Circ-DDX5靶向miR-3940抑制人乳腺癌細胞系的增殖和侵襲

李江麗，孫 靜，唐一君，郭君蘭，陳 博，郭勝男

1.河南科技大學附屬安陽市腫瘤醫院 腫瘤內科，河南 安陽 455000；2.南方醫科大學附屬廣東省人民醫院 腫瘤科，廣東 廣州 519041

乳腺癌是一種起源于乳腺上皮細胞的惡性腫瘤,根治性手術是乳腺癌治療最有效的治療方式[1-2]。由于乳腺癌早期癥狀不顯著、缺乏有效生物標志物和特異性治療靶點等原因,多數乳腺癌患者的預后較差[3-4]。因此,探索乳腺癌發病機制以及尋找分子標志物和治療靶點至關重要。環狀RNA(circular RNA,circRNA)是一種呈閉合結構的RNA,由轉錄后的mRNA反向剪切而成[5]。CircRNA被證實廣泛參與細胞的各種生理以及病理過程,在疾病的發生、進展過程中起到關鍵作用[6]。大量研究發現,胰腺癌、淋巴瘤、骨肉瘤、乳腺癌等惡性腫瘤中均存在circRNA的高表達或低表達[7-8]。CircRNA通過靶向結合微小RNA(microRNA,miRNA)調節腫瘤細胞的增殖、血行轉移、化療敏感性等,影響腫瘤的病理分期和患者預后[9]。HGNC數據庫顯示,circ-DDX5定位在人染色體17q23.3,其由第1、2、3號外顯子反向剪切形成,其長度為203個核苷酸。Circ-DDX5在腫瘤特別是乳腺癌中的表達、功能及相關機制并不清楚。本研究旨在探索circ-DDX5在乳腺癌組織中表達水平及其與乳腺癌患者臨床分期的相關性,分析circ-DDX5是否通過靶向miR-3940影響乳腺癌細胞系的增殖和侵襲,以期為乳腺癌的診療提供新的分子標志物和治療靶點。

1 材料與方法

1.1 細胞和試劑

人乳腺癌細胞系SK-BR-3、MDA-MB-231、BT-549、MCF-7、HCC-1937和永生化乳腺上皮細胞系MCF-10A(中國科學院細胞資源中心)。Lipofectamine 3000、RPMI 1640培養基(Invitrogen公司);DMEM培養基和胎牛血清(FBS)(Roche公司);Transwell小室、CCK-8試劑盒(Corning公司);SYBR Green試劑盒、Matrigel基質膠(Dojindo公司);Circ-DDX5過表達質粒、陰性對照質粒(上海吉瑪制藥技術有限公司)。雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒、TRIzol試劑盒(Promega公司);野生型質粒circ-DDX5 WT、突變型質粒circ-DDX5 MUT、NC mimic(CUCGGG CCAUCCCAGCCCACUU)和miR-3940 mimic(上海碧云天生物技術公司);一抗兔源cyclin C、CDK3、Snail、vimentin和β-actin(BD公司)。

1.2 方法

1.2.1 生物信息學分析:通過TCGA數據庫分析circ-DDX5在乳腺癌組織中的表達及circ-DDX5表達水平與乳腺癌患者臨床分期的關系。通過生物信息學在線網站CSCD預測circ-DDX5和miR-3940之間的互補結合位點。

1.2.2 細胞的分組及處理:將SK-BR-3、MDA-MB-231、BT-549、MCF-7、HCC-1937細胞置于RPMI 1640培養基(含10% FBS),MCF-10A細胞置于DMEM培養基(含10% FBS),培養條件為37 ℃、5% CO2。轉染前8 h,將MDA-MB-231細胞接種于12孔板,保證轉染時MDA-MB-231細胞匯合度達60%。MDA-MB-231細胞的分組和轉染:Circ-DDX5組(轉染circ-DDX5過表達質粒)和NC組(轉染陰性對照質粒)。通過Lipofectamine 3000轉染試劑將質粒轉染至MDA-MB-231細胞,收集對數增殖期的MDA-MB-231細胞進行后續研究。

