上海地區(qū)支氣管擴(kuò)張癥患者銅綠假單胞菌耐藥機(jī)制和分子流行病學(xué)特征

陳 慶 徐 蓉 孫景勇

（1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院臨床檢驗(yàn)診斷中心，上海 200025；2.上海市臨床檢驗(yàn)中心臨床微生物學(xué)研究室，上海 200126）

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）是一種條件致病革蘭陰性桿菌，在自然界中普遍存在，是醫(yī)院獲得性感染的主要病原。根據(jù)菌落形態(tài)，PA可分為黏液型和非黏液型。支氣管擴(kuò)張癥被認(rèn)為是僅次于哮喘和慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）的第三大常見慢性呼吸道疾病，患者痰樣本中常分離出PA，PA感染是影響支氣管擴(kuò)張嚴(yán)重程度和患者預(yù)后的一個(gè)重要危險(xiǎn)因素，PA反復(fù)感染會導(dǎo)致病情頻繁惡化、死亡率增加。目前，支氣管擴(kuò)張合并PA感染患者PA的耐藥特征、耐藥機(jī)制和分子流行病學(xué)相關(guān)研究較少。本研究擬分析支氣管擴(kuò)張合并PA感染患者耐藥和分子流行病學(xué)特征，為臨床診治提供參考。

1 材料和方法

1.1 樣本來源

收集分離自2019年6月—2021年11月上海地區(qū)6家三級甲等醫(yī)院18～75歲支氣管擴(kuò)張癥患者痰樣本的PA 73株。采用基質(zhì)輔助激光解析電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF，bio Mérieux，F(xiàn)rance）進(jìn)行菌種鑒定，采用下一代基因測序技術(shù)（next generation sequencing，NGS）進(jìn)行確認(rèn)，通過菌落形態(tài)和拉絲試驗(yàn)判定是否為黏液型PA。質(zhì)控菌株銅綠假單胞菌（ATCC 27853）購自上海市臨床檢驗(yàn)中心。本研究經(jīng)上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院倫理委員會審核通過。

1.2 方法

1.2.1 體外藥物敏感性試驗(yàn)

參照美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）M100-Ed32文件[1]對分離的PA菌株進(jìn)行體外藥物敏感性試驗(yàn)。測定的抗菌藥物包括：頭孢他啶（ceftazidime，CAZ）、哌拉西林/他唑巴坦（piperacilin/tazobactam，TZP）、美羅培南（meropenem，MEM）、妥布霉素（tobramycin，TOB）、阿米卡星（amikacin，AMK）、環(huán)丙沙星（ciprofloxacin，CIP）、左氧氟沙星（levofloxacin，LEV）、多黏菌素B（polymyxinB，PB）、頭孢吡肟（cefepime，F(xiàn)EP）、亞胺培南（imipenem，IPM）、哌拉西林（piperacillin，PIP），結(jié)果根據(jù)CLSI M100-Ed32文件[1]中的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行解釋。

1.2.2 DNA旋轉(zhuǎn)酶、DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ、膜孔蛋白OprD比對

培養(yǎng)、分離、純化PA菌株后，提取分離株的DNA，送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行NGS（細(xì)菌基因組掃描圖），獲得分離株的核酸序列和預(yù)測的氨基酸序列。將73株P(guān)A中對左氧氟沙星或環(huán)丙沙星非敏感菌株預(yù)測的氨基酸序列與GenBank數(shù)據(jù)庫（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/）PA標(biāo)準(zhǔn)株P(guān)AO1的DNA旋轉(zhuǎn)酶亞單位GyrA、GyrB和DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ亞單位ParC、ParE的氨基酸序列進(jìn)行比對分析；將73株P(guān)A中對亞胺培南非敏感菌株預(yù)測的氨基酸序列與GenBank數(shù)據(jù)庫（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/）PA標(biāo)準(zhǔn)株P(guān)AO1中膜孔蛋白OprD的氨基酸序列進(jìn)行比對分析。使用SnapGene-4.24軟件對上述結(jié)果進(jìn)行比對分析。

1.2.3 耐藥基因檢測和同源性分析

將NGS所得核酸序列與Resfinder數(shù)據(jù)庫（https：//cge.cbs.dtu.dk/services/ResFinder/）進(jìn)行比對，統(tǒng)計(jì)PA分離株中所含的耐藥基因。根據(jù)測定的核酸序列對菌株進(jìn)行多位點(diǎn)序列分型（multilocus sequence typing，MLST），將所得核酸序列（7個(gè)管家基因：guaA、acsA、mutL、trpE、aroE、nuoD、ppsA）與PubMLST數(shù)據(jù)庫（https：//pubmlst.org/organisms/pseudomonasaeruginosa）進(jìn)行比對，統(tǒng)計(jì)分離株的MLST結(jié)果，用phyloviz-2.0軟件進(jìn)行MLST分析，基于phyloviz算法對菌株進(jìn)行分組，基于等位基因特征的組定義繪制草圖，以顯示遺傳關(guān)系[2-3]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用WHONET 5.6軟件分析最終藥物敏感性試驗(yàn)數(shù)據(jù)，采用SPSS 25.0軟件分析黏液型與非黏液型PA耐藥率的差異。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同性別患者黏液型PA檢出情況

