雞PGCs 及基因編輯技術

趙宗儀，張文慧，聶瑞雪，張 博，張 浩

（中國農業大學動物科學技術學院，北京 100193）

雞是全球飼養數量最多的畜禽，聯合國糧農組織統計數據（FAO）表明全世界雞只存欄量超過330 億只，每年出欄660 億只以上，是人類肉、蛋產品的主要供應源之一，對全球農業經濟做出了巨大貢獻。同時，雞在發育生物學、免疫研究和生物反應器等研究中具有舉足輕重的地位[1]。基因編輯是21 世紀最大的生物技術發現之一，為人類醫療與健康、生物育種、環境生態修復等方面帶來了深刻變革。鳥類胚胎在體外發育，很難對位于蛋殼和卵黃膜內的受精卵進行基因操作，雞胚中具有獨特遷移能力的原始生殖細胞（Primordial germ cells，PGCs），分離和體外培養的PGCs 仍然具有分化配子的能力。因此，PGCs 是對雞進行基因編輯的理想材料。本文綜述雞PGCs 的生物學特性及其基因編輯技術的應用，為禽類基因編輯研究提供參考。

1 雞PGCs 是進行基因編輯的理想載體

1.1 雞PGCs 的基本生物學特性

雞PGCs 最早由1870 年Waldeyer 觀察到[2]，1993 年Kuwana[3]首次采用電子顯微鏡觀察到了雞PGCs 細胞。雞PGCs 在光學顯微鏡下一般呈現出飽滿的圓形，細胞膜呈現清晰的邊緣，可以看到細胞質中的糖原顆粒和細胞核[4]（圖1）。

圖1 顯微鏡下觀察到的雞PGCs 細胞形態

雞PGCs 的形成比哺乳動物更早。雞胚胎的發育階段主要采用HH（Hamburger Hamilton stages）方法來描述，這種方法將孵化第0～21 天胚胎發育劃分為HH 1～46 時期[6]。Tsunekawa 等[7]采用PGCs 標記蛋白（CVH），證明最早在HH 2～3 階段存在40～60 個PGCs，同時證明了PGCs 中一個被稱為種質（germplasm）的結構，不僅可以傳遞遺傳物質，還可以被定位于精子細胞和卵母細胞，說明PGCs 可以在世代間傳遞遺傳信息。

雞PGCs 具有從血液遷移到生殖嵴的獨特特性。隨著胚胎發育，PGCs 逐漸從中心透明區域轉移到生殖新月[8,9]。在HH 12～14 階段，大部分PGCs 軸向集中于血管終竇，并通過前卵黃靜脈軸向轉運進入胚胎循環系統[10]。在HH 15～18 階段，PGCs 從血管進入生殖嵴區域。對于PGCs 遷移進入生殖嵴的過程，研究表明，卵黃前靜脈[10]、多種基因[11]和細胞因子[12]等在PGCs 正確進入生殖嵴的過程中發揮重要作用。在HH 26～28 階段，PGCs 在生殖嵴中定殖，被稱為性腺生殖細胞（Gonad germ cells，GGCs）。直到HH 35 開始，PGCs 逐漸分化為其他生殖相關細胞（包括精子和卵母細胞）。根據PGCs 在不同發育階段的特點，我們可以針對HH 2～3、HH 13～17 以及HH 26～35 的PGCs 進行分離和獲取，并在基因編輯后進行植入等相關操作（圖2）。

圖2 雞PGCs 的遷移特性 [13]

