ATF6調控生殖相關基因HSPA1L表達的分子機制

汪媛媛，朱席琳，伍曉盼，劉 英

中國醫學科學院基礎醫學研究所 北京協和醫學院基礎學院 生物化學與分子生物學系，北京 100005

男性不育是臨床上常見的復雜疾病,多種因素都可能導致不育。當雄性生殖器官發育不良或生殖細胞發生障礙時,即可失去原有的正常生殖功能,造成不育[1]。活化轉錄因子6 (activating transcription factor 6, ATF6)在內質網應激(endoplasmic reticulum stress, ERS)期間激活未折疊蛋白反應(unfolded protein response, UPR)的靶基因。它通過順式作用的內質網應激反應元件作為核轉錄因子發揮作用,該元件存在于編碼ER伴侶的基因的啟動子中。內質網應激會對睪丸和精子造成損害,導致不育[2]。

大多數熱休克蛋白廣泛表達并物種高度保守,嚴格表達對高熱、炎性反應和感染等壓力的反應[3]。熱應激對睪丸最相關的后果是精子發生異常[4]。熱休克蛋白A1樣蛋白(heat shock protein family A member 1 like, HSPA1L)在睪丸中高度表達,頂體后段和精子中段是其主要表達部位[5]。有研究表明,HSPA1L在低運動精子中的表達顯著下降,抑制HSPA1L可影響精子的形態和活力[6]。

本研究針對ERS過程的關鍵分子ATF6,探索ATF6調控生殖相關基因HSPA1L的分子機制。研究結果表明,ATF6 能結合生殖相關基因HSPA1L的啟動子進而調控HSPA1L的表達。這有可能為預防或治療與ERS有關的男性不育的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系與質粒載體:人胚腎細胞系HEK-293T(中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞資源中心);ATF6過表達質粒載體為p3×-FLAG-CMV-14真核表達載體,TEX35 700、TSSK3 700、OAZ3 700、HSPA1L 700、SPATC1 700、HSPA1L 50啟動子質粒的載體為pGL3-Basic,均由上海捷瑞生物工程有限公司構建。

1.1.2 主要試劑:DMEM培養基,胎牛血清FBS,非必需氨基酸NEAA(Gibco公司);Lipofectamine 3000轉染試劑盒(Invitrogen公司);雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(Promega公司);超純RNA提取試劑盒,RIPA Lysis Buffer(北京康為世紀生物科技有限公司);反轉錄試劑盒(東洋紡生物科技有限公司);RT-qPCR引物(天一輝遠生物科技有限公司);抗ATF6抗體,抗HSPA1L抗體(Proteintech公司);抗GAPDH抗體(Affinity公司);山羊抗兔二抗(中杉金橋生物技術公司);細胞核/質蛋白質抽提試劑盒(愛必信生物科技有限公司);化學發光法EMSA試劑盒(上海碧云天生物技術公司);凝膠遷移或電泳遷移率實驗(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)探針(上海生工生物工程有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞的培養與轉染:細胞培養使用含10% FBS的DMEM培養基+1%NEAA,在恒溫37 ℃,5% CO2的培養箱中培養。取對數增殖期的HEK-293T細胞接種至24孔板,細胞匯合度70%時進行細胞轉染,使用Lipofectamine 3000試劑按照說明書進行瞬時轉染,將HEK-293T細胞分為對照組(轉染空載對照質粒)和實驗組(轉染ATF6過表達質粒)。轉染48 h后進行后續實驗。

1.2.2 篩選ATF6下游生殖相關基因:取4周齡的雄性ATF6敲除小鼠和雄性野生型小鼠的睪丸組織,提取RNA,進行轉錄物組測序。轉錄物組測序由實驗室前期研究完成。根據測序結果篩選受ATF6正向調控的生殖相關基因。

1.2.3 雙熒光素酶報告基因實驗(dual luciferase reporter gene assay):將HEK-293T細胞與SV40,Flag-ATF6,空載體和生殖相關基因的啟動子質粒在24孔板中瞬時共轉染。48 h后,使用雙熒光素酶報告檢測系統和Promega GloMAX 96微孔板發光儀分析熒光素酶活性。

1.2.4 生物信息學分析:使用在線網站Gene-Regulation ALiBaba2.1(http://www.gene-regulation.com)對目的生殖相關基因啟動子結合的轉錄因子及其結合位點進行預測分析。

1.2.5 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測RNA表達:采用Trizol法提取細胞總RNA,根據反轉錄試劑盒說明書反轉錄RNA為cDNA。 按照試劑盒說明書進行擴增,以GAPDH為內參檢測ATF6和HSPA1LmRNA的相對表達。本實驗所需引物如下:ATF6上游引物 5′-CCCAAGACTCAAACAAACT C-3′,下游引物 5′-GTGATTAGGGAGCTGTGTGA-3′;HSPA1L上游引物 5′-TTACCGTGCCAGCCTATTTCA-3′,下游引物 5′-AGCACATTAAGTCCAGCAATCA-3′;GAPDH上游引物 5′-TCTGACTTCAACAGCGACAC-3′,下游引物 5′-CAAATTCGTTGTCATACCAG-3′。