73株P(guān)A中，分離自男性、女性患者樣本的菌株分別為24株（32.9%）、49株（67.1%）。73株P(guān)A中，有43株（58.9%）為黏液型PA，30株（41.1%）為非黏液型菌株。

2.2 PA分離株對不同抗菌藥物的耐藥性

73株P(guān)A對喹諾酮類抗菌藥物的耐藥率最高，對左氧氟沙星的耐藥率為41.1%，對環(huán)丙沙星的耐藥率為34.2%；非黏液型PA對亞胺培南的耐藥率（20.0%）遠(yuǎn)高于黏液型PA（7.0%）。未發(fā)現(xiàn)對多黏菌素B和阿米卡星耐藥的PA菌株。黏液型與非黏液型PA對臨床常用抗菌藥物的耐藥率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

2.3 PADNA旋轉(zhuǎn)酶、DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ比對結(jié)果

73株P(guān)A中，對左氧氟沙星或環(huán)丙沙星耐藥的PA共44株。將這44株P(guān)A與PAO1進(jìn)行比對，結(jié)果顯示，有單個(gè)蛋白突變15株，雙蛋白突變15株，3個(gè)蛋白突變10株，4個(gè)蛋白突變1株，4個(gè)蛋白均無突變菌株3株。見表2。

表2 PA DNA旋轉(zhuǎn)酶、DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ突變預(yù)測結(jié)果

2.4 PA膜孔蛋白OprD比對結(jié)果

73株P(guān)A中，對亞胺培南非敏感的銅綠假單胞菌共13株，將這13株菌與PAO1進(jìn)行比對，結(jié)果顯示全部存在突變或缺失。13株對亞胺培南敏感的PA中，有7株（53.8%）的突變類型（43D-N、57S-E、59S-R、202E-Q、210I-A、230E-K、240S-T、262N-T、267A-S、281AG、296K-Q、301Q-E、310R-G、359V-L、372-383：MSDNNVGYKNYG-VDSSSS缺失YAGL）完全一致，有5株（38.5%）存在替換合并大片段丟失，有1株（7.7%）存在3個(gè)位點(diǎn)（103TS、115K-T、170F-L）的突變。

2.5 PA分離株檢出獲得性耐藥基因情況

73株P(guān)A中，共發(fā)現(xiàn)20種不同類型的獲得性耐藥基因，包括β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、磷霉素類、氯霉素類、磺胺類、喹諾酮類，見表3。所有菌株都含有blaPAO、aph（3'）-IIb、fosA和catB7；體外藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示，絕大多數(shù)耐藥基因與耐藥表型是一致的，但所檢出的獲得性耐藥基因crpP與喹諾酮類抗菌藥物的耐藥表型不相符。

表3 73株P(guān)A耐藥基因分布

2.6 73株P(guān)A的MLST結(jié)果

73株P(guān)A共檢出52個(gè)ST型別，其中1株為新發(fā)現(xiàn)的ST型，已遞交PubMLST數(shù)據(jù)庫。居第1位的ST型別為ST277，占5.5%（4/73），其次是ST274、ST357、ST514，各占4.1%（3/73）。52種ST型被分成12個(gè)克隆復(fù)合體，僅ST357（編號C470、C473、C694）與ST3991（編號C125）屬于同一個(gè)克隆復(fù)合體，并在進(jìn)化上具有一定的同源性。73株P(guān)A菌株MLST最小生成樹見圖1。

圖1 PA MLST最小生成樹

3 討論

PA是常見的條件致病菌，也是導(dǎo)致支氣管擴(kuò)張癥患者感染的最主要病原體。PA的感染或定植與支氣管擴(kuò)張的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切，該菌及其毒力基因會影響疾病的急性加重頻率和患者預(yù)后（如肺功能較差、肺功能下降速度更快、病死率更高）[4]。本研究收集了上海地區(qū)73例支氣管擴(kuò)張癥患者痰樣本中分離出的PA，從性別比例上看，女性多于男性，與顧悅等[5]的研究結(jié)果相符。本研究結(jié)果顯示，支氣管擴(kuò)張癥患者感染的PA中，黏液型所占比例較大（58.9%），與相關(guān)研究結(jié)果[6]一致。黏液表型的出現(xiàn)與PA通過群集感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)控生物膜的形成有關(guān)。而黏液型PA更容易定植于支氣管擴(kuò)張癥患者氣道中，產(chǎn)生生物膜，不易被清除，同時(shí)產(chǎn)生毒力因子攻擊宿主細(xì)胞，導(dǎo)致多重耐藥和反復(fù)的支氣管-肺感染，為臨床治療帶來更多的挑戰(zhàn)。

