硫氫化鈉增加高糖高脂條件下小鼠心房肌細胞系HL-1谷胱甘肽合成

張偉才，劉肆仁，王尚農

北京市第六醫院 1.心內科；2.內分泌科，北京 100007

糖尿病心肌病(Diabetic cardiomyopathy,DCM)是糖尿病主要的并發癥之一,由于高糖高脂持續刺激,心肌細胞發生糖脂代謝紊亂,氧化應激、炎性反應、凋亡等病理改變,導致心功能障礙,最終發展為心力衰竭[1-2]。活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)產生過多是DCM發生的主要機制,ROS導致脂質過氧化引起心肌細胞損傷[3]。谷胱甘肽是細胞合成的最重要的非酶抗氧化劑,直接清除ROS。然而,DCM中谷胱甘肽含量減少,機制不清[4]。

硫化氫 (hydrogen sulfide, H2S)是內源性氣體分子,心血管系統中主要由胱硫醚γ裂解酶(cystathionine-γ-lyase, CSE)產生[5-6]。在糖尿病心肌病中,H2S可以顯著降低心肌細胞內ROS水平,保護心肌功能,其具制尚不清楚[7]。硫化氫是脂溶性氣體穿透細胞膜進入胞漿,溶于水產生硫氫根離子在體內發揮生理學作用。硫氫化鈉(NaHS)進入體內也解離成硫氫根離子,因此,人們常選擇NaHS作為硫化氫供體。本研究探討硫氫化鈉能否促進谷胱甘肽合成相關蛋白,改善心肌細胞氧化應激狀態。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 胎牛血清(Gibco公司),棕櫚酸(palmitic acid, Pal) 、N-乙酰-L-半胱氨酸(N-acetyl-l-cysteine,NAC)、硫氫化鈉(sodium hydrosulfide, NaHS) 和DL-炔丙基甘氨酸(DL-propargylglycin,PPG)(Sigma-Aldrich公司)Anti-CSE、Anti-CBS(胱硫醚-β合成酶,cystathionine-β-synthase)、anti-SLC7A11(溶質載體家族7成員11,solute carrier family 7 members 11),anti-GCLC(谷氨酸半胱氨酸連接酶C 亞基,glutamate cysteine ligase C),anti-GCLM(谷氨酸半胱氨酸連接酶M亞基),anti-GSS(谷胱甘肽合成酶,glutathione synthetase)(Proteintech公司,武漢,中國)。CCK-8細胞活力 (上海尚寶生物科技公司,上海,中國)和谷胱甘肽(glutathione,GSH)含量試劑盒(武漢博士德公司)。

1.1.2 小鼠心房肌細胞系HL-1[中國科學院(上海)細胞庫]。

1.2 方法

1.2.1 細胞的分組與處理: 將HL-1細胞接種于含有DMEM培養液(加入10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素混合雙抗)的細胞培養瓶中,將細胞培養瓶放入37 ℃、5% CO2的細胞培養箱中孵育,待細胞增殖至90%匯合時進行給藥處理。

將HL-1細胞隨機分組:1)正常對照組(control):10%胎牛血清DMEM:含25 mmol/L葡萄糖;2)高糖高脂組(HG+Pal):高濃度葡萄糖(HG):40 mmol/L;棕櫚酸(Pal):500 μmol/L;3)NaHS干預:NaHS,100 μmol/L;4)GYY4137干預:GYY4137是H2S緩釋釋放劑,10 μmol/L;5)PPG干預:PPG是CSE抑制劑,1 mmol/L;6)NAC (N-acetyl-l-cysteine)干預:NAC是ROS抑制劑,5 mmol/L。HL-1細胞經加藥培養72 h后進行相關實驗。

1.2.2 CCK-8法檢測細胞活力:將HL-1細胞置于96孔板培養24 h后,用含血清的DMEM配制Pal濃度(μmol/L)為0、200、500、1 000和2 000的培養液培養HL-1細胞,并檢測24、48和72 h后細胞的存活率變化。按試劑盒說明書操作,使用酶標儀在490 nm處檢測吸光度。

1.2.3 Western blot檢測蛋白質: 取1×106HL-1細胞,加入含1%PMSF(蛋白酶抑制劑)的RIPA組織高效裂解液,低溫離心15 min,吸取上清液加入loading buffer,將蛋白樣放入金屬浴進行蛋白質變性,隨后將蛋白質凍存。制備凝膠,上樣,90～130 V電泳,低溫轉膜1.5 h,用脫脂奶粉封閉2 h,加入抗體冷藏孵育過夜,洗膜3次,室溫孵育二抗1 h,采用多功能成像系統Fusion Fx5 spectra采集圖像進行蛋白質吸光度分析,將目的蛋白條帶吸光度值與內參蛋白質條帶吸光度值的比值作為蛋白質表達相對水平。

