者腎臟功能的損傷程度密切相關。由于SLE 的治療是終生過程，因此準確快速地檢測Anti-dsDNA IgG 的濃度對SLE 患者意義重大［7-10］。Anti-dsDNA IgG 是患者治療監測的重要指標。為提高實驗室檢測水平，尋求更好、更快的檢測方法，本研究對現有的Maglumi2000 P 檢測系統定量檢測Anti-ds-DNA IgG 的能力進行驗證。

目前實驗室檢測Anti-dsDNA IgG 采用的方法有間接免疫熒光法、酶聯免疫吸附法、放射免疫法、免疫印跡法、化學發光法、液態芯片技術、蛋白質芯片技術等［15-16］。間接免疫熒光法是檢測Anti-dsDNA IgG 的經典方法，采用綠蠅短膜蟲為基質進行檢測，需要特殊的熒光顯微鏡觀察，工作人員需經過專業培訓，并且易受到非特異性熒光干擾，結果不能定量［17］。酶聯免疫吸附法一般采用間接法檢測Anti-dsDNA IgG 的含量，應用普遍，但該法需要成批檢測，耗時較長，影響因素多，操作較復雜［17-18］。放射免疫法是檢測Anti-ds-DNA IgG 的金標準，可以實現定量檢測，但會產生放射性污染，國內實驗室幾乎不再將其作為常規方法［18］。免疫印跡法一般半定量，可同時檢測多種自身免疫抗體，但價格高，檢測時間較長，作為單項Anti-dsDNA IgG 指標的檢測手段用于治療監測不適用［19］。液態芯片技術和蛋白質芯片技術是近幾年新興起的檢測方法，價格成本較高，可同時檢測多種自身抗體，作為初次檢測篩查，比較全面，特異度、敏感度均較高。但是信息質量的穩定性和可重復性較差，操作也比較煩瑣，作為SLE 患者的治療監測不適用［15］。

化學發光法是近十幾年發展較快的免疫檢測方法，從腫瘤標志物、病毒學檢測到心肌損傷標志物、激素類檢測，項目涵蓋全面。該方法采用目前先進的直接發光檢測技術，具有較高的特異度和靈敏度，且操作方便，重復性好，準確度高，線性范圍廣［20］。Maglumi2000 P 檢測系統采用化學發光免疫分析法檢測Anti-dsDNA IgG，主要是采用dsDNA 抗原（捕獲抗原）包被磁性微球，以及采用異魯米諾衍生物ABEI 發光劑標記鼠抗人IgG 抗體，均為全自動化的設備操作流程，可為實驗室提供便利。然而不同實驗室之間，其配置、環境、人員操作等因素存在諸多差異，譬如環境溫濕度、實驗用水水質、實驗人員操作習慣、儀器維護保養頻次等，故各個實驗室有必要基于自身的檢測系統，建立和驗證檢測方法學參數，評價Maglumi2000 P 檢測系統各項性能參數是否符合要求，檢測結果是否準確可信。

本實驗室的方法學性能評價結果表明，Maglumi2000 P檢測系統定量測定Anti-dsDNA IgG 的精密度、準確度、檢出限、線性范圍和生物參考區間與廠家提供的基本一致，與目前實驗室所采用的酶聯免疫吸附法檢測結果相符，且檢測速度更快，同一批號試劑一次定標后無需再校準。檢測性能達到實驗室和臨床要求，且簡便易行、穩定性高，可采取單個標本隨時檢測，不需要成批操作，大大縮短報告等待時間，解決長時間等待結果的問題。該方法為本院SLE 患者的診斷和治療監測提供很好的依據。