HPLC與UPLC-MS/MS測定FAPAS液體維生素補充劑能力驗證樣品中的維生素B1

楊 黎，文 麗，韋春夢，江秋霞，劉 星

（1.廣西-東盟食品檢驗檢測中心，廣西 南寧 530025；2.廣西壯族自治區食品藥品檢驗所，廣西 南寧 530021）

維生素B1又稱硫胺素，具有維持人體正常糖代謝的作用，是糖類代謝酶的組成成分[1]，在人體內不能合成，需通過外界間接獲取或直接補充[2-3]，常作為添加劑制成保健食品。為驗證實驗室檢測保健食品中維生素B1的能力，我們參加了此次英國FAPAS（Food Analysis Performance Assessment Scheme）分析實驗室能力驗證工作。

維生素B1的檢測技術報道較多，主要包括紫外-可見分光光度法[4-5]、高效液相色譜（HPLC）-紫外檢測法[6-8]、HPLC-熒光檢測法[9]、HPLC-質譜（MS）聯用方法[10-11]等。本研究試驗對象是FAPAS國際能力驗證樣品，不指定檢驗方法。目前國內檢測維生素B1的標準主要有GB/T 5009.197-2003《保健食品中鹽酸硫胺素、鹽酸吡哆醇、煙酸、煙酰胺和咖啡因的測定》[6]，GB 5009.84-2016《食品安全國家標準 食品中維生素B1的測定》[9]。基于樣品分析國標檢測方法，GB/T 5009.197-2003直接用甲醇-水-磷酸混合溶液稀釋樣品后進行檢測，無水解和酶解過程，如樣品中含結合態維生素B1有可能提取不完全；GB 5009.84-2016第一法HPLC法需衍生后用熒光檢測器進行檢測，實驗過程長且衍生化合物穩定時間短，當有其他熒光物質干擾時可能影響檢測準確性；而質譜檢測器在靈敏性、準確度和選擇性等方面具有明顯優勢。綜上，在國標的基礎上優化了前處理方法，同時采用HPLC-紫外檢測和超高效液相色譜-質譜/質譜（UPLC-MS/MS）兩種方法進行檢測，并比較結果。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Waters 2890高效液相色譜儀（帶DAD檢測器，美國Waters公司）；Waters H-CLASS/XEVO TQD三重四極桿液質聯用儀（美國Waters公司）；X3R高速冷凍離心機（美國Thermo Fisher公司）；Milli-Q超純水機（美國密理博公司）；Mettler Toledo XS205DU電子天平（十萬分之一，瑞士梅特勒-托利多公司）；S300H超聲波清洗器（德國Elmasonic公司）。

1.2 材料

液體維生素補充劑樣品（由FAPAS實驗室提供），樣品冷藏存放，測試前按作業指導書放置到常溫并充分搖勻。維生素B1標準物質（純度：98.6 %，CAS：67-03-8，BePure公司，使用前105 ℃干燥4 h）；硫酸月桂酯鈉，正丁醇，甲醇，乙腈（色譜純，德國默克公司）；鐵氰化鉀，氫氧化鈉，鹽酸，乙酸鈉，冰乙酸（分析純，廣東光華）；木瓜蛋白酶（德國默克公司，酶活力≥1500 U/mg）；淀粉酶（德國默克公司，酶活力≥3700 U/g）；超純水（電阻率：18.2 MΩ·cm）。

2 方法

2.1 HPLC

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Atlantis T3色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：1 %硫酸月桂酯鈉（含0.1 %磷酸）溶液:乙腈=58:42；流速1.0 ml/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：260 nm；進樣量：10 μl；等度洗脫。

2.1.2 標準溶液的配制 精密稱取25 mg維生素B1標準物質，置于25 ml量瓶中，加水溶解，定容，搖勻，配制質量濃度為1 mg/ml的標準儲備溶液。然后以甲醇-水-磷酸（100:400:0.5）為溶劑，配制維生素B1質量濃度分別為0.2，0.5，1.0，2.0，5.0，10.0 μg/ml的標準系列工作溶液。

2.1.3 供試液的制備 稱取1.00 g搖勻的試樣，置于100 ml具塞三角瓶中，加入0.1 mol/L鹽酸溶液60 ml，充分搖勻，塞上軟質塞子，高壓滅菌鍋中121 ℃保持30 min進行水解，水解結束，冷卻至40 ℃以下，取出，輕搖數次；然后用2.0 mol/L乙酸鈉溶液調節pH至4.0，加入混合酶溶液2.0 ml，搖勻，置于培養箱中37 ℃過夜酶解（酶解時間16 h）。將酶解液全部轉移至100 ml量瓶中，用水定容至刻度，搖勻，離心，0.45 μm濾膜過濾，待進樣。

2.1.4 加標回收試驗 稱取1.00 g樣品，加入一定量的維生素B1標準溶液，按2.1.3項下方法處理，測定回收率，計算相對標準偏差（RSD）。

2.2 UPLC-MS/MS

2.2.1 色譜條件 色譜柱為ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），流動相：A為0.2 %甲酸水溶液，B為甲醇；流速：0.3 ml/min；柱溫：30 ℃；梯度洗脫程序：0～1 min，100 %A，1～3 min，100 %A～5 %A，3～5 min，5 %A～50 %A，5～6 min，50 %A，6～7 min，50 %A～100 %A，7～11 min，100 %A；進樣量：4 μl。

