液相色譜-氫化物發生-原子熒光光譜法測定中藥樣品中的4種砷形態

張 雯，徐 麗，劉德曄，張琳昀*

（1.江蘇省疾病預防控制中心，江蘇 南京 210009；2.駐馬店市食品藥品檢驗所，河南 駐馬店 463000）

中藥材中的重金屬及有害元素的污染一直是國內外普遍關心的問題[1]。隨著檢測技術的進步，僅測定中藥材中的重金屬總量已不能滿足監測其毒性的要求。同一元素的不同化學形態其毒性存在很大差異[2]。砷是一種廣泛存在于自然界中的重金屬[3-4]，砷對人體的毒性不僅與其總量有關，更與其存在形態有關。砷存在的主要形態可分為有機砷和無機砷兩大類，無機砷主要包括砷酸鹽[As（V）]和亞砷酸鹽[As（III）]，有機砷包括一甲基砷（MMA）和二甲基砷（DMA）等，無機砷的毒性比有機砷的毒性強，而在海洋生物中富集較多的有機砷如砷膽堿（AsC）和砷甜菜堿（AsB）等毒性相對較小[5]。研究發現，砷各種形態的毒性大小依次為As（III）>As（V）>MMA>DMA>AsB。無機砷化合物已被國際癌癥研究機構確認為I類致癌物[6]。無機砷攝入過量易導致皮膚、神經、消化、生殖、免疫系統等損傷，更加嚴重的會導致肝癌、皮膚癌等癌癥的發生[7]。2020年版《中華人民共和國藥典（一部）》規定了 28種中藥材及6個中成藥中重金屬及有害元素限量，《藥用植物及制劑 進出口綠色行業標準》規定中藥重金屬的一般限量標準為砷≤2.0 mg/kg[8-9]。考慮到無機砷的高毒性，中藥中砷的限量標準顯然不夠完善。

常用的砷形態的測定方法主要是食品安全國家標準GB5009.11-2014[10]中的第一法液相色譜-原子熒光法（LC-AFS）[11-12]和第二法高效液相色譜-電感耦合等離子體質譜法（LC-ICP-MS）[13-15]，以上兩種方法亦可作為中藥材中無機砷測定方法。除此之外還有高效液相色譜-電感耦合等離子體串聯質譜法（HPLC-ICP-MS/MS）[16-17]，但由于儀器昂貴，運行成本較高，難以被普及。本研究在國標第一法LC-AFS方法上進行改進，優化了前處理條件，采用Princen砷形態快速分析柱，選擇合適的試劑條件和儀器參數，建立一種能同時測定中藥材樣品中As（III）、As（V）、DMA和MMA 4種砷形態的方法，對完善中藥材中無機砷的限量標準，正確評估土壤環境中砷的污染程度有重要價值，也可為食品和環境監管提供數據支持。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

DHG-9076A型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海精宏）；DEENA3型全自動石墨消解儀（上海儀真）；3-18ks型高速離心機（德國Sigma公司）；E180H型超聲波清洗機（德國Elma公司）；Elspe-2型液相色譜儀（廣州譜臨晟）；BAF-4000型原子熒光光譜儀（北京寶德）。

1.2 試藥

砷酸根[A s（V）]標準溶液（編號：GBW08667，17.5 μg/g），亞砷酸根[As（III）]標準溶液（編號：GBW08666，75.7 μg/g），MMA標準溶液（編號：GBW08668，25.1 μg/g），DMA標準溶液（編號：GBW08669，52.9 μg/g，中國計量科學研究院）；鹽酸，硝酸（優級純，南京化學試劑股份有限公司）；磷酸氫二鉀（分析純，南京化學試劑股份有限公司）；氫氧化鉀，氨水，硝酸銨（分析純，國藥集團）；硼氫化鉀（分析純，旭日成化學）；高純氬氣（純度≥99.99 %，南京文達特種氣體有限公司）；0.45 μm水系濾膜；50 ml聚丙烯離心管。實驗用水均為超純水。本研究所用的中藥材均為河南省駐馬店市市場監督管理局抽檢樣品。