1.2.4 H2S探針檢測H2S的含量: 使用7-氨基-4-甲基香豆素(7-azido-4-methylcoumarin,C-7Az)熒光探針檢測HL1細胞中H2S含量。不同藥物處理后的HL1細胞,使用PBS清洗2次,加入C-7Az探針(50 μmol/L,PBS稀釋),37 ℃避光30 min,PBS清洗2次,在熒光顯微鏡下觀察H2S含量。

1.2.5 ROS 水平的檢測:將HL-1細胞接種于24孔板中,加藥處理48 h后用 PBS 清洗3次。ROS 檢測試劑(μmol/L):DHE 和DCFH 用不含血清的 DMEM 配制。室溫下避光孵育30 min后使用 PBS 清洗3次,每次5 min。使用 Hoechst 對細胞核染色5～10 min。PBS 沖洗孔板中殘余染料3次,每次5 min。熒光顯微鏡進行檢測分析。

1.2.6 谷胱甘肽含量的檢測:將HL-1細胞種于細胞培養皿培養24 h后,加藥處理72 h。按試劑盒說明書操作,使用酶標儀在412 nm處檢測吸光度。

1.2.7 免疫共沉淀檢測:提取HL-1細胞蛋白質后,使用 BCA 試劑盒進行蛋白質定量,根據定量結果將樣品稀釋至2 μg/μL,根據80 μg上樣量決定實驗所需樣品體積。按照每1 mL樣品加入20 μL IgG瓊脂糖磁珠的比例加入磁珠,4 ℃搖床振蕩混勻30 min,使用磁力架去掉磁珠,將上清液轉移到新的 EP 管中,按照每1 mL樣品加入50 μL磁珠的比例再次加入磁珠,同時按照每1 mL樣品加入5 μL一抗的比例加入抗體,4 ℃ 搖床振蕩混勻過夜。隔天使用磁力架將上清液棄掉,加入含有PMSF的裂解液重懸磁珠,清洗3次。最后按照3∶1的比例加入裂解液和蛋白質上樣緩沖液,100 ℃煮樣10 min。得到的蛋白樣品用 Western blot 檢測蛋白質之間的相互作用。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 棕櫚酸對HL-1細胞活力的影響

500 μmol/L Pal培養72 h的HL-1小鼠心房肌細胞細胞生存率在50%,確定此濃度為最終濃度,作為2型糖尿病心肌細胞模型(圖1)。

Pal.palmitic acid; *P<0.05,**P<0.01,***P<0.001 compared with control group.圖1 棕櫚酸影響HL-1細胞的增殖Fig 1 Palmitic acid effected on HL-1 proliferation at 24,48 and 72

2.2 高糖高脂下HL-1心房肌細胞CSE表達水平

高糖高脂下CSE的表達和H2S含量明顯減少,NaHS干預后能夠恢復CSE的表達和H2S含量(圖2A和B)。

A.expression of CSE was detected by Western blot; B.content of H2S was test by fluorescence probe,C-7Az; *P<0.05 compared with control group;#P<0.05 compared with HG+Pal group.圖2 CSE蛋白表達及H2S含量測定Fig 2 Expression of CSE and H2S content were analyzed(n=3)

2.3 外源性H2S減少高糖高脂下HL-1心肌細胞ROS生成

與對照組相比,高糖高脂及PPG(CSE抑制劑)干預組ROS生成明顯增加,而NaHS和GYY4137(H2S緩釋釋放劑)干預后能減少ROS生成(圖3A和B)。

A,B.representative images of the fluorescence assay of ROS in HL-1cells using the fluorescent probe DCFH (green)and DHE (red);scale bar=50 μm.圖3 高糖高脂條件下細胞內ROS水平的變化Fig 3 Contents of ROS in HL-1 cells with the treatment of HG and Pal

2.4 外源性H2S對HL-1谷胱甘肽生成的影響

與對照組比高糖高脂處理72 h,HL-1細胞谷氨酸半胱氨酸連接酶催化亞基C(glutamate-cysteine ligase catalytic subunit,GCLC)、谷氨酸半胱氨酸連接酶修飾亞基M(glutamate-cysteine ligase modifier subunit,GCLM)、谷胱甘肽合成酶(glutathione syn-thetase,GSS)蛋白的表達均明顯下降,NaHS和GYY4137干預后以上蛋白水平增加,加入PPG后明顯抑制相關蛋白表達的增加(P<0.01)(圖4)。

Pal.palmitic acid; PPG:DL-propargylglycin; HG:high glucose;*P<0.05 compared with control group;#P<0.05 compared with HG+Pal group; △P<0.05 compared with HG+Pal+NaHS group.圖4 Western blot檢測GCLC、GCLM和GSS的表達變化Fig 4 The expression of GCLC,GCLM and GSS was analyzed by Western

