晉產(chǎn)毛建草茶中有效成分鑒別及抗氧化活性研究

荊文靜，任 蕾

（1.山西工程職業(yè)學(xué)院，山西 太原 030001；2.山西中醫(yī)藥大學(xué)，山西 太原 030002）

毛建草[1]，學(xué)名巖青蘭，唇形科植物，生長于海拔650～2 400 m 的高山草原、草坡下陽處。全草具香氣，有藥用價值，具有清熱、解表、止痛的功效。山西晉北地區(qū)百姓自古將其制為茶飲，百姓俗稱“毛尖茶”。毛建草茶由毛建草發(fā)酵制成，具有延緩衰老、清熱排污的保健作用，該草本植物中含有豐富的氨基酸、維生素和微量元素，對于改善心肌缺血、緩解心絞痛、預(yù)防心血管疾病降低血黏度和血小板聚集度以及降低膽固醇的含量都具有一定的療效[1]。

中國是世界茶葉的故鄉(xiāng)也是世界唯一具有六大茶類的國家[2]。茶葉中含有多種具有生物活性的物質(zhì)，如茶多酚、咖啡因和氨基酸等[3]。茶多酚和咖啡因在茶葉中含量的多少常被作為檢測茶葉品質(zhì)的一項重要指標(biāo)。大量研究表明，茶多酚對人體健康極為有利[4-8]。茶多酚具有降壓安神、降血脂和延緩衰老的作用。適度的食用咖啡因可以興奮神經(jīng)，促進(jìn)新陳代謝，使人頭腦清醒有助于思維，提高工作效率，同時咖啡因耗能增強(qiáng)人體心臟和胃腸道的功能、調(diào)節(jié)脂肪代謝，還能起到解毒的作用[9-16]。因此從茶葉中如何提出更純的茶多酚和咖啡因尤為重要，本實(shí)驗對茶多酚、咖啡因的初提最優(yōu)溶劑進(jìn)行篩選并利用標(biāo)準(zhǔn)品和紫外分光光度法分析出茶多酚和咖啡堿存在于萃取部的位置，從而為毛建草茶中的茶多酚和咖啡堿的提取、純化奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗材料

1.1 藥材和試劑

茶多酚標(biāo)準(zhǔn)品，T0202-20MG，上海伊卡生物技術(shù)有限公司；咖啡因標(biāo)準(zhǔn)品，AS1055，上海伊卡生物技術(shù)有限公司；毛尖王茶，靜樂縣巾字土特產(chǎn)有限責(zé)任公司；石油醚，AR，天津市天力化學(xué)試劑有限公司，批號：20 160308；氯仿，AR；乙酸乙酯，AR，天津市興復(fù)科技發(fā)展有限公司，批號：20 150624；正丁醇，AR，天津市興復(fù)科技發(fā)展有限公司，批號：20 151031；濃鹽酸，AR；無水乙醇，AR，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號：20 151017；氨水，AR，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號：20 140310；氯化鐵，天津市興復(fù)科技發(fā)展有限公司，批號：20 160304；三吡啶三吖嗪，上海伊卡生物技術(shù)有限公司，T0235-1G；醋酸銨；硫酸亞鐵，天津市興復(fù)科技發(fā)展有限公司，批號：20140816。

1.2 儀器

FA224 電子天平，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；TU-1810 紫外分光光度計，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；JA4003 粉碎機(jī)，40 目（0.425 mm）篩；HK-1D 恒溫水浴槽，南京大學(xué)應(yīng)用物理研究所監(jiān)制；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；pH 調(diào)節(jié)計；1 000 mL分液漏斗；實(shí)驗室常見儀器。

2 實(shí)驗方法

2.1 實(shí)驗原理

將毛建草茶經(jīng)過熱水回流提取后，分別用不同極性的溶劑萃取，利用鐵離子還原/氧化分析（FRAP），得出各個溶劑部分的抗氧化能力；并將萃取后的供試品利用紫外分光光度法，對照茶多酚標(biāo)準(zhǔn)品、咖啡堿標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行定性分析。

鐵離子還原/氧化能力法[17-18]（FRAP）測定總抗氧化能力的原理是酸性條件下抗氧化物可以還原Fe-TPTZ 產(chǎn)生藍(lán)紫色的Fe-TPTZ，然后在593 nm 處測定該處的吸光度，則此吸光度可作為樣品中的總抗氧化能力的指標(biāo)。由于樣品中的鐵離子或亞鐵離子的總濃度通常低于10 μmol/L，因此樣品中的鐵離子或亞鐵離子不會顯著干擾FRAP 法的檢測反應(yīng)。由于反應(yīng)體系中的鐵離子或亞鐵離子是和TPTZ 螯合的，樣品本身含有的少量金屬離子螯合劑通常也不會顯著影響檢測反應(yīng)。

