兩種方法檢測先天性心臟發育異常胎兒的染色體結果分析

趙丹陽，楊微微，王文靖，鞠明艷，任晨春

（1.天津醫科大學研究生院，天津 300070；2.天津市中心婦產科醫院檢驗科，天津 300199）

先天性心臟發育異常（CHD）是最常見的人類先天性畸形之一[1]，是新生兒發病和死亡的主要原因。隨著超聲診斷技術和外科技術的提高，越來越多的胎兒期CHD 得到早期診斷和治療，如何盡早確定胎兒CHD 的病因，進行個性化處理是產前診斷面臨的主要問題。雖然CHD 的病因存在異質性，但仍有大約20%的CHD 可以歸因于染色體異常、單基因缺陷或環境因素[2]。本研究探討拷貝數變異測序（copy number variation sequencing，CNV-seq）技術聯合核型分析技術在產前診斷胎兒期CHD 染色體異常的應用價值，為臨床決策提供技術支持。

1 對象與方法

1.1 研究對象 收集2019 年2 月至2022 年8 月在超聲科診斷為胎兒CHD 的單胎孕婦60 例，孕婦年齡18～45 歲，平均年齡（30.58±4.97）歲，孕周18～24 周，平均孕周為（21.70±2.25）周。所有孕婦均接受羊膜腔穿刺，對胎兒進行核型分析，同時行CNV-seq檢測。納入標準：（1）超聲科由一名具有副高及以上職稱的專業醫師進行超聲心動檢查，檢測房室與大血管的關系，提示胎兒存在心臟及大血管結構異常。（2）夫妻雙方均在醫院產前診斷門診進行遺傳咨詢，了解有創產前診斷的風險并簽署知情同意書。（3）術前進行血常規、血生化、血凝及傳染病病原體篩查，無穿刺禁忌證。此項目經院級專家倫理委員會審批通過，倫理編號為2020KY080。

1.2 研究方法

1.2.1 羊膜腔穿刺術 嚴格遵循無菌操作，在超聲引導下行羊膜腔穿刺術，分別抽取2 管10 mL 羊水和1 管3 mL 羊水。

1.2.2 胎兒羊水細胞培養及核型分析 將獲得的2 管10 mL 羊水，1 500×g離心10 min 后分離羊水細胞，留取1 mL 沉淀混勻后分別接種于兩瓶含3 mL 培養基的培養瓶中，7～9 d 后換液，繼續培養48 h，加入0.3 mL 秋水仙素（20 μg/mL），培養2 h 后采用胰酶消化法收獲，進行G 顯帶染色，必要時進行C 顯帶或者N 顯帶，按照ISCN2020 版標準，計數30個，分析5 個分散好、中等長度的中期分裂相。

1.2.3 胎兒羊水細胞CNV-seq 檢測 將抽取的1管3 mL 羊水，使用北京貝瑞和康公司提供的科安試劑盒，按照標準流程進行操作：DNA 提取→酶反應→純化→文庫純化→文庫質控→測序→生物信息分析。結果判讀參照人類基因組hg19 版本和DGV、DECI-PHER、OMIM、UCSCS 及PubMed 等數據庫，判定為良性CNVs、可疑良性CNVs、臨床意義不明確的CNVs（VOUS）、可疑致病性CNVs 和致病性CNVs。對檢測到亞顯微結構異常的致病性CNVs和可疑致病的CNVs，建議胎兒父母行CNV-seq 檢測，以明確變異的遺傳性質及相關臨床意義。

1.3 統計學處理 對于臨床數據采用SPSS 25 軟件分析，組間比較采用χ2檢驗，P＜0.05 差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 胎兒超聲檢測結果 60 例CHD 胎兒中，23 例是獨立性CHD，其中10 例為室間隔缺損；37 例不僅有CHD，還伴有心外結構/軟指標異常，其中合并腦部異常10 例，泌尿系統異常3 例，消化系統異常2 例，其他畸形包括合并唇腭裂、長骨短小、多指/趾或并指/趾共16 例，單臍動脈6 例（表1）。

表1 60 例CHD 胎兒超聲結果分類表Tab.1 Ultrasound results of 60 fetuses with CHD

2.2 兩種方法檢測CHD 胎兒染色體結果分析 60例CHD 胎兒均行核型分析和CNV-seq 檢測，發現染色體異常20 例，染色體異常檢出率33.3%。其中核型分析與CNV-seq 結果一致檢出11 例，包括9 例數目異常和1 例衍生染色體及1 例嵌合體；兩種方法檢出不一致9 例，其中核型分析檢出2 例平衡性結構異常，CNV-seq 未能檢出；7 例CNV-seq 檢出為微缺失/微重復綜合征，核型分析未見明顯異常（表2）。

