人造血液的研究進展

任 烽，金怡杉，陳 露，榮 龍，余春紅

北京航空航天大學 1.生物與醫學工程學院；2.醫學科學與工程學院，北京 100191

血液是一種非常重要的醫療資源,具有運輸、防御以及緩沖作用。雖然中國無償獻血人次與獻血率在逐年增加,但采供血機構供血不足與臨床需血量逐年增長之間的矛盾時有發生,血液仍然是嚴重稀缺資源。同時,天然血液易變質,儲存要求嚴格,調劑使用的成本高,還有潛在的交叉感染隱患,需要通過病歷質量控制系統監控輸血病例[1]。因此,尋找一種安全有效的人造血液迫在眉睫。

1 人造血液的概述

人類全血是非常復雜的,人造全血幾乎是不可能的。目前所說的人造血液,一般指的是可以承擔正常血液攜氧和運輸等功能的血液代用品,主要可分為生物合成的具有完全生物學功能的紅細胞和人工合成具有紅細胞主要功能的替代物兩種。人造血液可以用于外傷、手術等可能導致的大出血,而近年來,研究者也嘗試開展將其用于緩解腫瘤缺氧、遺體器官的保存、一氧化碳中毒的治療,以及體外灌注和心肌保護的研究。相比天然血液,人造血液儲存條件更寬松,保存時間更長,且在使用時不需要考慮血型是否適配,還可以有效避免輸血時感染艾滋病、肝炎等傳染病的風險。但目前很多針對人造血液的研究還只停留在動物實驗階段,只有少數進入到臨床試驗,其中部分因引起心血管并發癥以及腎損害等副作用,研究一度終止。本文主要總結人造血液的研究現狀以及應用,并展望人造血液的未來前景。

2 人造血液的研究現狀

人造血液根據其性質可分為人工合成的血紅蛋白、天然血紅蛋白制成的人工紅細胞、全氟碳化合物和干細胞4大類。其中,天然血紅蛋白制成的人工紅細胞是當前主要研究方向。

2.1 人工合成的血紅蛋白

2.1.1 重組血紅蛋白(hemoglobin,Hb):目前除大腸桿菌表達系統、轉基因小鼠和豬外,關于人類Hb的表達有了新的構想和突破。使用病毒載體,通過小肽連接子連接已構建了以植物為基礎的無內毒素的功能性重組融合人胎兒血紅蛋白(human fetal hemoglobin,HbF)表達系統,成功生產了大量純度高且與天然HbF結構和功能相似的rfHbF,解決了大腸桿菌表達系統產物易變性等問題,開拓了重組Hb生產的思路[2]。

2.1.2 基于血紅素的氧載體:血紅素是天然血紅蛋白的運氧活性位點。因此,研究者嘗試開發含Fe2+的卟啉氧轉運體系以實現類似天然血紅蛋白的氧結合能力。針對該體系位于水介質中易發生不可逆氧化的問題,有研究者通過使用人血清白蛋白顆粒等構建疏水環境,提高了其穩定性[3]。然而近年針對基于血紅素的氧載體研究相對較少,缺少進一步開發和驗證。

2.1.3 樹狀大分子:樹狀大分子是一種具有重復分支結構的高分子物質,因其大小及其他仿生特性被稱為“人造蛋白質”,可開發為基于細胞的具有生物相容性的血紅蛋白產品。現已開發出一種名為超支化聚合物的樹枝狀大分子,通過將Fe2+嵌入中央卟啉,模擬血紅蛋白與氧氣的結合[4]。

2.2 天然血紅蛋白制成的人工紅細胞

Hb在紅細胞內存在時活性最高。當Hb以無細胞形式存在時,血紅蛋白四聚體會迅速解離為二聚體和單體,與2,3-二磷酸甘油酸(2,3-DPG)分離并通過其血紅素基團清除一氧化氮(NO)分子,導致腎損害和心血管并發癥等[5]。為解決這些問題,將天然Hb置于化學修飾的無細胞懸液中,或者與保護酶一起同聚合物結合和交聯,封裝在基于生物材料的納米載體和微載體中,制成血紅蛋白氧載體(hemoglobin-based oxygen carriers,HBOCs)。根據修飾方法,HBOCs主要分為脫細胞HBOCs和細胞HBOCs兩類。

