RA滑膜成纖維樣細(xì)胞外泌體促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M1極化

虞珊珊,李 靜,徐 臻,成 宇,宗 明,范列英

(同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院檢驗科,上海 200120)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種以慢性增生性滑膜炎、侵蝕性關(guān)節(jié)炎為主要表現(xiàn)的自身免疫病,我國大陸地區(qū)的RA患病率約為0.28%[1]。其特征性病理變化為關(guān)節(jié)滑膜炎癥細(xì)胞浸潤、滑膜成纖維細(xì)胞(fibroblast-like synoviocytes,FLS)異常增生、血管翳形成,病變的滑膜組織分泌大量炎性細(xì)胞因子及酶類侵蝕關(guān)節(jié)軟骨和軟骨下骨質(zhì),造成關(guān)節(jié)不可逆性破壞、畸形和功能喪失[2]。FLS在介導(dǎo)RA的直接組織損傷和疾病的持續(xù)發(fā)展中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[3],可分泌IL-6、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)等細(xì)胞因子[4-6],影響微環(huán)境中其他免疫細(xì)胞如單核細(xì)胞[7]。單核細(xì)胞在關(guān)節(jié)局部活化為巨噬細(xì)胞(macrophage,M?)后通常分為經(jīng)典活化型(M1)和替代活化型(M2a、M2b)。M1具有很強(qiáng)的吞噬免疫清除功能,可分泌TNF-α、IL-1、IL-6、IL-12等參與促炎及抗原呈遞。M2a可分泌TGF-β、VEGF、制瘤素等發(fā)揮抗炎、促進(jìn)傷口愈合和組織修復(fù)功能。M2b則分泌大量IL-10和少量IL-12,發(fā)揮免疫抑制、控制炎癥反應(yīng)的作用。目前通常認(rèn)為在RA關(guān)節(jié)滑膜組織中存在M1過度激活,同時M2數(shù)量和功能不足,是滑膜炎難愈的主要因素[8],其具體機(jī)制仍未完全明確。

1 材料與方法

1.1 一般資料

滑膜組織取自2020年6月—2022年10月于同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院風(fēng)濕免疫科就診的RA患者關(guān)節(jié)鏡手術(shù)切除和常規(guī)病理檢查后剩余的滑膜組織。PBMC從健康志愿者全血中分離,研究經(jīng)同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)(倫理批準(zhǔn)號:No.2020 tjdx),且均取得患者的知情同意。

1.2 試劑與儀器

RPMI 1640培養(yǎng)液購自美國Corning公司;胎牛血清、青霉素、鏈霉素混合液購自美國Gibco公司;M-CSF購自美國Sigma公司;無外泌體血清購自美國SBI公司;聚丙烯離心管、超速離心機(jī)購自美國Beckman公司;透射電子顯微鏡購自日本日立公司;納米顆粒跟蹤分析儀來自普邁生物科技有限公司;CD9、CD63抗體購自美國Abcam公司;實時熒光定量PCR儀來自ABI公司;電泳儀購自美國Bio-Rad公司;RIPA裂解液、BCA試劑、抗體稀釋液購自碧云天生物技術(shù)有限公司;TRIzol試劑購自Invitrogen公司;miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自廣州銳博生物技術(shù)有限公司;正置熒光顯微鏡購自Leica公司;流式微珠陣列(CBA)流式術(shù)檢測IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IL-12P70、INF-γ、INF-α、TNF-α、IL-17、IL-1β、IL-6和IL-8共12項炎癥因子試劑盒購自杭州賽基生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 CBA法檢測細(xì)胞因子 收集RA和OA關(guān)節(jié)液或細(xì)胞培養(yǎng)上清液,1 000×g,離心20 min,轉(zhuǎn)移上清液至新的離心管。使用細(xì)胞因子檢測試劑盒按照說明書操作,于流式細(xì)胞儀器上檢測并分析結(jié)果。

1.3.2 免疫組織化學(xué)法染色 將滑膜組織樣本制成石蠟切片,將切片脫蠟脫水。用3%H2O2室溫孵育10 min以清除內(nèi)源性過氧化物酶。加20%山羊血清室溫封閉1 h后,加一抗(CD9)4 ℃過夜,加入相應(yīng)二抗室溫孵1 h,加DAB顯色。顯微鏡下觀察切片,陽性部位呈棕褐色,細(xì)胞核呈藍(lán)色。

1.3.4 FLS上清液外泌體提取和分析 FLS以2×105/mL的密度接種于10 cm培養(yǎng)皿中置于5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng),更換為含10%無外泌體血清1640培養(yǎng)液,置于培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48 h;收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液于50 mL離心管中,4 ℃,300×g離心10 min,以去除懸浮細(xì)胞,轉(zhuǎn)移上清液至新的離心管;4 ℃,2 000×g離心10 min,以去除死細(xì)胞,轉(zhuǎn)移上清液至新的離心管;4 ℃,10 000×g離心30 min,進(jìn)一步離心去除細(xì)胞碎片;使用天平稱重法絕對配平后放入超高速離心機(jī),100 000×g,4 ℃離心60 min;小心去除上清液,加入無菌PBS清洗離心獲得的外泌體,100 000×g,4 ℃離心60 min;小心去除上清液,加入無菌PBS于冰上溶解外泌體。