1.2 雞PGCs 作為基因編輯載體的優越性

將外源基因直接引入受精卵是一種常規且成熟的改變遺傳物質的方法，但在雞中存在諸多困難。在雞中，Love[14]、Kwon[15]等成功利用了一種與小鼠相似的方法[16]，通過病毒將外部DNA 引入受精卵，從而成功制備了生殖嵌合體雞。但由于鳥類難以單獨獲取胚胎，并且難以對位于蛋殼和卵黃膜之內的受精卵進行顯微操作，這種技術面臨挑戰。特別是雞胚的原核被充滿蛋黃的不透明細胞質所覆蓋，且膜上有大量的精子核[17,18]，使得顯微操作愈發困難。另外，由于引入的DNA 始終以游離的形式存在，即使利用流式細胞分選法（FACS）分選的胚盤細胞進行注射也避免不了DNA 在后代中降解[19]。所以直接向受精卵中注射外源DNA 不是一個好的可行方法。通過對精子進行基因編輯也是哺乳動物中一個常用的基因編輯方法，但在雞中沒有在附睪中成熟的過程，使得直接編輯精子的機會窗口大幅縮短[20]，同時存在體外受精困難、效率低等[21]問題，因此，對精子進行基因編輯同樣不適用于雞。

對PGCs 起源的研究表明，在雞胚胎早期（HH 1）[22]，胚層中已經存在50～100 個雞原始生殖細胞[23,24]。雞PGCs 中的種質（germplasm）區域可以在世代間傳遞遺傳物質[25]。此外，PGCs的獨特遷移能力也為其分離和體外培養提供了可能性。因此，雞PGCs 是進行基因編輯的理想材料，雞的基因編輯研究主要聚焦于PGCs。

1.3 PGC 的獲得和培養面臨的挑戰和解決方案

PGCs 的分離和培養過程充滿了挑戰。在體內自然分離所得的PGCs 數量相對較少。在單個胚胎的HH 1 時期，PGCs 的只有50～100 個。從孵化4.5d 的雞胚中分離出的生殖嵴PGCs 數量只在2000～5000 個。PGCs 對于滲透壓、生長因子和培養基成分等環境條件非常敏感[26,27]，難以大量長期培養。血管中的PGCs 是非黏附的，造成了分離PGCs 困難。雌雄PGCs 所需的滲透壓和營養物質不同[28-30]，當移植的PGCs 與受體雞的性別不一致時，種系嵌合體的成功率可能會降低[31]，這些因素給PGCs 分離培養和后續基因編輯造成了困難。PGCs 分離方法主要有3 種：①從HH 1時期胚盤中分離；②從第2.5～3 天胚胎血液中分離；③從第5.5～6 天胚胎生殖嵴中分離。

1.3.1 HH1 時期胚盤中PGCs 的分離

由于一個HH 1 時期的雞胚只含有50～100個PGCs，當前的主流方法并不對這一早期胚胎的PGCs 進行分離。在早期研究中，研究人員利用HH 1 期PGCs 制作嵌合體。Petitte 等[32]將未分期胚胎的中心區域的胚盤細胞團塊轉移到胚盤的中心區域，產生了體細胞嵌合體公雞，首次證明了轉移的PGCs 在受體雞中能產生功能性精子。

1.3.2 循環系統中PGCs 的分離

在禽類胚胎中，PGCs 利用血液循環系統向生殖嵴遷移，HH 12～17 期胚胎成為從血液中采集PGCs 的理想窗口期。Tajima 等[33]研究表明，HH 14 時循環系統中PGCs 濃度達到峰值，是采集血液的最佳時期。PGCs 的分離純化方法經過多次改進已發展出了多種方法。第1 類為梯度密度離心法：Yasuda 等[34]通過Ficoll 密度梯度離心法成功將血液PGCs 從0.048%提高到3.9%，利用該技術生產的種系嵌合體雞的平均種系傳遞效率達到4.3%。Zhao 等[35]利用Nycodenz 梯度密度離心將PGCs 的濃度提高到70%以上。第2 類為基于抗原抗體反應的磁珠分選法：Ono 等[36]利用雞PGC 標記蛋白QCR1（ubiquinol-cytochrome c reductase core protein 1）的單克隆抗體建立了免疫磁珠分選（MACS）。Mozdziak 等[37]采 用SSEA-1 抗體通過流式細胞分選法（FACS）將PGCs 濃度提高到92%。第3 類方法為去除血液中的紅細胞進而增加PGCs 的濃度：Yamamoto等[38]建立了一種使用氯化銨鉀緩沖液裂解紅細胞的試驗方法，使全血PGCs 的回收率達到90.3%。除以上3 種方法外，Jung 等[39]利用血液中PGCs的直徑大于其他細胞這一特點，開發了Transwell介導的大小依賴性分離方法，使PGCs 的分離變得更加方便和快速。

