基于外泌體多miRNA表達水平構建的子癇前期風險預測模型效能分析

鄧乾葆，張忠霞，王茹，許琳，羅書

子癇前期（pre-eclampsia，PE）屬于妊娠期高血壓疾病中常見的一類，近年來大量高齡孕婦的出現導致此類疾病發生率高于以往［1］。早期發現并及時干預是改善PE 孕產婦預后的最佳措施。但根據目前臨床工作經驗，國內孕產婦知識水平及家庭背景差異較大，部分患者由于對妊娠期高血壓疾病的認知不足，導致疾病發現延遲，嚴重影響孕產婦及胎兒的健康［2-3］。外泌體是人自體細胞外囊泡釋放的、與外界具有信號傳導作用的介質，而微小RNA（microRNA，miRNA）是其中的重要組成部分［4］。國內外多項針對PE患者外泌體miRNA 的質譜研究均發現，多個miRNA 在PE和正常孕婦之間存在差異，提示外泌體miRNA 在預測PE 上具有一定的可行性［5-6］。本文在既往研究的基礎上，基于外泌體miRNA構建PE預測模型并驗證其效能，旨在為臨床診治PE提供參考。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選擇2019年6月—2021年12月于我院建檔的孕婦作為研究對象。納入標準：（1）宮內妊娠，單活胎。（2）年齡＞20 周歲。（3）孕周≤20 周。（4）孕婦及家屬知情同意。排除標準：（1）既往合并明確的高血壓病史。（2）既往明確腎臟疾病病史。（3）半年內服用影響血壓及腎功能的藥物。（4）首次孕檢發現孕婦或胎兒存在嚴重的生理缺陷或指標異常。符合上述要求并報我院倫理委員會審核通過后（倫理號：KY20190528196），共計1 037例孕婦納入本研究。

1.2 方法

1.2.1 隨訪及分組方案 所有孕婦入組建檔后按照《孕前和孕期保健指南（2018）》［7］中相關標準進行常規產檢，同時開展隨訪直至分娩。根據《妊娠期高血壓疾病診治指南（2015）》［8］中相關標準評估所有入組患者是否發生PE，并收集發生PE的時間。隨訪結束后將發生PE患者納入PE組，其余納入對照組。

1.2.2 外泌體miRNA 表達情況分析 本次檢測的外泌體miRNA包括miR-125a-3p、miR-155-5p、miR-199a-5p、miR-203a-3p 及miR-215-5p。（1）外泌體提取。采用血漿外泌體試劑盒（美國System Biosciences 公司）提取血漿中的外泌體。于清晨抽取患者空腹靜脈血5 mL至EDTA抗凝管；將采集到的血液在4 ℃下1 500×g離心20 min，去除血液中的細胞后取上清，4 ℃下13 000×g離心2 min，收集上清液，然后將樣本置于-70 ℃環境保存，待樣本收集完畢后統一檢測。取500μL樣本，加入126 μL 試劑盒內試劑，手動混勻，置于4 ℃孵育30 min，使用離心機在20 ℃條件下對樣本進行離心30 min，去除上清液并向試管內加入200μL PBS，重置后獲得外泌體懸液。在透射電子顯微鏡（TEM）對懸液內的外泌體的形態進行鑒定。采用Western blot 鑒定外泌體相關標志物CD63、TSG101 表達，內參為calnexin，所有實驗使用抗體均由北京億鳴復興生物科技有限公司設計并提供。（2）RNA 提取。采用TRIzolTM試劑（寶日醫生物技術有限公司）提取外泌體懸液內總RNA。（3）逆轉錄。用PrimeScriptTMRT試劑盒（寶日醫生物技術有限公司）對各miRNA 進行反轉錄，取cDNA 作為熒光定量模板。反應條件：95 ℃5 min，95 ℃30 s，60 ℃30 s，72 ℃30 s，共45 個循環。（4）擴增定量。通過將cDNA、qRTPCR引物（具體見表1，由北京億鳴復興生物科技有限公司設計并提供）及相關酶組成qRT-PCR 反應體系后加入realtime PCR 分析儀［賽默飛世爾科技（中國）有限公司］中進行反應，反應過程：95 ℃30 s；95 ℃5 s，60 ℃44 s，共進行40個循環。采用2-ΔΔCt法計算目標外泌體miRNA 相對U6 的表達量。