2 方法與結果

2.1 LC-AFS條件

2.1.1 LC條件 色譜柱：Princen砷形態快速分析柱（As Spec Fast Analysis Column，4.6 mm×50.0 mm，5.0 μm）；保護柱：Princen保護柱（As Spec Guard Column，4.6 mm×50.0 mm，10.0 μm）；載氣：氬氣，壓力：0.15 MPa。流動相：流動相A：5 mmol/L 磷酸氫二鉀+1 mmol/L硝酸銨，氨水調節pH 10.9；流動相B：25 mmol/L磷酸氫二鉀+40 mmol/L硝酸銨，氨水調節pH 9.2； 梯度洗脫程序：0～102 s，100 %流動相A；103～241 s，100 %流動相B；242～360 s，100 %流動相A。流速：1.2 ml/min；進樣量：100 μl。

2.1.2 AFS檢測條件 載流：5 %鹽酸溶液；還原劑：0.5 %氫氧化鉀溶液+1.5 %硼氫化鉀溶液；負高壓：290 V；燈電流：60 mA；輔助電流：60 mA；載氣流速：400 ml/min；輔助氣流速：800 ml/min。氫氣發生器流量：100 ml/min。

2.2 4種不同形態砷含量測定法

2.2.1 標準溶液的配制 準確稱取亞砷酸根[As（III）]1.3210 g、砷酸根[As（V）]5.7150 g、MMA 3.9880 g、DMA標準溶液1.8904 g，分別置于10 ml量瓶中，加水定容。所得溶液中As（III）、As（V）、MMA、DMA濃度均為10 μg/ml。分別準確吸取各形態砷標準溶液（10 μg/ml）各1 ml于10 ml量瓶中，加純水定容，得1.0 μg/ml混合標準溶液（以不同形態的砷計）。

2.2.2 不同形態砷含量測定 稱取烘干粉碎后的中藥試樣0.5 g，置于50 ml消解罐中，加入0.15 mol/L硝酸溶液20 ml，浸泡過夜，經全自動石墨消解儀90 ℃熱浸提2.5 h，每0.5 h振搖1 min。提取完畢后，提取液冷卻至室溫，8000 r/min離心10 min，吸取上層清液，0.45 μm濾膜過濾后上機測定。同時按同一操作方法制備空白溶液。按2.1.1項下色譜條件進樣，按2.1.2項下條件檢測。

2.3 總砷測定

參考GB 5009.11-2014《食品安全國家標準 食品中總砷及無機砷的測定》中的原子熒光光譜法，稱取烘干粉碎后的中藥試樣1.0 g，置于坩堝中，加入硝酸鎂溶液，混勻，再加入1 g氧化鎂覆蓋樣品，于電爐上炭化至無黑煙后，移入550 ℃馬弗爐灰化4 h，待樣品冷卻后加入鹽酸溶液中和氧化鎂并溶解灰分，轉入25 ml量瓶中，加入2 ml硫脲-抗壞血酸溶液后定容至刻度，混勻放置后，按2.1.2項下條件測定總砷含量。

2.4 檢測條件的優化

2.4.1 前處理方法的優化 GB 5009.11-2014液相色譜-原子熒光光光譜法[10]測定無機砷中，樣品提取方式為90 ℃熱浸提2.5 h，每0.5 h振搖1 min，需在干燥箱加熱，手動振搖。采用全自動石墨消解儀，可自動設置程序完成升溫、每0.5 h振搖1 min以及降溫的整個過程，試驗結束后自動冷卻，自帶的特氟龍消解罐能四周加熱，保證受熱均勻，且無需人為操作。以當歸為對象，對比以往文獻中使用較多的60 ℃超聲加熱1 h[16]、90 ℃干燥箱熱浸提2.5 h及90 ℃全自動石墨消解儀提取2.5 h 3種提取方式，計算3種方式下提取出的砷的總量，結果見圖1。結果表明，60 ℃超聲加熱1 h提取效率最低，90 ℃干燥箱熱浸提及全自動石墨消解儀提取效果相當，由于全自動石墨消解儀操作方便，綜合考慮，選擇此種消解方式。