1.2.3 RT-qPCR檢測細胞circ-DDX5、miR-3940表達:用TRIzol試劑抽提細胞總RNA,驗證純度以及濃度后反轉錄為cDNA。根據SYBR Green試劑盒說明書設定RT-qPCR反應條件:96 ℃ 7 min;96 ℃ 11 s,52 ℃ 29 s,71 ℃ 29 s,共31個循環。Circ-DDX5、miR-3940相對表達量通過2-ΔΔCt法計算。Circ-DDX5正向引物:5′-CCCAAGTTGCTTCAGTT GGT-3′,反向引物:5′-TGTGCCTGTTTTGGTACTGC-3′;U6正向引物:5′-TTATGGGTCCTAGCCTGAC-3′, 反向引物:5′-CACTATTGCGGGTCTGC-3′;miR-3940正向引物:5′-CTCAAGGACCACCGCATC-3′, 反向引物:5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′;GAPDH正向引物:5′-CCCCGGTTTCTATAAATTGAGC-3′, 反向引物:5′-CACCTTCCCCATGGTGTCT-3′。

1.2.4 集落形成實驗檢測MDA-MB-231細胞增殖:收集NC組和circ-DDX5組處于對數增殖期的MDA-MB-231細胞,以4×103個/孔接種在6孔板,每組均為4個復孔。培養至8 d,加入1 mL甲醛溶液,固定1 h。再加入1 mL結晶紫溶液,染色1 h。用流水洗滌,干燥后在肉眼下觀察、計數每孔的集落形成數并拍照。

1.2.5 Transwell小室法檢測各組MDA-MB-231細胞侵襲:在Transwell上室加入45 μL基質膠,在培養箱內固定。收集NC組和circ-DDX5組處于對數增殖期的MDA-MB-231細胞,以195 μL細胞懸液(4×104個細胞)加入Transwell上室。加入705 μL含16%FBS培養基到下室,連續培養24 h。手持棉簽輕柔擦掉上室細胞,加入1 mL甲醛溶液,固定1 h。再加入1 mL結晶紫溶液,染色1 h。在倒置顯微鏡下,每組隨機選6個視野拍照并計數侵襲細胞。

1.2.6 雙熒光素酶報告基因實驗檢測circ-DDX5和miR-3940的靶向關系:野生型質粒circ-DDX5 WT含有circ-DDX5和miR-3940的互補結合序列,突變型質粒含有互補序列的突變序列。通過Lipofectamine 3000轉染試劑分別將報告基因質粒circ-DDX5 WT、circ-DDX5 MUT與NC mimic或miR-3940 mimic共轉染至MDA-MB-231細胞。連續培養48 h,消化細胞,通過雙熒光素酶報告基因實驗試劑盒各組MDA-MB-231細胞的熒光素酶活性。

1.2.7 Western blot實驗檢測MDA-MB-231細胞增殖表型蛋白和侵襲表型蛋白表達:收集NC組和circ-DDX5組處于對數增殖期的MDA-MB-231細胞,加入200 μL蛋白裂解液,繼續孵育1 h。采用電泳分離蛋白,隨后在低溫下轉膜,用脫脂牛奶進行固定。分別加入一抗cyclin C(1∶3 000)、CDK3(1∶3 000稀釋)、β-actin(1∶4 000)、Snail(1∶1 000稀釋)、vimentin(1∶2 000稀釋),在低溫下孵育11 h。隨后加入二抗(1∶7 000稀釋),在室溫下孵育3 h。用ECL試劑進行染色,在凝膠成像儀中觀察條帶并拍照。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 乳腺癌組織中circ-DDX5的表達及其與miR-3940表達的相關性