2.2.1 脫細胞HBOCs:如圖1所示,根據阻止Hb在無細胞環境中自發分離的修飾種類可以將其分為3大類:共軛修飾型血紅蛋白(conjugated Hb)、交聯型血紅蛋白 (crosslinked Hb)和聚合型血紅蛋白(polymerized Hb)。

圖1 脫細胞HBOCs的分類Fig 1 Classification of acellular HBOCs

2.2.1.1 共軛修飾型血紅蛋白:以聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)為代表的可溶性大分子可以和血紅蛋白表面賴氨酸等活性基團反應,附著于表面增加血紅蛋白的穩定性和流體力學半徑,防止四聚體解離和外滲,提高在血液中的循環半衰期,同時,覆蓋抗原位點,降低免疫原性。Hemospan(即MP4)是一種利用亞硝基硫醇烷對Hb表面位點進行硫醇化修飾,再偶聯馬來酰亞胺激活的PEG(分子質量為5 ku)而得到的PEG化人血紅蛋白。Ⅰ期和Ⅱ期臨床試驗表明Hemospan在人體內對高效氧氣輸送的耐受性良好,然而進一步試驗顯示,MP4OX(含氧MP4)與天冬氨酸轉氨酶等濃度的短暫升高、心動過緩、惡心和高血壓等不良事件有關,存在心血管和腎功能障礙風險。動物實驗顯示,用一氧化碳飽和MP4制備的MP4CO具備預防和逆轉紅細胞鐮狀化的潛力,然而1b期臨床試驗表明,相比對照組,MP4CO實驗組患者出現頭痛、疲勞和皮疹等不良反應概率更高[6],近年未見更進一步的臨床試驗報道。除PEG外,使用聚多巴胺(polydopamine,PDA)修飾蚯蚓血紅蛋白和牛血紅蛋白后產品具有良好的體外攜氧性能,且PDA修飾的蚯蚓血紅蛋白在體外具有良好的攜氧活性與安全性,抗吞噬性更優,有望獲得更長的循環內滯留時間,是一種頗具希望的嶄新血紅蛋白氧載體設計,值得進一步研究[7]。

2.2.1.2 交聯型血紅蛋白:血紅蛋白由兩個α-亞基和兩個β-亞基組成,使用位點特異性交聯劑可以使亞基之間產生分子間共價鍵穩定結構,防止四聚體被解聚產生腎毒性或被腎濾過,延長其在血管內的存留時間。HemAssist是通過富馬酸酯交聯人血紅蛋白兩個α亞基的產品,在Ⅰ期和Ⅱ期臨床試驗中患者對其總體耐受良好,但后期臨床試驗顯示,輸注HemAssist可能會增加患者患胰腺炎、心肌梗死和死亡率的風險,因此產品并未進入市場[8]。此外,有研究者嘗試采用生物正交法交聯兩個Hb形成雙四聚體以降低血管通透性,小鼠體內研究表明該雙四聚體不會引起系統性高血壓,表明其積極的臨床潛力,然而其介導的氧化應激還有待使用豚鼠等其他動物模型研究[9]。

2.2.1.3 聚合型血紅蛋白:血紅蛋白與酶結合后,以交聯劑連接相鄰分子表面的氨基可生成分子質量不均一的多聚血紅蛋白,增加四聚體的穩定性,延長血管內循環半衰期,提高攜氧力和膠體滲透壓,減少腎毒性和血管收縮作用。使用分子直徑相似的小分子質量聚合牛血紅蛋白和大分子質量聚合牛血紅蛋白對豚鼠的毒性實驗表明,聚合血紅蛋白的分子質量大小決定了其輸注引起的血管活性、循環時間、清除機制、毒性和炎性反應[10]。此外,針對低分子質量聚合血紅蛋白(LMW PolyHb)存在的外滲、一氧化氮清除,導致血管收縮和高血壓等問題,有研究通過將天然存在的Hb清除蛋白觸珠蛋白與不含血紅素的載脂血紅蛋白的結合物預處理動物,緩解了輸注LMW PolyHb引起的平均動脈壓、心率、小動脈直徑、血流量和功能性毛細血管密度變化,有助于減輕升壓效應[11]。然而這些產品還需要進一步補充針對其他具有不同血管活性機制的動物模型的臨床前研究。