1.3.6 Western印跡法 在外泌體中加入等體積細(xì)胞裂解液,使用移液器吹打數(shù)次,于冰上裂解10 min,14 000×g離心10 min。上清液液中的蛋白質(zhì)樣品立即收集,BCA法測定蛋白濃度。取30 μg總蛋白用10% SDS-PAGE膠分離后轉(zhuǎn)移到PVDF膜。在含5%脫脂奶粉的PBS封閉2 h后,使用一抗稀釋液稀釋一抗(CD9、CD63)4 ℃下孵育過夜,隨后使用辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育,洗滌后滴加ECL化學(xué)發(fā)光液,于化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)中掃描。

1.3.7 PBMC分離 采用EDAT抗凝管收集健康志愿者血液,使用等體積PBS對比稀釋。稀釋后的全血緩慢加入淋巴細(xì)胞分離液上層,于室溫400×g,離心30 min。小心吸取中間云霧層單個核細(xì)胞層細(xì)胞(PBMC),加入配制好的紅細(xì)胞裂解液5 mL,輕輕吹打混勻靜置5 min,室溫300×g離心5 min。棄上清液,用3 mL的PBS洗滌液重懸細(xì)胞,室溫300×g離心5 min。重復(fù)洗滌1次,棄上清液,加入完全1640培養(yǎng)液重懸PBMC。

1.3.8 M?誘導(dǎo) PBMC以每孔2×104個接種于24孔板中,加入100 ng/mL C-MSF,放入5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 d,隔天更換新的培養(yǎng)液并補(bǔ)充100 ng/mL C-MSF,細(xì)胞完全貼壁,即M?,用于后續(xù)的實驗。

1.3.9 RT-PCR檢測 外泌體刺激M? 48 h后,抽提RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。反應(yīng)條件為:95 ℃,30 s,95 ℃,5 s,60 ℃,34 s,40個循環(huán),熔解曲線分析:95 ℃,15 s;60 ℃,1 min;95 ℃,15 s。結(jié)果處理:每個檢測均作3個復(fù)孔,計算復(fù)孔Ct值的平均值,ΔCt表示目的基因相對表達(dá)拷貝數(shù)(ΔCt=目的基因Ct值-內(nèi)參基因Ct值),計算2-ΔΔCt表示實驗組目的基因的表達(dá)相對于正常對照組目的基因變化倍數(shù)。引物序列見表1。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 關(guān)節(jié)滑膜液中細(xì)胞因子表達(dá)情況

收集6例RA及6例OA患者關(guān)節(jié)滑液標(biāo)本,通過CBA法檢測滑液中IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-1β、IL-17、IL-10、IFN-α、TNF-α、IL-12P70、IFN-γ共12種細(xì)胞因子表達(dá)情況。結(jié)果顯示,RA患者關(guān)節(jié)液中M1型炎性細(xì)胞因子IL-1β(P<0.05)、IL-6(P<0.001)、IL-8(P<0.05)及M2型炎性細(xì)胞因子IL-10(P<0.05)水平均顯著高于OA患者,IL-2、IL-4、IL-5、IL-17、IFN-α、TNF-α、IL-12P70、IFN-γ在兩組中均含量較低,差異無統(tǒng)計學(xué)意義,見圖1。

圖1 CBA法檢測RA、OA關(guān)節(jié)液中細(xì)胞因子的含量

2.2 RA和OA滑膜組織CD9表達(dá)情況

免疫組織化學(xué)染色法檢測6例RA和6例OA患者關(guān)節(jié)滑膜組織外泌體標(biāo)志物CD9的表達(dá),結(jié)果顯示RA組滑膜中CD9分子明顯高表達(dá),見圖2。

圖2 免疫組化檢測RA和OA滑膜組織CD9表達(dá)情況

2.3 外泌體鑒定

分離培養(yǎng)滑膜原代RA-FLS和OA-FLS,并收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液,通過多次離心去除死細(xì)胞、細(xì)胞碎片及大囊泡后,經(jīng)超速離心法獲得外泌體。Western印跡法和NTA方法鑒定外泌體;Western印跡法結(jié)果顯示,外泌體特異性表面標(biāo)志物CD9、CD63均可被檢測到,見圖3A。NTA結(jié)果檢測顯示外泌體直徑大小集中在100 nm左右,見圖3B,RA-FLS提取的外泌體濃度顯著高于OA-FLS(P<0.05),見圖3C。