圖1 不同提取方式下的4種砷形態測定值

2.4.2 色譜柱的優化 試驗對比了兩種色譜柱，即Hamilton PRP-X100陰離子交換色譜柱（250 mm×4 mm）和Princen砷形態快速分析柱（150 mm×4 mm）對同一濃度的無機砷標準品的分析結果。結果顯示兩種色譜柱均能有效分離4種砷形態組分，但出峰時間差異較大。兩種色譜柱各組分的出峰時間對比見圖2。使用Hamilton PRP-X100陰離子交換色譜柱,4種砷形態出峰時間需近1200 s，分析時間較長，而使用Princen砷形態快速分析柱可將分析總時間控制在360 s內，可見Princen砷形態快速分析柱分析速度快，檢測效率高，且各組分分離良好。

圖2 兩種色譜柱各組分出峰時間對比

2.4.3 流動相的選擇 處理后樣品中的砷是以陰離子形態存在的，實驗應選擇陰離子交換色譜柱進行分離。基于國標方法，選擇磷酸鹽溶液作為流動相，流動相的pH值是決定分離效果的影響因素之一。由于經過前處理后的樣品溶液呈酸性，進入色譜柱會影響樣品的保留能力和分離度，為了中和樣品的酸性，選擇堿性的流動相可達到更好的分離效果，同時可延長色譜柱壽命。結果顯示，流動相的堿性較弱不利于峰的分離，若堿性過強（加入氨水調節pH值），則本底值上升。綜合考慮，確定流動相A：5 mmol/L磷酸氫二鉀+1 mmol/L硝酸銨，pH 10.9；流動相B：25 mmol/L磷酸氫二鉀+40 mmol/L硝酸銨，pH 9.2，采用梯度洗脫，保證良好的分離效果。

2.4.4 AFS檢測條件的優化

2.4.4.1 載流的濃度 實驗過程中，載流與硼氫化鉀反應生成氫氣，將三價砷還原成氣態氫化物，一般選擇鹽酸溶液。以20 μg/L混合標準溶液為考察對象，分別考察了3 %，4 %，5 %，6 %，7 %鹽酸溶液作為載流對待測物峰面積的影響，結果見圖3。鹽酸濃度為3 %時，4種待測物峰面積明顯偏低，隨著濃度增加，峰面積逐步上升，后趨于平衡，以6 %，7 %鹽酸為載流時的峰面積與以5 %鹽酸為載流時基本保持一致，證明5 %鹽酸溶液即可滿足要求，故實驗選擇5 %鹽酸溶液為載流。

圖3 鹽酸濃度對4種砷形態峰面積的影響

2.4.4.2 硼氫化鉀的濃度 確定用5 %鹽酸溶液作為載流后，以20 μg/L混合標準溶液為考察對象，分別考察了氫氧化鉀溶液濃度為0.5 %，以1 %，1.5 %，2 %，2.5 %，3 %硼氫化鉀溶液作為還原劑對峰面積的影響，結果見圖4。由圖4可見，隨著硼氫化鉀濃度的升高，4種砷形態的峰面積明顯增大，當濃度達1.5 %后，峰面積趨于平穩，說明1.5 %硼氫化鉀溶液即可滿足要求，故選擇1.5 %硼氫化鉀溶液為還原劑。

圖4 硼氫化鉀溶液濃度對4種砷形態峰面積的影響

2.5 方法學考察

2.5.1 專屬性實驗 分別吸取2.2.1項下4種砷形態混合標準溶液（1.0 μg/ml）及2.2.2項下陰性樣品溶液（空白溶液）、當歸樣品溶液各100 μl，按2.2項下方法進樣測定，色譜圖見圖5。結果表明，4種砷形態成分均達到基線分離，與其他成分間均無明顯干擾，表明檢測方法的專屬性良好。

