甲鈷胺注射液有關物質檢驗方法研究

任萃文，陸 勇

（哈爾濱三聯藥業股份有限公司，黑龍江 哈爾濱 150025）

甲鈷胺注射液（規格：1 ml:0.5 mg）為治療周圍神經病類藥，主要適用于缺乏維生素B12引起的巨紅細胞性貧血的治療[1]。甲鈷胺注射液原研廠家為日本衛材株式會社，商品名為“彌可保”，規格為1 ml:0.5 mg，參比制劑為Eisai Co.,Ltd.在國內上市的原研藥品和衛材（中國）藥業有限公司的國外原研企業在中國境內生產的藥品。《中國藥典》2020年版收載了甲鈷胺和甲鈷胺注射液[2]，日本和韓國藥典收載了甲鈷胺質量標準[3-4]。本文對甲鈷胺注射液質量標準中有關物質的分析方法進行了研究和優化，以期為藥品研發人員提供參考。

1 甲鈷胺理化性質

甲鈷胺（mecobalamin），化學名稱：Coα-[α-（5,6-二甲基苯并咪唑基）]-Coβ-甲基鈷酰胺，分子式：C63H91CoN13O14P，分子量：1344.40。深紅色結晶或結晶性粉末，見光易分解；在水或乙醇中略溶，在乙腈、丙酮或乙醚中幾乎不溶。甲鈷胺原料具有引濕性；200 ℃左右變黑，240 ℃左右分解；水溶液（1→100）pH值約為6，解離常數pKa=2.7（測定法：紫外-可見分光光度法）。其結構見圖1。

圖1 甲鈷胺結構式

2 儀器與試藥

2.1 儀器

2695型高效液相色譜儀（美國沃特世公司）；MS205DU型電子分析天平（瑞士梅特勒公司）；SHH-200HWD-2型藥品高溫試驗箱（重慶市永生實驗儀器廠）；SHH-200DG型藥品強光穩定性試驗箱（重慶市永生實驗儀器廠）；FE28型酸度計（瑞士梅特勒公司）。

2.2 試藥

甲鈷胺對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100692-201805）；氰鈷胺對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100248-201705）；羥鈷胺對照品（批號：EP H1428000）；甲鈷胺注射液[哈爾濱三聯藥業股份有限公司，批號：200801，200802，200803，日本衛材株式會社，批號：170479，170674，衛材（中國）藥業有限公司，批號：190105A，190206A]；乙腈（色譜純，美國Fisher Chemical公司）。

3 方法與結果

3.1 色譜條件

色譜柱：Agela Venusil MP C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相A：含0.47 %己烷磺酸鈉的0.03 mol/L磷酸二氫鉀溶液（用磷酸或氫氧化鉀溶液調節pH至4.5）-乙腈（85:15），流動相B：乙腈，柱溫：40 ℃，流速：1.3 ml/min，波長：266 nm，進樣量：10 μl，洗脫梯度變化見表1。

表1 洗脫梯度表

3.2 溶液配制

3.2.1 甲鈷胺對照品溶液 取甲鈷胺對照品適量，精密稱定，加水溶解并稀釋制成每1 ml中含5 μg的溶液。

3.2.2 羥鈷胺對照品溶液 取羥鈷胺對照品適量，精密稱定，加水溶解并稀釋制成每1 ml水中約含羥鈷胺10 μg的溶液。

3.2.3 供試品溶液 取樣品5支，混勻。

3.2.4 系統適用性溶液 取氰鈷胺和羥鈷胺對照品適量，加水溶解并稀釋成每1 ml中含氰鈷胺、羥鈷胺各約25 μg的溶液。

3.3 系統適用性試驗

取系統適用性溶液，按3.1項下色譜條件進樣，記錄色譜圖。按氰鈷胺、羥鈷胺的順序出峰，氰鈷胺峰與羥鈷胺峰分離度大于3.0。

3.4 專屬性試驗

3.4.1 空白干擾試驗 取溶劑、空白輔料溶液、系統適用性溶液、甲鈷胺對照品溶液和供試品溶液，按3.1項下色譜條件進樣，記錄色譜圖。

3.4.2 酸降解試驗 取本品1 ml，加入1 mol/L鹽酸溶液100 μl，放置12 h，加入1 mol/L氫氧化鈉溶液100 μl中和，搖勻，作為酸破壞降解溶液。