2.2.2 質譜條件 采用ESI源；正離子模式，多反應監測（MRM）；毛細管電壓：1.2 kV，離子源溫度：150 ℃，脫溶劑溫度：500 ℃，脫溶劑氣流速：1000 L/h，錐孔氣流速：150 L/h，碰撞氣（氬氣）流速：0.15 ml/min。

2.2.3 標準溶液的配制 精密稱取25 mg維生素B1標準物質，置于25 ml量瓶中，加0.01 mol/L鹽酸溶液溶解并定容，搖勻，配制質量濃度為1.0 mg/ml的標準儲備溶液。準確移取1.00 ml標準儲備液，用水稀釋并定容至100 ml，搖勻，配制質量濃度為10.0 μg/ml的標準中間液，臨用現配。然后吸取一定量的標準中間液，配制維生素B1質量濃度為10，50，75，100，200 ng/ml的標準系列工作溶液。

2.2.4 供試品溶液的制備 精密吸取2.1.3項下供試品溶液2.0 ml至10 ml量瓶，加水定容，0.22 μm濾膜過濾，待進樣。

3 結果與討論

3.1 HPLC流動相的優化

首先參照標準GB/T 5009.197-2003[6]，使用流動相硫酸月桂酯鈉溶液（5 g→530 ml）-乙腈-磷酸（530:470:1），結果采用此流動相，維生素B1色譜峰峰展寬且吸收響應低；更換流動相比例，流動相改為1 %硫酸月桂酯鈉（含0.1 %磷酸）溶液-乙腈（58:42），增加水相比例后的色譜峰峰形對稱，響應值顯著提高，且目標化合物附近沒有干擾峰，見圖1。

圖1 標準溶液和供試品溶液色譜圖

3.2 UPLC-MS/MS質譜條件優化

在ESI正、負離子模式下，對維生素B1標準溶液（濃度100 ng/ml）進行母離子掃描，維生素B1在正離子模式下質譜信號強，確定正離子模式掃描；然后在子離子掃描模式下，通過施加一定碰撞能量，使維生素B1母離子碎裂產生子離子，獲取子離子信息，并對毛細管電壓、離子源溫度、脫溶劑溫度、脫溶劑氣流速、錐孔氣流速、碰撞氣（氬氣）流速、錐孔電壓、碰撞能量等質譜參數進行了優化，以強度最大的子離子作為定量離子，以強度稍小的子離子作為定性離子。優化后的質譜檢測參數見表1。

表1 目標化合物的質譜參數

3.3 UPLC-MS/MS色譜條件優化

維生素B1是極性較強的化合物，在一般的C18反相色譜柱上的保留能力差，HPLC中使用的離子對試劑不適合質譜檢測系統。本方法選擇對極性化合物的保留顯著增強的HSS T3色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），使維生素B1得到了有效的保留和分離，提取離子色譜圖見圖2。

圖2 維生素B1的MRM色譜圖

3.4 標準曲線

將標準工作溶液按優化后的色譜條件進樣分析，以質量濃度為橫坐標，峰響應值為縱坐標繪制標準曲線，見表2。結果表明，兩種方法的線性關系均良好。

表2 兩種方法的線性參數表

3.5 樣品檢測方法的選擇

樣品為國際能力驗證樣品，未指定檢驗方法，分析現行國標檢測方法：GB/T 5009.197-2003直接用甲醇-水-磷酸混合溶液稀釋樣品后進行檢測，無水解和酶解過程，如果樣品中含結合態維生素B1，可能提取不完全；GB 5009.84-2016第一法HPLC法樣品溶液需衍生后用熒光檢測器進行檢測，實驗過程長且衍生化合物穩定時間短，當有其他熒光物質干擾時可能影響檢測準確性；液相色譜-紫外檢測器檢測樣品中維生素B1不需要進行衍生，實驗過程簡便快捷，質譜檢測器在靈敏性、準確度和選擇性等方面具有明顯優勢，能對目標化合物進行準確定性。綜上，在國標方法的基礎上優化了前處理方法，參照GB 5009.84-2016《食品安全國家標準 食品中維生素B1的測定》[9]中試液提取方法進行樣品提取，舍棄后續衍生后用熒光檢測器進行檢測的方法，采用HPLC-紫外檢測和UPLC-MS/MS兩種方法進行檢測，兩種方法的測試結果見表3。由表3可見，兩種方法的檢測結果無顯著差異。

表3 兩種方法樣品中維生素B1的含量檢測結果（n=4）

3.6 加樣回收率

為了驗證兩種方法的準確性，進行了加樣回收率的測定，結果見表4。HPLC加標回收率為97.48 %～99.55 %，RSD為0.9 %，UPLC-MS/MS加標回收率為100.43 %～104.33 %，RSD為1.8 %，結果見表4。由表4可見，兩種方法加樣回收率高，精密度好，表明選擇的方法準確、可靠。

表4 兩種檢測方法加樣回收率考察結果（n=4）

3.7 結果上報

按上述結果，最后上報兩法的平均值7.49 mg/100 g。本次FAPAS比對，共30個實驗室提交維生素B1的數據，30個數據的中位值為7.74 mg/100 g，上報的數據Z值為-0.4，結果為“滿意”（“滿意”要求∣Z∣≤2），表明本文方法科學、可靠。

4 結論

本研究建立了HPLC和UPLC-MS/MS法同時測定FAPAS液體維生素補充劑能力驗證樣品中維生素補品中的維生素B1含量，最后上報數值獲得“滿意”結果。方法對現行國標做了一定創新和改進，經過驗證結果準確可靠，具有一定的應用推廣價值。