表2 兩種方法檢測染色體異常CHD 胎兒結果分析Tab.2 Analysis of the results of chromosome abnormality of fetus with CHD by two methods

核型分析檢出染色體異常例數為13 例，其中數目異常9 例，包括4 例47，XX/XY，+21，3 例47，XX/XY，+18，1 例45，X，1 例47，XXY；結構異常4例，包括羅氏易位45，XY，der（14；21）（q10；q10）1例，平衡易位46，XY，t（8；15）（p10；q10）1 例，衍生染色體1 例，核型為46，XY，der（18）dup（18）（q11.2-q23），嵌合體1 例，47，XY，+mar[16]/46，XY[19]。

CNV-seq 檢測異常CNVs 例數為18 例，其中數目異常9 例，同核型結果一致。存在微缺失/微重復異常9 例，1 例核型結果為衍生染色體的患者CNV-seq 檢測結果為dup（18）（q11.2q23）6.7 Mb；1例核型分析為47，XY，+mar[16]/46，XY[19]嵌合體，經CNV-seq 證實為dup（22）（q11.1q11.21）1.7 Mb，確定了核型分析中marker 來源于22 號染色體；7例核型分析結果正常的患者CNV-seq 表現為微缺失/微重復，分別為dup（18）（q23）1Mb，dup（1）（p36.13）1.1 Mb，dup（22）（q11.21）2.55 Mb，4 例為del（22）（q11.21）2.65-2.7 Mb。所有CNVs 結果通過檢索UCSC、DECIPHER、OMIM、Clin Var、DGV、PUB -MED數據庫，發現致病性CNVs 6 例，可疑致病性CNVs 3 例（表3）。

表3 7 例CNV-seq 微缺失/微重復患者臨床表現Tab.3 Clinical manifestations of CNV-seq microdeletion/microduplication in 7 patients

2.3 不同類型CHD 胎兒的染色體異常結果分析伴心外結構/軟指標異常CHD 組染色體異常率高于獨立性CHD 組，但兩組間比較差異無統計學意義[37.8%（14/37）vs.26.1%（6/23），χ2=1.76，P>0.05]，見表4。

表4 兩組CHD 胎兒染色體異常檢出率比較Tab.4 Comparison of detection rates of fetal chromosomal abnormalities in CHD between the two groups

23 例獨立性CHD 中6 例有染色體異常：4 例表型為室間隔缺損，染色體結果分別為2 例21 三體，1 例羅氏易位，1 例平衡易位；1 例左心發育不良，染色體結果為1p36.13 存在1.1 Mb 重復；1 例三尖瓣狹窄、肺動脈瓣閉鎖，染色體結果為18q23 存在1 Mb 重復。

37 例CHD 合并心外結構/軟指標異常中14 例有染色體異常：染色體數目異常占7 例，染色體結果分別為18 三體3 例，21 三體2 例，45，X 和47，XXY 各1 例，這7 例中5 例表現為神經系統異常（脈絡叢囊腫或腦積水），2 例為消化系統畸形。染色體結構異常7 例，1 例核型46，XY，der（18）dup（18）（q11.2q23），胎兒表型為復雜性先心病，同時合并腎囊腫；1 例核型47，XY，+mar[16]/46，XY[19]，CNVseq 證實為dup（22）（q11.1q11.21）1.7 Mb，結合核型分析結果，考慮marker 為2 倍的22q11.1q11.21 結合后形成的新的染色體片段，表型為室間隔缺損伴消化系統畸形；其余5 例中4 例為22q11.2 微缺失綜合征，心臟畸形均為圓錐動脈干異常，心外異常表現為脈絡叢囊腫/腦積水、唇腭裂、長骨短小、單臍動脈，1 例為22q11.2 微重復綜合征，重復片段大小為2.55 Mb，CHD 類型為三尖瓣狹窄，心外異常為脈絡叢囊腫。

3 討論

CHD 胎兒染色體異常率在10%～30%[3-4]。本研究中胎兒CHD 染色體異常率為33.3%（20/60）。染色體異常包括數目異常和結構異常。其中21 三體、18 三體和13 三體是造成CHD 的染色體數目異常最常見病因，其他常見病因還包括染色體微缺失/微重復綜合征等[5-6]。