1.2.6 蛋白免疫印跡實驗(Western blot)檢測蛋白質表達:使用帶有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液提取蛋白質。蛋白質樣品用10% SDS-PAGE,然后采用濕轉法轉至PVDF膜上,并在室溫下封閉在5%脫脂奶粉中2 h。之后,將膜與一抗(稀釋比均為1∶1 000)在4 ℃下孵育過夜。第2天與HRP偶聯的二抗(稀釋比1∶10 000)進一步孵育2 h。使用ECL法曝光顯影,檢測ATF6和HSPA1L蛋白的表達。

1.2.7 凝膠遷移實驗(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)檢測蛋白質與DNA的結合:提取細胞核蛋白質,根據1.2.4預測的結合序列設計相關EMSA探針。本實驗所用探針如下:生物素標記的探針:HSPA1L啟動子探針5′-biotin-TATAAGTCGTC ACGGAGACCCGCCTTTTCCCTT-3′,互補探針5′-biotin-AAGGGAAAAGGCGGGTCTCCGTGACGACTTATA-3′;未標記的探針:HSPA1L啟動子冷競爭探針5′-TATA AGTCGTCACGGAGACCCGCCTTTTCCCTT-3′,互補探針 5′-AAGGGAAAAGGCGGGTCTCCGTGACGACT TATA-3′;突變的HSPA1L啟動子冷競爭探針5′-TATAACGGAGACCCGCCTTTTCCCTT-3′,互補探針 5′-AAGGGAAAAGGCGGGTCTCCGTTATA-3′。將探針與互補探針1∶1混勻,生物素標記的探針終濃度為100 nmol/L,未標記的探針終濃度為10 μmol/L,100 ℃退火形成雙鏈探針,自然冷卻。將蛋白質與探針混合制樣,樣品在0.5×TBE中用4%的聚丙烯酰胺凝膠電泳,然后采用濕轉法轉至尼龍膜上,0.5×TBE作為轉膜液,380 mA,轉膜45 min。紫外交聯儀選擇在254 nm紫外波長處,120 mJ/cm2,交聯50 s。 封閉洗滌后,采用化學發光法檢測蛋白質與DNA的結合。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 ATF6過表達效率驗證

HEK-293T細胞轉染ATF6過表達質粒后,ATF6的mRNA表達水平顯著升高(P<0.001)(圖1A)。孵育ATF6抗體,與對照組的內源性ATF6相比,ATF6蛋白表達量也明顯升高(P<0.05)(圖1B, C)。

Flag.p3×-FLAG-CMV-14; Flag-ATF6.p3×-FLAG-CMV-14-ATF6; A.real-time PCR analysis of the mRNA expression of ATF6 *P<0.05, **P<0.01 compared with Flag group.圖1 過表達ATF6后mRNA和蛋白表達水平的變化Fig 1 Changes in mRNA and protein expression after over-expression of n=3)

2.2 轉錄物組測序篩選出ATF6下游基因

根據本課題組前期轉錄物組測序結果(BioSample accession: SAMN18643078)[7],篩選出與精子發生功能相關的睪丸特異性表達基因。為進一步縮小篩選范圍,按照差異的顯著性小于0.05,選擇受ATF6正向調控的下游基因。最后,本研究選擇SPATC1、TEX35、TSSK3、OAZ3、HSPA1L作為候選基因。

2.3 雙熒光素酶報告基因實驗確定ATF6對HSPA1L啟動子活性促進最顯著

候選基因的啟動子熒光質粒由5′UTR序列和其上游的700 bp啟動子序列構成。其中啟動子活性較高的2個基因為TEX35和HSPA1L(圖2A)。 ATF6過表達顯著增強了TEX35(P<0.001)和HSPA1L(P<0.001)的啟動子熒光素酶活性,且ATF6對于HSPA1L啟動子的促進效果最為明顯(圖2B),最終確定HSPA1L為所研究的ATF6下游靶基因。

SPATC1.pSPATC1-700; TEX35.pTEX35-700; TSSK3.pTSSK3-700; OAZ3.pOAZ3-700; HSPA1L.pHSPA1L-700; Flag.p3×-Flag-CMV-14; Flag-ATF6.p3×-Flag-CMV-14-ATF6; A.dual-luciferase reporter assay analysis of the relative promoter activity of five different promoters B.HEK-293T cells were co-transfected with ATF6 plasmids and TEX35, HSPA1L promoters; Luciferase assays in indicated cells *P<0.001 compared with Flag group.圖2 雙熒光素酶報告基因實驗比較啟動子活性Fig 2 Comparison of promoter activity by dual luciferase reporter gene n=3)

2.4 預測ATF6結合HSPA1L啟動子的位點并檢測ATF6對截短啟動子活性的影響

Gene-Regulation ALiBaba2.1(http://www.gene-regulation.com)預測結果顯示,在HSPA1L700啟動子序列上與ATF結合位點的序列為aagtcgtcac(圖3A)。根據預測到的結合序列,構建包含結合位點及其前后各20 bp的啟動子50 bp質粒(圖3B)。過表達ATF6對截短的50 bp啟動子活性仍有顯著的促進作用(P<0.001)(圖3C)。