2.2.2 細胞HBOCs:細胞HBOCs旨在模仿天然紅細胞的一些基本特征以減少各種并發癥的發生。目前主要有脂質體包裹的和納米顆粒包裹的兩類細胞HBOCs。

2.2.2.1 脂質體包裹的HBOCs:將純化的Hb封裝在由磷脂雙分子層和膽固醇分子組成的穩定的脂質膜中,將無基質血紅蛋白溶液和2,3-二磷酸甘油酯或肌醇六磷酸酯作為膠狀液體包裹在一起。這種設計基本模擬Hb在紅細胞中的生理狀態,具有適當的氧飽和度和釋放動力學。同時,脂質體包封Hb降低了對一氧化氮的清除作用,從而降低了對血管系統的不良影響;還可以防止腎小球清除Hb,減少腎毒性。使用聚乙二醇表面共軛脂質體包封Hb形成了Hb濃度與全血(～12 g/dL)相當的顆粒,并證實其不僅穩定性好而且具有理想的載氧功能[12]。這表明,脂質體包裹的HBOCs可以克服HBOCs的固有缺陷,保護內部環境免受外部影響,有望開發出更有潛力的人造血液產品應用于臨床。

2.2.2.2 納米顆粒包裹的HBOCs:將Hb與維持氧化還原環境、Hb穩定性和氧氣/二氧化碳轉運的酶封裝在生物相容和可生物降解的納米顆粒中,可以保持Hb與天然紅細胞相似的氧運輸能力,模擬其活動。但與脂質體相比,納米顆粒的一個潛在問題是其更高的殼厚度可能導致封裝的Hb或從Hb釋放到組織的擴散時間更長,而聚合物的分子質量、殼層厚度會影響體系中氧的運輸。可變形的混合肽脂質納米顆粒Erythromer具有類似于紅細胞的形狀、形態和生物相容性,能夠結合每顆Hb的有效載荷,對一氧化氮的消除和血管活性的影響小,其Ⅰ期臨床試驗已于2022年11月在日本獲得批準。這種去溶劑自組裝的使用避免了非特異性聚合的不確定性和低Hb含量以及脂質包裹的血紅蛋白囊泡的大脂質負擔,為HBOCs的發展指出了一條將治療性氧載體的研究目標、臨床需求及快速發展的納米醫學領域的技術相結合的道路。

2.3 全氟碳化合物

全氟碳化合物(perfluorocarbon,PFC)是氫原子完全被氟原子取代的一種碳氫化合物。PFC生化特性良好,感染風險小,對氧氣和二氧化碳的溶解度很高,且溶解在PFC中的氧含量與氧壓呈線性關系,可以為缺氧組織迅速而廣泛地提供氧氣[13]。同時,PFC尺寸小,易通過某些疾病中紅細胞不能通過的閉塞血管。但PFC不溶于水,需要被合適的表面活性劑(如磷脂)嚴格乳化或生成納米顆粒,才能懸浮在血液中。目前,正在開展基于PFC的人造血液及靶向治療等系列臨床研究,而全面評估PFC可能帶來的不良反應并針對性地改進產品構成、配比及乳化方式是其走向臨床應用的關鍵。

2.4 干細胞

造血干細胞(hematopoietic stem cells,HSCs)是存在于血液和骨髓中的稀有細胞,具有多能性和自我更新的特性,能夠生成完整的造血系統,產生成熟血細胞。從HSCs生成紅細胞耗時長,并且數量少,很難擴大其規模。因此,研究者正探索除HSCs外的其他人類干細胞生成血細胞或產生血細胞成分的可行方法。

2.4.1 胚胎干細胞(embryonic stem cells,ESCs):ESCs來源哺乳動物胚胎早期發育階段囊胚的內細胞團。人胚胎干細胞(human ESCs,hESCs)能夠無限增殖,同時保持分化成包括血細胞在內的身體所有細胞的能力。開展ES CD34+細胞來源的紅系細胞擴增受限和去核受損的相關機制研究,可能有助于改善干細胞的體外紅細胞生成[14]。

2.4.2 誘導性多能干細胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs):iPSCs是通過反轉錄病毒轉導特定因子將成年體細胞重編程而成的胚胎樣細胞,具有自我更新和分化為多種類型細胞的能力。通過培養、擴增、重編程,在稀有血型獻血者的外周血中獲得iPSCs,之后又將其成功分化為紅細胞前體細胞,并且無明顯的染色體突變,且每個iPSCs的紅細胞產量適中[15]。這證明了自體iPSCs分化的紅細胞用于無替代選擇的患者臨床輸血的潛在可行性。此外,針對iPSCs分化得到的紅細胞存在分化程度和完全去核率低等問題,研究者也提出與巨噬細胞共培養以模擬紅系造血島(erythroblastic islands,EBI)等解決方案[16]。