圖5 專屬性實驗圖譜

2.5.2 線性范圍及相關系數 精確吸取一定體積的混合標準溶液，分別用0.15 mol/L硝酸溶液配制濃度為0，1.0，2.0，5.0，10.0，20.0，50.0 μg/L的系列標準溶液，按2.2項下方法檢測，記錄色譜圖。分別以4種砷形態的濃度（μg/L）為橫坐標，以其對應的峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。方法的線性方程和相關系數見表1。在選定的色譜條件下，標準曲線在1～50 μg/L范圍內線性良好，相關系數（r）均>0.999。

表1 方法的線性范圍、線性方程、檢出限及定量限

2.5.3 檢出限和定量限 采用逐級稀釋的方式，以3倍基線噪聲時砷形態的濃度為檢出限（S/N=3），以10倍基線噪聲時砷形態的濃度為定量限，結果見表1。實驗中如稱取固體樣品1.0 g，定容至20 ml時，As（III）、As（V）、DMA和MMA的檢出限依次為0.00370，0.00446，0.00156，0.00196 mg/kg，定量限依次為0.0123，0.0149，0.00520，0.00654 mg/kg。完全可滿足中藥樣品中無機砷的分析要求。

2.5.4 精密度和回收率試驗 精密稱取已測得砷含量的當歸樣品0.5 g，分別準確加入低、中、高3個濃度水平的4種砷形態混合標準溶液，根據已優化的實驗條件對加標樣品做回收率試驗，加標回收率范圍為96.7 %～101.9 %。每個濃度制備6個平行樣品，進行精密度試驗，計算相對標準偏差（RSD），結果見表2。結果表明方法的準確度和精密度均符合檢測要求。

表2 當歸樣品回收率及RSD值

2.5.5 穩定性實驗 取同一批當歸樣品，加入一定濃度的砷混合標準溶液，按2.2.2項下方法處理，置于4 ℃條件下，分別于0，2，4，6，8，12 h，按2.1.1項下色譜條件進樣，按2.1.2項下條件檢測。經測算，As（III）、As（V）、DMA、MMA峰面積RSD依次為2.1 %，1.9 %，0.9 %，1.6 %，表明樣品溶液在4 ℃條件下放置12 h基本穩定。

2.6 實際樣品分析

采用本方法測定市售的7種28批次的中藥材中的4種砷形態，同時測定其總砷含量，計算其無機砷含量與總砷含量的百分比。結果見表3。

由表3可見，各批次樣品均未檢出MMA，僅有黃芪和黃芩中的2批次檢出少量DMA，除了甘草1批次未檢出As（III）外，其余批次全部檢出As（III）和As（V），說明本次檢測的中藥材中砷形態主要以As（III）和As（V）存在，且As（V）含量均高于As（III），說明中藥樣品中的無機砷多以As（V）形式存在。2020年版《中華人民共和國藥典（一部）》[8]對中藥材的重金屬限量要求為砷≤2.0 mg/kg，通過檢測中藥材中的總砷含量，可看出此次檢測的中藥材中總砷均未超標，無機砷總量占總砷總量的比例為14 %～93 %，表明各樣品中不僅存在不同比例的As（III）和As（V），且有未能檢出的其他有機砷形態，但由于無機砷的危害遠大于有機砷，所以測定樣品中的無機砷即可表明中藥材的食用風險。

3 結論

本文采用液相色譜-氫化物發生-原子熒光光譜法測定中藥材中的4種砷形態。與GB5009.11-2014國標方法相比較，優化了前處理條件，選擇了操作更加簡便的全自動石墨消解儀，簡化了實驗操作步驟。同時優選出峰時間更快的Princen砷形態快速分析柱分離樣品，使樣品在360 s內完全分離，極大地縮短了樣品檢測時間，節約了試劑和人工成本。本方法檢出限低、靈敏度高，各待測組分回收率為96.7 %～101.9 %，RSD均小于3 %，說明方法重復性好，準確度和精密度均能滿足方法學要求。綜上，本方法在定量分析中藥材中As（III）、As（V）、DMA和MMA 4種砷形態中可取得令人滿意的結果，值得普及推廣。