本研究CHD 胎兒檢出染色體異常共20 例，其中核型分析與CNV-seq 結果一致檢出11 例，包括9 例數目異常、1 例衍生染色體及1 例嵌合體；兩種方法檢出不一致9 例，其中核型分析獨立檢出2 例平衡性結構異常，CNV-seq 獨立檢出7 例微缺失/微重復綜合征。兩種方法檢出率不一致與其方法局限性有關。在胎兒染色體檢測方面，核型分析是檢測的“金標準”，對染色體數目異常和大片段結構缺失或重復有較高的診斷率，特別是可以檢出易位、倒位、插入等平衡性結構異常，相對于分子診斷具有絕對性優勢[7]。但是核型分析也存在很多短板，比如檢測周期長，無法檢測5～10 Mb 以下微缺失/微重復，存在羊水培養失敗可能，受到從業人員經驗水平限制，存在一定的誤差。而CNV-seq 作為第二代低深度高通量測序技術檢測樣本范圍廣，無需培養，可發現小片段微缺失/微重復，2 周左右即可出具報告，節約時間成本。所以CNV-seq 技術是核型分析的有效補充，提高染色體異常的檢出率。

本研究60 例CHD 胎兒中，分為伴心外結構/軟指標異常CHD 組和獨立性CHD 組，染色體異常率在兩組間差異沒有統計學意義，可能與本研究選取樣本量過小相關。23 例獨立性CHD 中染色體異常6 例，2 例為21 三體，1 例為羅氏易位，1 例平衡易位，另外2 例微重復綜合征，通過CNV-seq 檢測得出。37 例CHD 合并心外結構/軟指標中14 例有染色體異常，核型檢出率為64.3%（9/14），明顯低于CNV-seq 檢出的檢出率100%（14/14）。其中值得注意的是，1 例核型結果為18 號染色體的衍生染色體，核型為46，XY，der（18），通過CNV-seq 檢測確定是18 號染色體的重復，重復片段為q11.2q23。1 例核型分析存在低比例嵌合，并發現標記染色體，核型47，XY，+mar[16]/46，XY[19]，CNV-seq 結果為22q11.1q11.21 長度為1.7 Mb 的微重復，通過核型嵌合比例結合CNV-seq 結果，可推測該患兒marker染色體為2 倍的22q11.1q11.21 片段重合組成，該片段包含TUBA8、PEX26、USP18 等16 個蛋白編碼基因或基因片段，其中6 個OMIM morbid 基因，該重復片段與貓眼綜合征有關，該綜合征臨床表型多種多樣，如雙眼虹膜下方垂直性缺損、白內障、脈絡膜缺損、視網膜發育不全、類似貓眼、雙眼距離增寬、瞼裂小而斜、小眼球、斜視、輕度智力低下、心臟缺陷、肛門閉鎖等，確定為致病性CNVs。雖然核型分析較CNV-seq 在大片段結構變異中更為直觀，但CNV-seq 較核型分析斷裂位點定位更為精確，兩者在胎兒CHD 患者病因診斷中相互結合，能夠有效提高CHD 的確診率，明確染色體異常類型和斷裂位點，為臨床做出進一步診療提供依據。

本研究有4 例CHD 胎兒存在22q11.2 微缺失，22q11.2 微缺失綜合征被認為是與CHD 最相關的微缺失/微重復綜合征。它的表型變異譜比較寬，攜帶相同異常片段的個體表型不盡相同，可以從正常到生長發育遲緩、智力障礙、自閉癥、先天性心臟病、唇腭裂、小頭畸形、肌張力減弱等，片段缺失大小與表型之間不存在正相關，其外顯率約21.9%[8-11]。Thomas 等[12]報道，22q11.2 微缺失綜合征在胎兒CHD核型結果正常者中占6.4%。王瑾等[13]報道64%的22q11.2 微缺失綜合征患者有CHD 表型，以圓錐動脈干畸形最為多見。這4 例CHD 胎兒心臟表型主要為永存動脈干、房室間隔缺損、肺動脈瓣狹窄、法洛氏四聯癥，心外表現為唇腭裂、單臍動脈、脈絡叢囊腫和胎兒發育遲緩。它們父母表型正常，經CNV-seq 檢測均為正常，證實胎兒為新發突變。除微缺失綜合征以外，本研究經CNV-seq 檢測發現1例22q11.2 微重復綜合征，表型為三尖瓣狹窄，伴有心外異常（脈絡叢囊腫）。由此可見22q11.2 微缺失/微重復是胎兒CHD 的另一主要病因。

綜上所述，兩種方法在檢測CHD 胎兒染色體異常中各有利弊，聯合應用可提高染色體異常檢出率，從而明確胎兒CHD 的病因，為后續的遺傳咨詢提供可靠的病因學依據，指導患兒家庭做出最優選擇。