2.5 外源性H2S對高糖高脂下HL-1細胞谷胱甘肽含量的影響

與對照組比高糖高脂處理組心肌細胞中總谷胱甘肽和還原型谷胱甘肽含量減少,而氧化型谷胱甘肽含量增加;NaHS和NAC干預后,總谷胱甘肽和還原型谷胱甘肽含量增加;PPG處理后,總谷胱甘肽和還原型谷胱甘肽含量減少(P<0.01)(圖5)。

*P<0.01, **P<0.001 compared with control group;#P<0.05 compared with HG+Pal group; △P<0.01 compared with HG+Pal+NaHS group.圖5 外源性H2S影響高糖高脂條件下GSH的含量變化Fig 5 Exogenous H2S modulating GSH contents in HL-1

2.6 外源性H2S調控心肌細胞Nrf2與Murf1的相互作用

Nrf 2在高糖高脂組的表達明顯降低,給予NaHS,其蛋白水平增加。與對照組和NaHS干預組比,高糖高脂條件下Murf1表達增加。高糖高脂和蛋白酶體抑制劑MG132處理心肌細胞后,Nrf2的泛素水平明顯增加,給予NaHS后,Nrf2的泛素水平明顯降低;高糖高脂條件下Nrf2 蛋白水平下降,與Murf1 增加Nrf2泛素水平,促進其降解密切相關(P<0.01)(圖6)。

A.Western blot analysis of the expression of Nrf2 and Murf1; B.the ubiquitylation of Nrf2 was determined by CO-IP;C.CO-IP analyzing interaction between Nrf2and Murf1; *P<0.05,**P<0.01 compared with control group;#P<0.05, ##P<0.01, ###P<0.001 compared with HG+Pal group.圖6 外源性H2S影響Murf1與Nrf2的相互作用及Nrf2的泛素化水平Fig 6 Exogenous H2S effects on the ubiquitylation of

3 討論

1972年,Rubler在糖尿病患者中發現在沒有冠狀動脈疾病、高血壓和心瓣膜病等危險因素下發生的心臟功能下降,將這種心肌病命名為糖尿病心肌病。超過三分之一的糖尿病患者伴有心肌功能障礙,糖尿病心肌病顯著增加了患者心衰的發病率[8]。糖尿病心肌病是由高血糖、高血脂誘導心肌細胞代謝紊亂,其發生與胰島素代謝信號通路受損、氧化應激、炎性反應的改變,促進結締組織交聯、心肌纖維化增加和心臟重構[11]。糖尿病患者體內H2S的水平下降加重細胞損傷和ROS積累, 激活炎性反應、促進凋亡,最終加重糖尿病心肌病。外源性補充H2S能降低氧化應激水平,減少心肌細胞凋亡[12],本實驗也驗證了外源性H2S減少高糖高脂條件下心肌細胞內氧化應激水平。

谷胱甘肽是細胞合成的最重要的低分子量非酶抗氧化劑,含量豐富,是抗氧化防御系統中的重要組成部分。其功能是維持細胞內的氧化還原穩態,以含硫醇的還原形式(GSH)存在,直接清除體內過量產生的活性氧,并轉變為氧化形式谷胱甘肽二硫醚(glutathione disulfide,GSSG),后者在谷胱甘肽還原酶的催化下以NADPH作為底物還原成谷胱甘肽[13]。本研究發現,硫氫化鈉明顯提高以上蛋白水平,從而提高還原性谷胱甘肽的含量。

核因子紅細胞系2相關因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)是堿性亮氨酸拉鏈蛋白家族的成員,有7個功能域(Neh1～7)參與其穩定性或轉錄活性的調控。kelch樣ECH相關蛋白1(kelch-like ECH-associated protein 1,Keap1)是Nrf2在細胞質中的結合蛋白。正常條件下,Keap1二聚體與Nrf2-Neh2結構域結合,通過Cul3-Rbx1依賴性E3泛素連接酶活性使Nrf2泛素化而被迅速降解[14]。E3 連接酶肌肉特異性環指蛋白-1(muscle-specific RING finger protein 1, Murf1),是環指結構域E3連接酶家族的一員,包含一個環指結構域 (RING finger domain),其在骨骼肌萎縮中發揮重要作用,此外也參與多種蛋白降解[15]。本研究證實在高糖高脂條件下Murf1與Nrf2存在相互作用,增加Nrf2泛素化;給予外源性H2S后,減少Nrf2泛素化。

本研究揭示NaHS減少糖尿病心肌細胞中Murf1的蛋白水平,降低 Nrf2的泛素化,促進GSH合成,減輕高糖高脂條件下ROS的堆積。