Circ-DDX5由第1、2、3號外顯子首尾相接組成。TCGA數據庫顯示,circ-DDX5在乳腺癌組織中表達為3.86±1.06明顯低于癌旁組織的6.77±1.57(P<0.01);Circ-DDX5表達水平與乳腺癌患者的臨床分期呈負相關(P<0.01)(圖1);Circ-DDX5在乳腺癌組織中表達水平與miR-3940表達水平呈現明顯負相關(r=-0.78,P<0.01)(圖2)。

圖1 Circ-DDX5表達水平與乳腺癌患者臨床分期的關系Fig 1 Relationship between the expression level of circ-DDX5 and the clinical stage of patients with breast cancer

圖2 乳腺癌組織中circ-DDX5與miR-3940表達的相關性Fig 2 Correlation between circ-DDX5 and miR-3940 expression in breast cancer tissues

2.2 乳腺癌細胞系中circ-DDX5呈低表達

與MCF-10A細胞比較,SK-BR-3、MDA-MB-231、BT-549、MCF-7、HCC-1937細胞中circ-DDX5呈低表達(P<0.05),MDA-MB-231細胞中circ-DDX5表達較其他乳腺癌細胞系更低,因而選取MDA-MB-231細胞行后續實驗(圖3)。

*P<0.05,**P<0.01 compared with MCF-10A cells.圖3 Circ-DDX5在乳腺癌細胞系中的表達Fig 3 Expression of circ-DDX5 in breast cancer

2.3 Circ-DDX5過表達質粒上調MDA-MB-231細胞中circ-DDX5表達

Circ-DDX5組和NC組MDA-MB-231細胞circ-DDX5表達分別為(9.57±1.25)和(1.04±0.37),與NC組相比,circ-DDX5組MDA-MB-231細胞circ-DDX5表達水平明顯增加(P<0.01)。

2.4 過表達circ-DDX5抑制MDA-MB-231細胞增殖

Circ-DDX5組和NC組集落形成數分別為(43±11)個和(101±10)個,與NC組相比,circ-DDX5組MDA-MB-231細胞增殖能力下降(P<0.01)(圖4)。

*P<0.05 compared with NC.圖4 過表達circ-DDX5對MDA-MB-231細胞對集落形成的影響Fig 4 Effect of over-expression of circ-DDX5 on the colong-forming of MDA-MB-231 n=4)

2.5 過表達circ-DDX5抑制MDA-MB-231細胞侵襲

Circ-DDX5組和NC組侵襲細胞數分別為(20.91±6.66)個和(85.97±14.83)個,與NC組相比,circ-DDX5組MDA-MB-231細胞侵襲能力下降(P<0.01)(圖5)。

*P<0.05 compared with NC.圖5 過表達circ-DDX5使MDA-MB-231細胞侵襲能力下降Fig 5 Effect of over-expression of circ-DDX5 on the invasion of MDA-MB-231 n=6)

2.6 Circ-DDX5與miR-3940之間存在靶向關系

生物信息學分析網站CSCD預測顯示,miR-3940與circ-DDX5存在互補結合位點(圖6)。雙熒光素酶報告基因實驗顯示, 與NC mimic+circ-DDX5 WT組相比,circ-DDX5 WT+ miR-3940組MDA-MB-231細胞熒光素酶活性明顯降低(P<0.01)(圖7)。

*P<0.01 compared with NC mimic+circ-DDX5 WT.圖6 circ-DDX5與miR-3940之間的結合位點Fig 6 Binding site between circ-DDX5 and miR-3940

*P<0.01 compared with NC mimic+circ-DDX5 WT.圖7 雙熒光素酶報告基因實驗驗證circ-DDX5與miR-3940的靶向結合Fig 7 Dual-luciferase reporter gene assays verified the targeted binding of circ-DDX5 to miR-3940

2.7 過表達circ-DDX5抑制miR-3940表達

Circ-DDX5組和NC組MDA-MB-231細胞中miR-3940表達分別為(1.01±0.21)和(5.84±0.88),與NC組相比,circ-DDX5組MDA-MB-231細胞miR-3940表達明顯降低(P<0.01)。