3.4.3 堿降解試驗 取本品1 ml，加入1 mol/L氫氧化鈉溶液100 μl，放置12 h，加入1 mol/L鹽酸溶液100 μl中和，搖勻，作為堿破壞降解溶液。

3.4.4 氧化降解試驗 取本品1 ml，加入3 %過氧化氫溶液100 μl，劇烈振搖，放置10 h，作為氧化破壞降解溶液。

3.4.5 熱降解試驗 取本品，于100 ℃條件放置1 h后取出，放冷至室溫，作為熱破壞降解溶液。

3.4.6 光降解試驗 取本品，于5000 Lux光照條件下30 s后取出，作為光破壞降解溶液。

空白干擾試驗結果見圖2。由圖2可見，溶劑及空白輔料溶液對甲鈷胺、氰鈷胺和羥鈷胺均無干擾。強制降解試驗結果見圖3。由圖3可見，甲鈷胺注射液在酸、堿、氧化、高溫條件下均不穩定，在光照條件下極不穩定。產生的未知降解雜質均能與主峰及已知雜質得到良好的分離，專屬性良好。

圖2 空白干擾試驗圖譜

圖3 強制降解試驗圖譜

3.5 檢測限和定量限

分別取甲鈷胺和羥鈷胺對照品適量，用水定量逐級稀釋，以信噪比（S/N）=3時相應濃度為檢測限，以信噪比（S/N）=10時相應濃度為定量限。結果本品甲鈷胺和羥鈷胺的檢測限均為0.5 ng，定量限分別為1.7 ng和1.6 ng。

3.6 線性試驗

取甲鈷胺對照品貯備液（濃度：0.5 mg/ml）和羥鈷胺對照品儲備液（濃度：1.0 mg/ml），精密量取各對照品儲備液適量，分別梯度稀釋成甲鈷胺濃度為0.2，1.0，2.0，5.0，10 μg/ml，羥鈷胺濃度為0.2，2.0，5.0，10.0，20 μg/ml的系列溶液，以質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，進行線性回歸。甲鈷胺回歸方程為y=0.1199x-0.003，r=0.9999，羥鈷胺回歸方程為y=0.0875x-0.005，r=1，表明甲鈷胺在0.2～10 μg/ml，羥鈷胺在0.2～20 μg/ml濃度范圍內線性關系良好。

3.7 精密度試驗

取供試品溶液，連續進樣6針，羥鈷胺峰面積RSD為0.5 %，甲鈷胺峰面積RSD為1.2 %，表明儀器精密度良好。

3.8 重復性試驗

取6份供試品溶液，重復進樣，羥鈷胺含量RSD為0.3 %，最大單個雜質含量RSD為0.6 %，總雜質含量RSD為0.2 %。

3.9 中間精密度試驗

不同實驗人員于不同日期，在不同儀器上進行重復性試驗，12份供試品羥鈷胺含量RSD為2.9 %，最大單個雜質含量RSD為1.5 %，總雜質含量RSD為3.1 %。

3.10 回收率

取本品，加入羥鈷胺對照品使其含量分別為限度濃度的20 %，100 %，150 %，平行配制3份，分別進樣，計算回收率，結果見表2。

表2 回收率檢測結果

3.11 溶液穩定性和耐用性試驗

供試品溶液在室溫避光放置48 h后與0 h相比，各雜質含量的相對偏差均小于2.0 %。波長變化±2 nm、柱溫變化±5 ℃、流速變化±0.2 ml/min、流動相中磷酸鹽濃度變化±0.01 mol/L和不同批號色譜柱條件下，系統適用性溶液中氰鈷胺峰與羥鈷胺峰分離度均大于3.0；與標準條件比較，供試品溶液各雜質含量變化相對偏差均在5 %以內，表明方法的耐用性好。