2.4.3 間充質干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs):近年來,人毛囊來源的間充質干細胞因被證實具有誘導紅細胞和iPSCs的潛力而備受關注。通過Oct4基因過表達并將其暴露在造血細胞因子中,可以將其誘導成為成熟的、主要表達成人β-珠蛋白鏈的紅細胞,且這些紅細胞幾乎都不含細胞核[17]。這些發現表明,成熟的紅細胞可以從成年體細胞中獲得,MSCs分化的紅細胞是潛在的自體輸血的紅細胞的替代來源。

3 人造血液的臨床應用

目前,通過化學修飾、干細胞合成等方法,研究者們已設計出多種氧載體,可廣泛應用于缺氧引起的疾病、傷口愈合、器官保護等各個領域。雖然這些氧載體在臨床應用中仍有一定的局限性,但相比天然血液輸血,運用人工氧載體具有不可替代的優勢:與所有血型相容、感染風險低、可長期儲存、適用于極端情況等。除此之外,動物和臨床試驗表明,根據不同疾病特點使用人工氧載體聯合一氧化碳、光動力療法等,可靶向快速治療疾病,應用前景廣闊。

3.1 人造血液在失血中的應用

3.1.1 產科大出血:通過在懷孕大出血休克母兔模型中對比不同復蘇輸注方法發現,僅用5%人血清白蛋白復蘇輸注及手術止血組動物全部在8 h內死亡,而采用紅細胞組和脂質體包裹的HBOCs組動物則全部存活8 h以上[18]。這表明,脂質體包裹的HBOCs輸注可恢復重要器官供氧,有望作為預防產科大出血休克的初步治療方法。

3.1.2 出血性休克后的腦缺血/再灌注損傷:有研究使用一氧化碳結合的血紅蛋白囊泡(co-bound hemoglobin-vesicle,CO-HbV)對失血性休克的大鼠進行復蘇,結果表明,使用CO-HbV 14 d后不會導致明顯的海馬損傷,還可有效預防出血性休克后腦缺血再灌注損傷,為治療出血性休克后腦缺血再灌注損傷提供了新途徑[19]。

3.2 人造血液在惡性腫瘤中的應用

3.2.1 放射治療:使用氟化透明質酸(fluorinated hyaluronic acid,FHA)封裝氧氣飽和PFC制備的腫瘤靶向氧飽和載體O2@PFC@FHA NPs可以將安全且特定的氧氣輸送到腫瘤中,其中FHA的封裝不僅提高了腫瘤的靶向性,而且可以降低氧的釋放速率,運載更多的氧氣進入腫瘤缺氧區域,使對荷瘤小鼠的放射治療療效幾乎增加了兩倍,且無明顯的全身毒性,具有應用于臨床實體瘤治療的潛力[20]。

3.2.2 靶向治療:光動力療法(photodynamic therapy,PDT)利用光敏劑通過Ⅰ型和Ⅱ型過程產生的細胞毒性活性氧(reactive oxygen species,ROS)能有效殺滅細菌,不受細菌耐藥性限制,然而治療效率受感染部位缺氧限制。一種全氟化碳共軛的四氟苯基細菌綠素(perfluorocarbin-conjugated fetrafluorophenyl bacteriochlorin,FBC-F)的氧可調納米平臺能夠高效地為Ⅱ型PDT生成單線態氧,并為I型PDT生成超氧陰離子和羥基自由基,顯著提高體外抗菌效果,且動物實驗表明FBC-F能高效殺菌并促進傷口愈合,為光動力抗菌治療開辟了一條新途徑[21]。類似地,有望作為非侵入性癌治療方法的聲動力療法(SDT)療效也受腫瘤缺氧限制。有研究利用硫酸軟骨素(chondroitin sulfate,CS)、產生ROS的聲敏劑rhein(Rh)和PFC構建了一種新型CD44受體靶向和氧化還原/超聲響應載氧納米平臺CS-Rh-PFC,增加了黑色素瘤細胞中的氧含量并提高了SDT的效率,結合抗腫瘤藥物多西他賽(docetaxel,DTX)實現了精確的腫瘤靶向藥物釋放,促進全身免疫和抗腫瘤療效[22]。未來,新型納米平臺還可以通過同時包封多種藥物或免疫佐劑及多功能聲敏劑,進一步提高抗腫瘤效果。