Tab.1 qRT-PCR primer sequences表1 qRT-PCR引物序列

1.3 觀察指標 （1）患者一般資料。年齡、孕前體質量指數（BMI）、孕12周腰圍、血壓、孕次、飲酒史（飲酒時間超過5年，飲酒量折合酒精≥20 g/d）、吸煙史（吸煙時間超過5 年，吸煙量≥10支/d）、高血壓家族史。（2）實驗室檢查資料。空腹血糖（FPG）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、總膽固醇（TC）、丙氨酸轉氨酶（ALT）、天冬氨酸轉氨酶（AST）、血小板計數（PLT）、血紅蛋白（Hb）、血小板分布寬度（PDW）、平均血小板體積（MPV）、促甲狀腺激素（TSH）、游離三碘甲狀腺原氨酸（FT3）、游離甲狀腺素（FT4）、β-人絨毛膜促性腺激素（HCG）及外泌體miRNA 表達情況。所有靜脈血均于患者首次就診后次日清晨空腹留取標本。

1.4 統計學方法 采用Epidata 3.1 軟件錄入數據，采用R（4.0.5）軟件分析數據。計量資料采用均數±標準差（）表示，2 組間均數比較采用獨立樣本t檢驗，計數資料用例（%）表示，采用χ2檢驗比較組間差異。應用Cox回歸分析PE的影響因素；采用ggrisk 包構建多miRNA 風險模型，并通過受試者工作特征（ROC）曲線下面積（AUC）評估風險模型的預測能力。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 隨訪結果及一般資料比較 截至2022年10月31日隨訪結束，1 037例孕婦中63例失訪，其中23例未完成隨訪，40 例相關檢查資料不完全，最終完成隨訪974例（93.92%）。其中有65例發生PE，故最終分組為PE組65例、對照組909例。PE組年齡、孕前BMI、孕12周腰圍均大于對照組，吸煙史及飲酒史比例高于對照組（P＜0.05），見表2。

Tab.2 Comparison of general data between the two groups表2 2組一般資料比較

2.2 2 組實驗室檢查結果比較 PE 組TG、LDL-C、TC、ALT、AST、Hb、PDW、MPV 水平高于對照組，而TSH水平低于對照組（P＜0.05），見表3。

Tab.3 Comparison of laboratory test data between the two groups表3 2組實驗室檢查結果比較（）

Tab.3 Comparison of laboratory test data between the two groups表3 2組實驗室檢查結果比較（）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01。

組別對照組PE組t n 909 65 FPG/（mmol/L）5.11±1.41 5.22±1.98 0.584 TG/（mmol/L）1.89±0.47 2.05±0.72 2.558＊LDL-C/（mmol/L）3.08±0.60 3.31±1.15 2.756＊＊TC/（mmol/L）5.64±0.89 5.91±1.89 2.111＊ALT/（U/L）23.24±5.42 25.16±8.42 2.643＊＊AST/（U/L）18.41±4.11 19.75±4.31 2.524＊組別對照組PE組t PLT/（×109/L）214.59±37.01 219.36±57.39 0.961 Hb/（g/L）123.43±9.33 126.47±10.35 2.519＊PDW/%15.30±2.04 17.60±4.27 7.933＊＊MPV/fL 8.77±2.01 9.98±2.96 4.516＊＊TSH/（U/L）2.25±0.39 1.95±0.34 6.070＊＊FT3/（pmol/L）4.25±0.42 4.29±0.64 0.664 FT4/（pmol/L）12.56±1.91 12.95±3.21 1.529

2.3 2 組外泌體miRNA 表達水平比較 PE 組外泌體中miR-155-5p、miR-199a-5p、miR-215-5p 水平均高于對照組，miR-125a-3p 及miR-203a-3p 水平低于對照組（P＜0.05），見表4。

Tab.4 Comparison of miRNA expression levels in different exosomes between the two groups表4 2組不同外泌體miRNA表達水平比較（）