1.3.3 生殖嵴中PGCs 的分離

生殖嵴中的PGCs 數量相比其他時期更多，且分離更加簡單，因此也是運用的較為廣泛的一種分離方法。生殖嵴中的PGCs 雖然已經過了遷移階段，但仍然具有重新遷移和發育為配子的能力[40]。Kim 等[41]通過SSEA-1 抗體采用MACS 方法純化生殖嵴PGC 后將其移植到X 期胚胎的皮下腔中，成功培育種系嵌合體雞。同樣，Mozdziak 等[42]采用QCR1 抗體通過FACS 純化生殖嵴PGC，并成功移植到17 期胚胎血液中培育出了種系嵌合體雞。Nakajima 等[43]開發了一個方便、快捷的方法，從孵化7d 的胚胎中采集的發育中的性腺在37.8℃的無Ca2+和Mg2+磷酸鹽緩沖鹽水中培養90min 后，PGCs 會從性腺中排出，純度約為50%。

1.3.4 體外PGCs 的長期培養

研究人員對PGCs 的發育機制和體外培養進行了深入研究，并已經實現了較長時間的培養，為進一步的基因編輯提供了細胞材料。雖然哺乳動物和雞的PGCs 形成機制有差異，但脊椎動物（哺乳動物和雞）中控制PGCs 自我更新、生長和分化的機制相似，因此，許多常見的多能性因子和蛋白（DDX4、DND、PRDM1、OCT4、NANOG和SOX2）可以維持雞PGCs 的多能性和發育。

哺乳動物PGCs 只能在敲除特定基因并且添加生長因子如BMP4、LIF、SCF 和視黃酸等條件下培養較短的時間，而雞的PGCs 可以培養較長的時間并維持分化能力和種質特性。Lavoir 等[44]成功分離了雞生殖嵴PGCs，并證明了PGCs經過209d 的培養后進行基因修飾后仍然具有干性和分化為配子的能力。后續研究在提高PGCs培養的數量和質量上取得了許多新的突破：Whyte 等[26]系統研究了PGCs 的培養基，為雞PGCs 的培養提供了重要的理論基礎和實踐指導；Collarini 等[5]建立了PGCs 分離建系長期培養的體系；Ezaki 等[4]在PGCs 中添加了包括Blebbistatin 在內的3 種小分子穩定劑，使用Blebbistatin可以在10d 內從250 個細胞中誘導出4.21×105個細胞，使用H-1152 則誘導出2.68×105個細胞，使用Z-VAD誘導出2.50×105個細胞，該方法長期（177d）培養的PGC 獲得的后代雞的效率也很高（93%）。

然而，目前PGCs 培養的雌雄差異問題還需要進一步探究。雌雄PGCs 所需的培養條件不同，產出后代雞的能力也存在差異。Whyte 等[26]指出了雌雄PGC 所需滲透壓不同；Ichikawa 等[29]發現，雌雄PGCs 具有不同的RNA 表達。事實上，雄性PGCs 培養為細胞系的概率在10%～22%[45,46]，而雌性PGCs 培養成為細胞系的概率則低得多。PGCs 的性別和受體雞的性別不同也會造成種系嵌合體成功率降低[31]。因此，雌雄PGCs 的差異培養問題是一個有趣的方向，弄清楚PGCs 之間的差異問題有助于進一步提高基因編輯的效率。

2 基因編輯在PGCs 中的應用

2.1 早期基因編輯工具在PGCs 上的嘗試

高效的基因編輯工具是生產基因編輯雞的先決條件。在最開始的嘗試中，Schusser 等[46]在PGCs 中利用同源重組首次靶向敲除了Ig 重鏈，成功培育出基因修飾雞。但PGCs 基因組中的同源重組效率極低（約0.1%），且該方法取決于模板基因的同源性[47]，因此限制了其應用。