定性分析是指根據(jù)紫外色譜中樣品的吸收光譜的形狀和位置與標(biāo)準(zhǔn)品的基本相似以及在薄層色譜中斑點(diǎn)出現(xiàn)位置相近，則可初步判斷樣品中含有與標(biāo)準(zhǔn)品相同的成分。

2.2 試劑的準(zhǔn)備

2.2.1 茶多酚標(biāo)準(zhǔn)品的配制

精密稱取茶多酚標(biāo)準(zhǔn)品5 mg，溶于50 mL 容量瓶中，用50%的乙醇稀釋至刻度線，搖勻，配制成100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)原液，備用。

2.2.2 咖啡因標(biāo)準(zhǔn)品的配制

精密稱取咖啡堿標(biāo)準(zhǔn)品5 mg，溶于50 mL 容量瓶中，用50%的乙醇稀釋至刻度線，搖勻，配制成100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)原液，備用。

2.2.3 醋酸銨緩沖液的配制（0.3 mol/L）

取醋酸銨25 g 加水25 mL 溶解后，加7 mol/L 鹽酸溶液38 mL，用2 mol/L 鹽酸溶液或5 mol/L 氨溶液準(zhǔn)確調(diào)節(jié)pH 至3.5，用水稀釋至100 mL，備用。

2.2.4 TPTZ 的配制（0.01 mol/L）

取濃鹽酸1 mL 加水至300 mL，制成400 mmol/L的鹽酸備用。取TPTZ 31.233 mg，用10 mmol/L 的鹽酸定容至10 mL，備用。

2.2.5 三氯化鐵溶液的配制（0.02 mol/L）

取0.270 29 g 三氯化鐵定容至50 mL，備用。

2.2.6 展開劑配置

茶多酚展開劑：用移液管精密量取甲酸16 mL、乙酸乙酯16 mL、甲醇4 mL，按照4∶4∶1 的體積比配置得到茶多酚展開劑。

咖啡因展開劑：用移液管精密量取氯仿27 mL、甲醇3 mL，按照9∶1 的體積比配置得到咖啡因展開劑。

2.3 毛建草茶水提物的制備

稱取50 g 毛尖王茶，用粉碎機(jī)粉碎，過40 目（0.425 mm）篩，按照料液比1∶20，溫度100 ℃加入蒸餾水1 000 mL，加熱回流12 min，回流冷凝管第一滴滴下開始計時。然后用紗布趁熱過濾。再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行提取物的濃縮，體積至200 mL 左右，將濃縮后的提取物定容至250 mL，備用。

2.4 不同極性溶劑提取物的制備[19]

將水提物先用等體積的石油醚萃取，上層為石油醚層。水層仍用等體積的石油醚萃取2 次，合并三次萃取的石油醚層，回收溶劑（60 ℃），將石油醚層蒸干，加入50%的乙醇50 mL 制得石油醚部；將下層水層用等體積的氯仿萃取，下層為氯仿層，同理再用等體積氯仿萃取2 次，合并3 次萃取的氯仿，回收溶劑（70 ℃），將氯仿層蒸干，加入50%的乙醇50 mL 制得氯仿部；將上層水層用等體積的乙酸乙酯萃取，上層為乙酸乙酯層。水層仍用等體積的乙酸乙酯萃取2次，合并3 次萃取的乙酸乙酯層，回收溶劑（80 ℃），將乙酸乙酯層蒸干，加入50%的乙醇50 mL 制得乙酸乙酯部；將下層水層用等體積的正丁醇萃取，上層為正丁醇層，使用等體積正丁醇萃取2 次，合并3 次萃取的正丁醇層，回收溶劑（60 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀），將正丁醇層蒸干，加入50%的乙醇50 mL 制得正丁醇部；將水層蒸干加入50%的乙醇50 mL 制得水部。分別將其分成等量的2 份，一份用于做有效成分鑒別，另一份用于做抗氧化性研究。實(shí)驗流程如圖1 所示。

圖1 實(shí)驗流程圖

2.5 毛建草茶有效成分鑒別

用紫外分光光度法對所得5 種不同的萃取部以及茶多酚和咖啡因標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測，然后進(jìn)行分析。

2.6 FeSO4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取0.1～1.6 mmol/L 濃度范圍的FeSO4標(biāo)準(zhǔn)溶液于具塞試管中，準(zhǔn)確加入6 mL FRAP 工作液[V（醋酸鹽緩沖液）∶V（FeCl3溶液）∶V（TPTZ 溶液）=10∶1∶1]，600 μL 蒸餾水，混勻，在37 ℃下反應(yīng)10 min，于593 nm 測定吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.7 各極性溶劑提取物抗氧化能力檢測