Tab.4 Comparison of miRNA expression levels in different exosomes between the two groups表4 2組不同外泌體miRNA表達水平比較（）

＊＊P＜0.01。

組別對照組PE組t n 909 65 miR-125a-3p 1.13±0.20 0.77±0.11 14.771＊＊miR-155-5p 0.96±0.17 1.41±0.29 18.492＊＊miR-199a-5p 1.12±0.22 1.71±0.38 19.532＊＊miR-203a-3p 1.72±0.45 0.97±0.31 13.146＊＊miR-215-5p 1.21±0.31 1.40±0.25 4.802＊＊

2.4 外泌體miRNA 與PE 關系的多因素Cox 回歸分析 以是否發生PE 為因變量（是=1，否=0），外泌體miRNA 作為自變量進行Cox 回歸分析。結果顯示，miR-125a-3p、miR-155-5p、miR-199a-5p、miR-203a-3p 及miR-215-5p 表達水平為PE 發生的獨立預測因子（P＜0.05），見表5。

Tab.5 Cox regression analysis of multifactor correlation between exosome miRNA and PE表5 外泌體miRNA與PE相關性的多因素Cox回歸分析

2.5 PE 風險預測模型的構建和應用 基于2 組外泌體miRNA 表達水平構建的風險預測模型見圖1，預測模型危險評分≥-0.24時為區分危險分層的最佳截點。

Fig.1 miRNA risk prediction model based on PE multiple exosomes圖1 基于PE多外體miRNA風險預測模型

2.6 PE 發生的預測模型評估 ROC 曲線分析顯示，由上述外泌體miRNA構建的風險預測模型在PE發生方面具有良好的預測價值（AUC=0.998，P＜0.001），敏感度為96.92%（63/65），特異度為93.94%（854/909），見圖2。

Fig.2 ROC curve of PE prediction by multiple miRNA expression risk model圖2 多miRNA表達風險模型預測PE的ROC曲線

3 討論

3.1 PE預測模型的研究現狀 PE的預測模型一直以來都是產科的研究熱點，既往研究使用胎盤生長因子、可溶性fms 樣酪氨酸激酶-1 等特異性指標構建PE模型具有一定的可行性，但是由于上述指標特異度較差，故模型的預測效果有待進一步提升［9］。外泌體作為信號傳導介質在人體內廣泛存在，且伴隨著基因芯片技術研究的逐步深入，國內外針對PE外泌體miRNA 的研究也取得了初步成果。本研究為避免單個miRNA受疾病或其他因素影響，故在既往研究的基礎上，納入多個外泌體miRNA作為本次模型構建的參考對象，進一步提升了預測模型的準確性［10-11］。

3.2 臨床常用實驗室檢查指標與PE 的關系 本研究首先針對PE的一般指標進行分析，存在差異的項目中，年齡、孕前BMI、腰圍、吸煙及飲酒史等在國內外指南中已被認定是影響PE發生的危險因素［12-13］。國外一項指南中對于2 次妊娠與PE 之間的關系還存在一定爭議［14］，結合本次研究情況來看，二者之間并沒有明顯差異，但本研究中2 次妊娠人群僅占32.23%（314/974），人群基數較小，故對于此爭議還需要進一步擴大研究范圍以求得到更具說服力的結論。TG、LDL-C 及TC 均屬于體內脂代謝指標。相關研究顯示，上述3 個指標升高可能導致血管內壁炎性因子水平上升，可以間接體現血管損傷的情況［15］。同時因為血管損傷是目前PE公認的誘因，故TG、LDL-C 及TC 與PE 可能存在相關性；相關研究指出，血管內皮損傷會導致內皮素水平升高，升高的內皮素通過循環系統進入肝臟后會誘發肝臟微循環收縮，從而制造缺血缺氧環境，導致肝細胞損傷，出現ALT及AST升高的情況［16-17］。從上述過程中不難看出，ALT及AST可以部分反映血管內皮損傷程度，從而與PE 的發生風險存在正相關的關系。具有高危PE風險的孕婦因血管損傷程度逐步累積，誘發胎盤滋養層缺血缺氧加重，從而發生不可逆性損傷，而血管及胎盤滋養層的損傷修復主要依賴于血小板，這會導致血小板的大量消耗。在上述背景下，骨髓大量分化新生血小板，而新生血小板相較于成熟血小板的PDW及MPV會有一定差異，這可能是導致2組患者出現上述2 個指標差異的原因［18］。研究顯示，TSH降低預示著母體甲狀腺素相對不足，而孕早期甲狀腺功能低下可能導致子宮螺旋動脈生長受限，后期因血供不足誘發胎盤的缺血缺氧損傷，最終導致PE 的發生，故TSH 較低的孕婦PE 發生風險升高［19］。本研究分析常規實驗室檢查項目的目的在于進一步了解納入樣本與既往研究之間的差異，分析是否存在可能影響研究結果的相關因素，通過結果可以看出，上述指標與既往研究結果存在相似性，說明本研究結果可重復性較好。但以上分析的實驗室檢查指標受到環境、飲食及生活習慣等不可抗力因素的影響較大，單次測量數據不一定能有效反映機體真實情況，故并未納入模型構建范疇。