HSPA1L-50.pHSPA1L-50; Flag.p3×-Flag-CMV-14; Flag-ATF6.p3×-Flag-CMV-14-ATF6; A.the binding site of ATF to HSPA1L promoter; B.schematic diagram of HSPA1L 50 promoter plasmid; C.HEK-293T cells were co-transfected with ATF6 plasmids and truncated HSPA1L promoters; Luciferase assays in indicated cells; *P<0.001 compared with Flag group.圖3 確定ATF與HSPA1L啟動子的結合位點Fig 3 Determination of the binding site of ATF to HSPA1L n=3 )

2.5 過表達ATF6可使HSPA1L的表達上調

HEK-293T細胞轉染ATF6過表達質粒后,與對照組相比,實驗組HSPA1L的mRNA(P<0.001)(圖4A)和蛋白(P<0.05)表達均顯著增加(圖4B, C)。這與前述ATF6促進HSPA1L啟動子活性的趨勢相一致。

Flag.p3×-Flag-CMV-14; Flag-ATF6.p3×-Flag-CMV-14-ATF6; A.real-time PCR analysis of the mRNA expression of B.Western blot showed the protein expression of HSPA1L, ATF6; C.relative protein levels of HSPA1L and ATF6 detected by densitometry *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 compared with Flag group.圖4 過表達ATF6促進HSPA1L的mRNA和蛋白表達Fig 4 Over-expression of ATF6 promoted the mRNA and protein expression of n=3)

2.6 ATF6 蛋白與HSPA1L的啟動子DNA序列結合

ATF6與HSPA1L啟動子aagtcgtcac序列產生結合條帶,當加入冷競爭探針時結合條帶消失,而加入突變的冷競爭探針時出現結合條帶,證實了ATF6蛋白與HSPA1L啟動子DNA有相互作用(圖5)。

EMSA was used to detect the binding of ATF6 to HSPA1L promoter;wt.wild type; mut.mutant圖5 ATF6蛋白與HSPA1L的啟動子DNA序列相結合Fig 5 ATF6 protein bound to the promoter DNA sequence of HSPA1L

3 討論

ERS通過調節不同應激條件下的自噬和細胞凋亡來維持生存與死亡之間的平衡。有研究表明,睪丸中的熱應激是男性不育的主要原因之一,與活性氧(reactive oxygen species, ROS)過量產生和誘導睪丸精子凋亡有關[8]。持續熱應激誘導睪丸 Leydig 細胞的ERS會阻斷 Leydig 細胞中睪酮的合成,從而影響精子的發生[9]。這些研究結果證實內質網應激除了能影響精子,還能影響附睪中的生殖細胞和激素合成,從而導致男性不育。目前,ERS激活下游UPR信號通路已成為研究生殖細胞生存和凋亡的重要內容之一。

人類HSP70(HSPA)家族由13個成員組成,這些成員的氨基酸序列、亞細胞定位和表達水平各不相同[10]。在HSP70家族中,HSPA1L被認為是一種“睪丸特異性”熱休克蛋白,在精子中高度表達[11]。同時,有研究表明,HSPA1L對于雄性生殖至關重要,HSPA1L磷酸化可保護雄性生殖細胞免受熱應激誘導的細胞凋亡[12]。已有研究表明內質網應激在雄性生殖過程中發揮著重要的作用[2],但目前關于HSPA1L與內質網應激之間是否存在某種關聯尚不清楚。

本研究以ERS的關鍵分子ATF6探討其對生殖相關基因HSPA1L的調控作用,將為預防或治療與ERS有關的男性不育的深入研究奠定基礎。基于轉錄物組測序的結果,將HSPA1L定為研究對象,探究ATF6對下游基因HSPA1L表達的影響。在HEK-293T細胞中驗證了ATF6 可以促進HSPA1L啟動子的活性,并在瞬時轉染ATF6真核表達質粒后,HSPA1L在mRNA 水平和蛋白質水平均隨之上調。EMSA實驗也顯示,ATF6蛋白可以和HSPA1LDNA相互作用,這也進一步驗證了HSPA1L的表達受到ATF6的調控。

本研究存在一定的局限性。由于轉染效率問題,最終選擇轉染效率較高的HEK-293T細胞系進行關于ATF6 如何調控HSPA1L的分子機制研究。但實際上,HSPA1L主要在睪丸的精子細胞中表達,在腎臟、脾臟等器官中也有表達,但表達量較低。因此,HEK-293T 細胞不一定是本項研究中在細胞系上的最佳選擇。但是在一定程度上可以推測,在HSPA1L表達程度更高的細胞中,ATF6對其調控的分子機制很有可能是相似的。

綜上所述,本研究表明,在HEK-293T細胞中,過表達ATF6可以通過結合HSPA1L啟動子上調HSPA1L的轉錄和翻譯水平。這將為進一步研究預防或治療與ERS有關的男性不育奠定基礎。