2.1.1 鋅指核酸酶和轉錄激活因子樣效應物核酸酶技術在PGCs 上的應用

隨著對DNA 酶理解的不斷加深，先后出現了鋅指核酸酶（Zinc finger nucleases，ZFNs）和轉錄激活因子樣效應物核酸酶（Transcription activator-like effector nucleases，TALENs）等精確基因編輯工具。這2 類工具主要由特異性DNA 結合模塊與DNA 核酸酶構成，它們通過DNA 斷裂誘導基因組修復，通過非同源末端連接（NHEJ）或同源定向修復（HDR）使得目的片段連入基因組中。Fan 等[48]測試了ZFNs 技術在雞中具有較高的活性。2014 年首次有報道指出，TALENs 成功介導的雞靶向卵清蛋白缺失，PGCs 的基因組缺失效率高達33.3%，種系傳遞效率在22.3%～53.2%[49]。相比于同源重組技術，TALEN 技術在雞中的成功應用大幅提高了基因編輯效率。

2.1.2 CRISPR/Cas9 技術在PGCs 上的應用

自CRISPR/Cas9 技術問世以來，它憑借其高效和簡潔，為各種生物研究帶來了革命性的突破和改變。利用此技術能在幾乎任何生物體中引導特定靶DNA 序列的切割，再通過NHEJ 或HDR進行修復，實現精確基因編輯[50,51]，且更簡單更快速[13,52]。PGCs 介導的種系傳播系統的成功應用為CRISPR/Cas9 技術的有效應用奠定了必要的理論基礎和操作基礎，同時，雞中系統性基因組轉錄起始位點的深入研究也為基因編輯技術在雞中的應用提供了有力支撐[53]。

CRISPR/Cas9 技術的應用大大加快了家禽產業化和醫學科研等領域的速度。在家禽業中CRISPR/Cas9 技術可以改良現有性狀產生經濟價值。Dimitrov 等[54]利用PGCs 成功對雞蛋中的主要過敏原卵清蛋白（OV）和卵粘蛋白（OVM）進行敲除，與傳統的同源重組相比，采用CRISPR/Cas9 技術的重組效率顯著提高至9%。肌肉質量在家禽產業中是一個重要的經濟性狀，先后有研究編輯出了通過靶向控制組織生長發育的肌肉生長抑制素（MSTN）基因和調節脂肪沉積的G0/G1 開關基因（G0S2）生產具有更好肌肉質量的雞[55,56]。禽類疾病控制和預防是家禽業可持續發展的必要先決條件，多數疫苗對禽白血病毒沒有效果，而采用CRISPR/Cas9 技術產生的ALV-J 抗性雞阻斷和干擾了禽白血病毒的傳播[57]；在醫學領域，雞蛋中有大量的優質蛋白，是一個理想的生物反應系統[58]。人類干擾素β（hIFN-β）可以整合到蛋清中用于生產hIFN-β 的雞卵清蛋白位點中[59]。在免疫學研究領域，為了探究內源性IFAR1 對免疫系統的影響，研究人員成功利用Cas9-HF1 技術制備了干擾素α 和β 受體亞基（IFAR1）敲除的雞，為研究免疫系統提供了有力支持[60]。

2.1.3 基因編輯工具轉染雞PGCs 的挑戰

將基因編輯工具成功引入雞PGCs 中仍面臨諸多挑戰，這主要是由于雞細胞與哺乳細胞在脂質[61]和親水特性[62]等方面的差異，盡管如此，研究者已嘗試了多種轉染方法。Lavoir 等[44]最早使用電穿孔的方法進行轉染，而Shin 等[63]則采用了慢病毒轉染。后來Tyack 等[64]采用脂質體轉染的方法（Lipofectamine 2000）進行轉染，但這種方法的轉染效率僅為23.4%以下[65]，Jiang 等[66]采用病毒轉染，效率達到了50.0%～66.7%。為了進一步優化，Park 等[67]在雞PGCs 上利用piggyBac 轉座子系統，提高了轉染的效率和有效性。Schusser 等[46]采用同源重組介導的CRISPR/Cas9 技術顯著提高了基因編輯后的精確性和有效性。