3.3 miRNA 與PE 之間的關系及基于miRNA 構建PE 預測模型效果分析 Hu 等［20］研究認為，高表達的miR-125a-3p可以通過結合血管平滑肌細胞上的靶標絲裂原活化蛋白激酶-1 從而達到抑制血管壁細胞分裂和生長的作用，避免血管損傷進一步加重。通過本研究發現，PE 患者miR-125a-3p 表達量較低，可以認為此類人群因缺少避免血管損傷的miR-125a-3p 會導致發病或病情進展。胞內磷脂酰肌醇激酶（PI3K）/蘇氨酸蛋白激酶1（AKT1）軸在人體內可以通過影響內皮型一氧化氮合酶磷酸化，從而進一步促進血管內一氧化氮及血管內皮生長因子分泌而誘發血管內皮損傷［21］。miR-155-5p 可以通過與AKT1 蛋白上的3'-非翻譯區位點結合，促進AKT1表達，導致血管損傷加重，因此可以認為miR-155-5p表達情況與血管損傷之間存在相關性，可能在PE的發生及發展過程中扮演關鍵角色。研究顯示，miR-199a-5p 可以與細胞沉默調節蛋白1 構成復合體，加重血管緊張素Ⅱ誘導的血管平滑肌細胞衰老，加速血管損傷［22］，推測miR-199a-5p與PE之間可能存在相關性。在Han等［23］的動物模型研究中，miR-203a-3p 可以通過抑制HIF-α 及血管內皮生長因子A（VEGFA）的表達阻止糖尿病視網膜病變小鼠的視網膜血管生成。而HIF-α 及VEGFA 的高表達會導致血管內皮損傷加重，故推測miR-203a-3p 高表達可以抑制HIF-α 及VEGFA，從而減少血管內皮損傷。結合本研究結果認為，孕婦體內可能因miR-203a-3p高表達導致PE發生率降低。但上述結論來源于動物實驗，尚缺少人體或細胞實驗結果支撐，可以進一步開展人體或細胞學研究探究具體作用機制。miR-215-5p 可以通過刺激靶向基因CDC6 表達，在降低滋養層細胞N-鈣黏蛋白和波形蛋白表達的同時，上調E-鈣黏蛋白表達，達到抑制滋養層細胞分化和遷移的作用，而滋養層細胞分化及遷移能力的下降是導致PE 發生的重要因素，故miR-215-5p 升高可以導致PE 的發生［24］。本研究通過構建外泌體多miRNA 對PE 預測的模型結果顯示，當模型危險評分≥-0.24 時為區分危險分層的最佳截點，ROC 曲線對PE 預測的AUC 達0.994，且敏感度及特異度均較高，因此認為可以在臨床開展大規模研究驗證后運用于臨床PE的診斷。

綜上，miR-125a-3p、miR-155-5p、miR-199a-5p、miR-203a-3p 及miR-215-5p 與PE 的發生有關，以上述5 個miRNA 構建的PE 預測模型效果較好。但本研究為單中心小樣本研究，且上述miRNA與PE之間的具體作用機制仍需開展基礎研究進行證實。