圖3 外泌體鑒定

2.4 RA-FLS外泌體對M?極化的影響

使用OA-FLS和RA-FLS來源外泌體刺激M?,通過RT-PCR和CBA法檢測M?極化分子mRNA和細(xì)胞因子水平。結(jié)果顯示,相比于OA-FLS外泌體,RA-FLS外泌體刺激M?后,M1極化標(biāo)志物TNF-α、CCR-7、NOS-2 mRNA均明顯上調(diào)表達(dá)(P<0.05),而M2a極化標(biāo)志物TGF-β mRNA明顯下調(diào)表達(dá)(P<0.05),M2b極化標(biāo)志物IL-10 mRNA表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05)。在細(xì)胞因子水平,RA-FLS外泌體明顯促進(jìn)M?分泌IL-6(P<0.001)、TNF-α(P<0.05)、IL-8(P<0.05)分泌,但對IL-10(P>0.05)分泌無影響,其他細(xì)胞因子無分泌,見圖4B。上述結(jié)果表明,RA-FLS所產(chǎn)生的外泌體主要促進(jìn)M1極化,對M2的無顯著影響。

圖4 RA-FLS外泌體對M?極化的影響

3 討 論

M?在組織局部受到不同刺激后分化為M1和M2,在RA的發(fā)病和慢性持續(xù)炎癥進(jìn)展中起著重要作用。本研究發(fā)現(xiàn),在RA患者關(guān)節(jié)液中存在明顯高水平的包括IL-1β、IL-6、IL-8在內(nèi)的M1型細(xì)胞因子,同時M2型細(xì)胞因子IL-10水平也顯著高于OA組。外泌體在細(xì)胞和組織之間廣泛表達(dá),并在細(xì)胞與細(xì)胞間相互作用及基因調(diào)控中發(fā)揮作用,與M?極化密切相關(guān)[17]。通過免疫組織化學(xué)法發(fā)現(xiàn),在RA滑膜中外泌體標(biāo)志物CD9顯著高表達(dá),提示RA關(guān)節(jié)滑膜局部可能存在較高濃度外泌體。RA-FLS是RA滑膜的關(guān)鍵組成細(xì)胞,分離培養(yǎng)原代RA-FLS,并提取其上清液外泌體,通過粒徑分析及Western印跡法檢測顆粒大小以及其表面特異的蛋白標(biāo)志物CD9和CD63,證實采用超速離心法可有效分離RA-FLS細(xì)胞上清液外泌體。

以往對RA-FLS外泌體進(jìn)行的研究發(fā)現(xiàn),通過改變RA-FLS外泌體中miR-486-5p含量,可調(diào)節(jié)Tob1/BMP/Smad信號通路促進(jìn)成骨,在RA的治療中具有一定前景[18]。本研究發(fā)現(xiàn),相較于OA-FLS,RA-FLS分泌的外泌體濃度更高,采用人外周血單個核細(xì)胞誘導(dǎo)的M?進(jìn)行體外實驗,證實RA-FLS外泌體具有更強(qiáng)的誘導(dǎo)M?向M1分化的功能,進(jìn)一步揭示了RA-FLS在RA發(fā)病及滑膜慢性炎癥中的作用,其下游信號通路有待進(jìn)一步研究。以往研究表明,外泌體中包裹大量miRNA,并可通過外泌體在細(xì)胞間轉(zhuǎn)運(yùn)并在功能上影響M?表型[17,19-20]。例如,脂肪來源的外泌體中高表達(dá)miR-34a,靶向Kruppel樣因子4(KLF4)抑制巨噬細(xì)胞向M2極化,促進(jìn)肥胖誘導(dǎo)的脂肪炎癥[21]。在腎損傷研究中發(fā)現(xiàn),腎小管上皮細(xì)胞來源外泌體中miRNA-19b-3p顯著高表達(dá),通過負(fù)調(diào)控細(xì)胞因子信號抑制因子-1(SOCS1),并進(jìn)一步活化NF-κB,促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M1極化,最終導(dǎo)致腎損傷的發(fā)生[22]。腸癌細(xì)胞來源的外泌體miR-934通過下調(diào)PTEN表達(dá)和激活PI3K/AKT信號通路誘導(dǎo)M2極化并促進(jìn)腸癌肝轉(zhuǎn)移[23]。M1和M2具有截然不同的典型表型和功能,但微環(huán)境發(fā)生改變時M?極化也可發(fā)生可逆性轉(zhuǎn)變[24]。通過調(diào)節(jié)M?極化來改善RA滑膜炎癥,有望成為新的免疫治療目標(biāo)[25]。因此,分析RA-FLS與OA-FLS來源外泌體中差異表達(dá)miRNA,探究在M1/M2極化起到關(guān)鍵作用的miRNA分子及其下游信號通路,將是課題組進(jìn)一步研究重點(diǎn)。

綜上,本研究發(fā)現(xiàn)RA關(guān)節(jié)液中M1和M2型細(xì)胞因子高表達(dá),滑膜中外泌體標(biāo)志物CD9表達(dá)增高;RA-FLS外泌體分泌能力明顯強(qiáng)于OA-FLS,并促進(jìn)M?向M1極化。深入研究RA-FLS外泌體中對M1極化起關(guān)鍵作用miRNA及其下游機(jī)制,使用藥理學(xué)或遺傳學(xué)抑制該關(guān)鍵miRNA的功能可能是一種有前景的治療RA的方法。