3.12 有關物質檢測

測定3家企業的7批樣品有關物質，自制樣品質量水平均不低于參比制劑，結果見表3。

表3 不同廠家、不同批次樣品有關物質檢測結果/%

4 討論

4.1 洗脫方法

對比分析韓國藥典、日本藥典、中國藥典及文獻[5]所使用的有關物質檢測方法，主要區別于在檢測波長和流動相系統。中國藥典采用的檢測波長是342 nm，日本和韓國藥典采用的是266 nm；流動相均采用了磷酸鹽和乙腈體系，日本和韓國另加入了離子對試劑。經實驗證實，流動相中離子對試劑對氰鈷胺、羥鈷胺的洗脫和分離影響較大，氰鈷胺、羥鈷胺使用低有機相比例的流動相分離度較好，但甲鈷胺在低有機相比例中保留明顯增強，整個檢測時間延長。因此，為了使各雜質能夠有效分離，溶劑和空白輔料不干擾測定，同時確保雜質檢出的靈敏度，在國內外藥典檢測方法基礎上，設計梯度洗脫，最終確定優化的色譜條件。

4.2 檢測波長

對甲鈷胺對照品溶液、氰鈷胺對照品溶液、羥鈷胺對照品溶液在190 nm～400 nm波長掃描。結果，甲鈷胺最大吸收波長為266 nm和342 nm，氰鈷胺最大吸收波長為278 nm和360 nm，羥鈷胺最大吸收波長為274 nm和350 nm。對經強光、高溫和氧化強降解后的自制樣品和參比制劑分別采用DAD全波長掃描，參照各國標準中有關物質檢測波長，提取266 nm和342 nm波長的檢測數據。已知雜質氰鈷胺在強降解條件下變化不大，已知雜質羥鈷胺342 nm檢出量優于266 nm，未知雜質266 nm的檢出總量及檢出個數優于342 nm，自制樣品與參比制劑結果基本一致，故選擇266 nm作為有關物質檢測波長，數據結果見表4。

表4 強降解后樣品考察結果

4.3 色譜柱對雜質檢出的影響

本試驗分別對GL Sciences Inertsil ODS-3v（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Waters xselect@HSS T3（250 mm×4.6 mm，5 μm）、OMNI Orca C18-AB（250 mm×4.6 mm，5 μm）3個廠家的色譜柱分離及檢出效果進行考察，見圖4。結果顯示，不同品牌和型號的色譜柱對雜質的分離度及雜質的檢出量影響較大，系統適用性測試需關注不同色譜柱的影響。

圖4 不同廠家色譜柱HPLC圖譜比較

4.4 各雜質限度

制劑的降解產物會影響產品的安全性，必須依據藥典、ICH要求及參比制劑質量進行控制，以減少對患者的影響。產品中每種雜質及總雜質限度更應基于參比制劑質量進行設定[6]。已知雜質羥鈷胺是甲鈷胺注射液中的主要降解產物，本法設定的266 nm波長并非為羥鈷胺的最大吸收波長，為了能更準確地控制該雜質，采用外標法進行計算，羥鈷胺限度為不大于2.0 %；參照多批樣品穩定性考察結果，制定其他單個雜質不大于0.5 %、總雜質不大于2.5 %，限度嚴于國家標準。

5 小結

本文對甲鈷胺注射液有關物質分析方法從洗脫方法、檢測波長、色譜柱選擇等方面進行優化研究，并進行了方法學驗證，采用建立的新方法對多批產品進行分析，并與參比制劑進行質量對比，科學合理地制定了雜質的計算方法和限度，提高了產品質量，以保證患者的用藥安全。