3.2.3 免疫治療:腫瘤免疫治療通過主動或被動方式使機體產生腫瘤特異性免疫應答,具有特異高效、不良反應小等優點,但腫瘤缺氧的微環境會阻礙其治療。體外和體內研究表明,PFC或Hb修飾的脂質體(PFC@lipo或Hb@lipo)能夠有效負載和釋放氧氣,緩解腫瘤缺氧,且將更為安全、具有較高動物耐受性的Hb@lipo與PD-1抗體聯合使用,顯著增強了PD-1的抗腫瘤作用并抑制了4T1乳腺癌的進展,然而治療CT26結腸癌時受高度浸潤的M2巨噬細胞限制,療效并不明顯[23]。

3.3 人造血液在器官及灌注中的應用

3.3.1 器官保存液添加劑:M101是一種源自海洋沙蠶Arenicola marina的細胞外氧載體的治療性氧載體。有研究在使用M101進行大鼠離體心臟灌注、豬肺同種異體移植等臨床前研究表明,其在改善相關功能參數的基礎上,首次使用M101作為人體腎移植保存液添加劑,受體沒有出現與該產品相關的過敏或超敏反應或感染,且基本不會導致間質纖維化、腎小管萎縮和血管病程發展,沒有毛細管血栓形成或微循環改變,這表明了M101具有良好的耐受性,驗證了其作為器官保存液添加劑的安全性,并為進一步研究評估M101的成本/療效比和長期效益提供了依據[24]。

3.3.2 灌流液:以人工胎盤生命支持系統為基礎,使用脂質體包裹的HBOCs作為人工胎盤回路啟動液,可以維持極度早產的綿羊胎兒生存長達72 h,展現了人造血產品在人工胎盤技術臨床轉化中的潛力[25]。

4 問題和展望

相比天然血液,人造血液具有便于長期儲存、無致病菌、萬能血型等優勢,當前4類產品均尚有優化空間:人工合成血紅蛋白可以通過定點誘變被特殊修飾而具有變構效應,但生產成本高,產量和純度過低,難以滿足大規模生產需求,需探索新的合成體系;HBOCs抗原性弱,生物相容性好,但半衰期較短且大劑量使用不良反應明顯,需探索合適的修飾條件和封裝方法;PFC攜氧能力強,但穩定性差、不良反應未知,需針對性地改進構成、配比及乳化或生成納米顆粒方式;干細胞分化所得紅細胞雖為直接細胞來源,但無法滿足臨床輸血量需求,還存在一定的致瘤風險,需改進培養和誘導分化的方法。

除用于基本的輸血外,不同類型人造血液根據其特性,或與光動力療法等治療方法相結合,還可被推廣應用到移植器官保護、心血管的缺氧性疾病、腫瘤的放療和化療等多種疾病的治療中。例如,脫細胞HBOCs可以集修飾與靶向于一體,對病灶定向特異性供氧,使治療更精準;飽和一氧化碳輔助治療鐮狀紅細胞貧血癥;作為器官保存時的灌注液維持器官活力和細胞功能;聯合一氧化氮等輸注,逆轉治療中的肺動脈高壓等情況,減輕不良反應。

人造血液應用前景廣闊,而如何評價不同產品是未來人造血液重點研發方向選擇及性能改進的必要前提。總的來看,來源、生產成本、生產工藝、穩定性和安全性是對人造血液產品的主要評價指標。然而,目前缺少一個統一而明確的評價體系評估人造血液產品性能。同時,受當前技術限制,各類人造血液還存在半衰期短、生產工藝復雜、費用高等問題,相關產品多還處于研發及臨床試驗階段,獲準上市的產品非常少,普遍缺乏動物實驗數據,以驗證其有效性以及安全性,且未實現批量生產和規模化推廣應用。這些現實問題限制了人造血液的產品化及其臨床應用轉化。因此,亟需來自生物醫學、血液學等各領域的專家以及適當的監管機構的協同努力,建立標準化的體外和體內評價指標,推進產品開發、動物實驗、臨床研究和工藝產業化,由此推動人造血液臨床多領域推廣應用。