在具塞試管中分別加入200 μL 不同極性樣品溶液，準(zhǔn)確加入6 mLFRAP 工作液[V（醋酸鹽緩沖液）∶V（FeCl3溶液）∶V（TPTZ 溶液）=10∶1∶1]，600 μL蒸餾水，混勻，37℃下恒溫反應(yīng)10 min，在593 nm 處測定吸光度值，平行測3 次，取其均值A(chǔ)。在標(biāo)準(zhǔn)曲線上換算成相應(yīng)FeSO4的濃度，即為FRAP 值。

3 實(shí)驗內(nèi)容和結(jié)果

3.1 毛建草茶有效成分鑒別

3.1.1 各有機(jī)溶劑萃取部紫外色譜（圖2～圖6）

圖2 乙酸乙酯部位紫外色譜

圖4 水部位紫外色譜

圖5 氯仿部位紫外色譜

圖6 石油醚部位紫外色譜

3.1.2 茶多酚和咖啡因標(biāo)準(zhǔn)品紫外色譜（圖7、圖8）

圖7 茶多酚標(biāo)準(zhǔn)品紫外色譜

圖8 咖啡因標(biāo)準(zhǔn)品紫外色譜

3.1.3 薄層色譜（圖9、圖10）

圖9 茶多酚標(biāo)準(zhǔn)品和乙酸乙酯部位薄層圖

圖10 咖啡因標(biāo)準(zhǔn)品和石油醚部位薄層圖

3.1.4 紫外色譜和薄層色譜分析

對紫外色譜進(jìn)行分析，茶多酚標(biāo)準(zhǔn)品在306 nm處出現(xiàn)波峰，咖啡因標(biāo)準(zhǔn)品在292 nm 處出現(xiàn)波峰。有機(jī)溶劑各萃取部位中，乙酸乙酯部位在305 nm 處出現(xiàn)波峰且與茶多酚標(biāo)準(zhǔn)品出現(xiàn)峰的波形相似，石油醚部位在292 nm 處出現(xiàn)波峰且與咖啡因標(biāo)準(zhǔn)品出現(xiàn)峰的波形相似，而且從薄層色譜分析茶多酚標(biāo)準(zhǔn)品的斑點(diǎn)在乙酸乙酯部位中也出現(xiàn)，同樣咖啡因標(biāo)準(zhǔn)品的斑點(diǎn)在石油醚部位中也出現(xiàn)，則可判斷乙酸乙酯部位中茶多酚含量多，石油醚部位中含有咖啡因含量多。因此在毛建草茶中用乙酸乙酯提取茶多酚最優(yōu)，用石油醚提取咖啡因最優(yōu)。

3.2 抗氧化性能力測試結(jié)果

3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖11 為FeSO4標(biāo)準(zhǔn)曲線，由圖11 可知，F(xiàn)eSO4濃度在0.1～1.5 mmol/L 范圍內(nèi)與在593 nm 處的吸光度呈良好線性關(guān)系，回歸方程為y=0.582 1x+0.005，R2=0.999 2。

圖11 FeSO4 標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.2.2 不同萃取部位抗氧化性能力比較

利用FRAP 法測定毛建草茶不同極性萃取液的抗氧化能力，結(jié)果如圖12 所示，F(xiàn)e3+還原抗氧化能力順序為：乙酸乙酯部位（537.3）＞正丁醇部位（536.0）＞水部位（518.2）＞氯仿部位（221.1）＞石油醚部位（94.5）由此可見，毛尖王茶不同極性萃取液的抗氧化活性中，乙酸乙酯部位最強(qiáng)，石油醚部位最弱。

圖12 不同萃取部位抗氧化能力比較

4 結(jié)論

利用紫外分光光度法分別對毛建草茶水提物的各有機(jī)溶劑萃取部進(jìn)行色譜分析，可確定該茶飲中富含茶多酚及咖啡因；由紫外圖譜和薄層分析可得出乙酸乙酯部位中茶多酚含量最多，石油醚部位中咖啡因含量最多。因此可推斷在毛建草茶的提取工藝中，茶多酚的最佳提取劑為乙酸乙酯，咖啡因的最佳提取劑為石油醚。

利用鐵離子還原/抗氧化能力分析（FRAP）法測定不同溶劑部位的鐵離子還原能力，得出各個萃取部都具有一定的抗氧化能力，其順序為乙酸乙酯部位＞正丁醇部位＞水部位＞氯仿部位＞石油醚部位，因此可判斷毛建草茶具有一定的抗氧化活性，可為進(jìn)一步開發(fā)利用這類民間代茶飲提供理論依據(jù)。