2.2 生殖器官嵌合體的生產

在完成PGCs 的基因編輯后，需要選取合適的受體雞進行移植。為了使受體雞更好地接受編輯過的PGCs，需要盡可能減少其自身的PGCs 數量。最早的實驗中采用白消安產生不育雞，消除了大部分受體雞本身的PGCs[68]。Nakamura 等[69]研究證明，向經白消安處理的不育雞注射供體PGCs 后，其供體PGC 的占比（98.6%）明顯超過對照組（6.4%）。此外，使HH 1 時期胚盤暴露于60 Co 源產生的500～700 rads 伽馬輻射也可得到不育雞。Trefil 等[70]通過該方法產生的不育雞，經過移植生殖細胞，約有50%的不育雞得以恢復，這證明了伽馬輻射的有效性。Taylor 等[72]通過TALENs 方法成功敲除DDX4 位點，使得PGC無法形成，最終產生成年雌性不育雞。Ballantyne等[71]采用iCaspase-9 技術成功制造純種不育雞，徹底消除了內源PGCs 對基因編輯后代雞的干擾，為基因編輯雞的發展奠定了重要基礎。

當受體雞準備好后，選擇恰當的時機對其注入已編輯的PGCs 至關重要。根據PGCs 在雞中的發育遷移特點，現有大多數研究一般選擇在胚胎早期階段（HH 14～16）進行注射。通常在雞胚背主動脈進行注射，優點是入侵性較小，但并非所有的PGCs 都能到達性腺[28]。也有研究直接將編輯后的PGCs 直接注射到生殖嵴中以生產生殖嵌合體[72]。盡管這種方法可能提高PGCs 的穩定定植率（6%），但其侵入性較高，技術要求也更為嚴格。

在PGCs 注入受體雞后，選擇正確的孵化方法變得尤為關鍵。隨著技術的不斷演進，孵化方法也經歷了諸多創新。如Lavoir 等[44]選擇先將雞胚倒出進行操作，完成后使用塑料膜封住蛋殼。早在1987 年，Perry 等[73]和Rowlett 等[74]對代孕孵化系統進行了研究，試圖通過模擬雞蛋外殼結構來孵化雞胚，但為每一個雞蛋提供定制的蛋殼結構費時費力。Kamihira 等[75]采用了人工容器對雞胚進行孵化，并報道了使用聚四氟乙烯作為胚胎培養系統。而Tahara 和Obara 等[76]則使用了食品包裝材料——聚甲基戊烯膜作為孵化容器。最近的研究還發現，在無蛋殼的孵化系統中添加鈣離子孵化率由19.4%提高到了48.9%，顯著提高孵化效率[77]。

2.3 雞PGCs 基因編輯展望

雞PGCs 和基因編輯技術仍存在若干問題，需進一步研究和解決，但其應用具有廣闊的前景。用基因編輯制作雞蛋殼腺生物反應器，生產藥用蛋白或人源抗體，對人類疾病治療和疫苗開發具有深遠影響。雞PGCs 介導的基因編輯在應對禽類疾病也具有重要潛在應用價值，有研究在禽肉瘤和白血病病毒（ASLV）方面已經取得了顯著突破[78]。最新的研究表明，使用CRISPR/Cas9 系統編輯宿主蛋白ANP32A 可以阻止禽流感病毒在雞體內的復制。我們可以通過遺傳手段預防和控制禽類的多種傳染病，為養殖業帶來更大的經濟效益。在種質資源保護方面，使用基因組編輯技術使其不育的雌性雞用作移植冷凍保存生殖細胞的替代宿主，并且只產下移植的稀有雞品種的雞蛋[79]，這為稀有雞品種的保存和繁殖提供了新的途徑，確保了種質資源的長期維護。總之，雞的PGCs和基因編輯技術為禽業、醫藥和種質資源保護等領域帶來了新的機遇，值得進一步研究和探索。