本研究結(jié)果顯示，PA對氟喹諾酮類藥物的耐藥率最高（對左氧氟沙星、環(huán)丙沙星的耐藥率分別為41.1%和34.2%），且黏液型PA的耐藥性高于非黏液型PA；對亞胺培南的耐藥率為12.3%，但黏液型菌株的耐藥率低于非黏液型；對其他類抗菌藥物的耐藥率均＜6%。2020年全國細(xì)菌耐藥監(jiān)測報(bào)告顯示，PA對環(huán)丙沙星、左氧氟沙星的耐藥率全國平均分別為12.2%、13.4%[7]，遠(yuǎn)低于本研究結(jié)果。任何藥物在治療PA感染的過程中均可產(chǎn)生耐藥，而氟喹諾酮類藥物是支氣管擴(kuò)張癥患者清除PA感染的一線治療藥物，此類患者往往反復(fù)感染，導(dǎo)致氟喹諾酮類藥物的長期反復(fù)使用，從而造成其耐藥率的上升，建議在治療前根據(jù)藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果合理選擇抗菌藥物[1]。本研究NGS結(jié)果顯示，73株P(guān)A對氟喹諾酮類藥物的主要耐藥機(jī)制為DNA旋轉(zhuǎn)酶、DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ的突變，最主要的突變位點(diǎn)集中在GyrA的83位和87位、GyrB的466位、ParC的646位和262位，ParE的533位，且Thr-83→Ile為主要的突變方式，與以往的報(bào)道[8]相似。有研究發(fā)現(xiàn)，有41.1%的PA菌株中含有一種近年來新發(fā)現(xiàn)的獲得性喹諾酮耐藥基因crpP，該基因編碼的酶可通過磷酸化修飾環(huán)丙沙星而使其失去作用[9]，但本研究中攜帶有crpP基因的PA基因型和耐藥表型并不一致，部分菌株表現(xiàn)為對環(huán)丙沙星高度敏感，與相關(guān)研究結(jié)果[10-11]一致，原因尚需進(jìn)一步探究。PA對亞胺培南的耐藥機(jī)制主要為產(chǎn)碳青霉烯酶和膜孔蛋白OprD的缺失或突變[11]，本研究分離的13株亞胺培南非敏感PA除1株因攜帶blaIMP-45基因而產(chǎn)生耐藥外，其他菌株均存在OprD蛋白的突變或缺失，其中有7株的突變類型一致，且在372～383位點(diǎn)出現(xiàn)了廣泛的替代突變，同時(shí)還伴有氨基酸的缺失，與相關(guān)研究結(jié)果[12-13]相似。本研究僅發(fā)現(xiàn)4株對頭孢他啶或頭孢吡肟耐藥的菌株，除1株攜帶blaIMP-45外，NGS未檢測到超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因，而是和其他敏感株一樣，含有多種OXA型β-內(nèi)酰胺酶，但這些OXA型β-內(nèi)酰胺酶通常僅水解青霉素類藥物，并不介導(dǎo)細(xì)菌對頭孢菌素的耐藥。基于上述3株耐藥菌株同時(shí)對哌拉西林/他唑巴坦耐藥，本研究推測其可能的耐藥機(jī)制為誘導(dǎo)型AmpC酶突變引起酶的高表達(dá)。本研究中，PA對多黏菌素B和氨基糖苷類藥物高度敏感，僅發(fā)現(xiàn)1株對妥布霉素耐藥菌株，上述抗菌藥物的吸入治療是國外指南[14]推薦的清除PA支氣管擴(kuò)張癥患者感染的重要措施。我國抗菌藥物吸入劑型尚未獲批，但考慮到此類藥物的高敏感性，可以聯(lián)合β-內(nèi)酰胺類靜脈用藥作為二線治療。本研究中，黏液型與非黏液型PA耐藥率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能與收集的菌株數(shù)量較少有關(guān)。

定義PA高危克隆株流行特征的金標(biāo)準(zhǔn)是19年前Barry Curran開發(fā)的MLST分型方案[15]，迄今為止已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了超過4 000個(gè)ST型別。ST235、ST111和ST175是全球范圍內(nèi)PA流行的主要克隆株[16]。然而，在本研究中，73株P(guān)A被分成53種ST型，其中最多的ST277（在巴西廣泛流行[17]）也僅占5.5%（4/73），其次為ST274、ST357（與高毒力相關(guān)[18]）、ST514，各占4.1%，提示上海地區(qū)支氣管擴(kuò)張癥患者感染的PA不存在明顯的暴發(fā)流行。遺憾的是，本研究菌株數(shù)較少，且缺乏我國支氣管擴(kuò)張癥患者感染PA的分子流行病學(xué)數(shù)據(jù)，尚需進(jìn)一步擴(kuò)大菌株數(shù)，以進(jìn)一步明確上海地區(qū)支氣管擴(kuò)張癥患者感染的PA的分子流行特征。