2.8 過表達circ-DDX5抑制MDA-MB-231細胞增殖表型蛋白和侵襲表型蛋白表達

與NC組相比,過表達circ-DDX5的MDA-MB-231細胞中增殖表型蛋白(cyclin C、CDK3)和侵襲表型蛋白(Snail、vimentin)表達均明顯下降(P<0.01)(圖8)。

A.Western blot band; B.quantitative analysis of protein expression; *P<0.01 compared with NC.圖8 過表達circ-DDX5抑制MDA-MB-231細胞增殖表型蛋白和侵襲表型蛋白表達的影響Fig 8 Effect of over-expression of circ-DDX5 inhibiting the expression of proliferation phenotype proteins and invasion phenotype proteins in MDA-MB-231 n=3)

3 討論

CircRNA是一種無蛋白編碼能力的環形RNA,參與染色質修飾、基因轉錄等生物過程,調節細胞的代謝、免疫應答、凋亡等活動[10]。近年來,circRNA在乳腺癌發生、進展中的功能已成為乳腺癌研究的熱點[7-8]。例如,circ-KDM4B在乳腺癌組織中表達降低,過表達circ-KDM4B在體外和體內均抑制乳腺癌細胞遷移和侵襲,同時在體內抑制血管生成[11]。例如,在乳腺癌組織組織和細胞中circ-RPPH1表達上調,敲低circ-RPPH1通過上調miR-542-3p表達抑制乳腺癌細胞的增殖和轉移,促進細胞凋亡[12]。例如,circ-KLHL24在乳腺癌組織和細胞中呈低表達,上調circ-KLHL24能夠阻斷乳腺癌細胞活力、集落形成、遷移、侵襲和糖酵解進程,miR-1204是circ-KLHL24在乳腺癌細胞中的靶基因[13]。目前, circ-DDX5在乳腺癌中的表達及作用機制尚不清楚。

本實驗發現,circ-DDX5在乳腺癌組織中異常低表達,并且circ-DDX5表達水平與乳腺癌患者的臨床分期呈負相關。同時,SK-BR-3、MDA-MB-231、BT-549、MCF-7、HCC-1937細胞中circ-DDX5的表達水平均明顯低于正常乳腺上皮MCF-10A細胞,提示circ-DDX5的功能可能類似一個抑癌基因。本研究通過體外轉染實驗表明,過表達circ-DDX5后MDA-MB-231細胞增殖和侵襲能力均明顯降低, 值得注意的是MDA-MB-231細胞增殖表型蛋白cyclin C、CDK3以及侵襲表型蛋白Snail、vimentin表達均明顯下降,證實circ-DDX5類似一個抑癌基因。越來越多的研究表明,circRNA在細胞內可直接互補結合miRNA,通過調控miRNA的表達影響惡性腫瘤細胞的生物學行為[14]。生物信息學分析網站CSCD預測顯示,miR-3940與circ-DDX5存在互補結合位點。miR-3940在乳腺癌組織中表達顯著高于癌旁組織,并且miR-3940高表達與乳腺癌患者預后不良有關,敲低miR-3940能夠抑制乳腺癌MDA-MB-231細胞和BT-549細胞的增殖、遷移和侵襲[15]。雙熒光素酶報告基因實驗證實miR-3940與circ-DDX5存在直接靶向關系。體外轉染實驗顯示,過表達circ-DDX5可使MDA-MB-231細胞中miR-3940表達水平降低。值得注意的是,乳腺癌組織中miR-3940與circ-DDX5的表達呈明顯負相關。以上研究證實,circ-DDX5通過靶向miR-3940發揮作用。

綜上所述,circ-DDX5在乳腺癌組織和細胞中呈低水平表達,其表達水平與乳腺癌患者臨床分期相關,circ-DDX5通過靶向抑制miR-3940表達降低乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖和侵襲,circ-DDX5有望成為乳腺癌診斷標志物和治療靶標。