外源水楊酸對低溫脅迫下火龍果幼苗的形態及生理效應

李 雪, 吳楊婧雯, 俞 超*, 周 卉, 徐 欣, 汪財生, 郭 斌

(1. 浙江萬里學院 生物與環境學院, 浙江 寧波 315100; 2. 寧波傳奇農業科技有限公司, 浙江 寧波 315100 )

火龍果(Hylocereusundatus)是仙人掌科量天尺屬植物,果實富含植物性蛋白、膳食纖維和維生素等營養物質,具有潤腸通便、降血糖血壓、預防腫瘤等藥用功效,深受廣大消費者和種植者的喜愛?；瘕埞a于中美洲地區,廣泛引種于我國廣西、廣東、浙江等多個地區(喬謙等,2020)。每年冬春季節,我國火龍果、香蕉、蓮霧等(魏秀清等,2016;Wang et al., 2018;李丹等,2019)冷敏感果樹種植區常會遭受寒潮侵襲,低溫冷害或凍害導致果實減產,果農經濟損失慘重。近年來,異常低溫情況常有發生,溫度限制了火龍果種植區域向北方拓展的趨勢(劉濤等,2016)。因此,如何提高火龍果抗寒性是目前理論研究和生產實踐上亟待解決的問題。

植物的抗寒性與細胞膜透性、細胞中滲透調節物含量、抗氧化酶活性密切相關。低溫會引起植物細胞活性氧代謝紊亂,細胞膜脂過氧化加劇,細胞內電解質大量外滲,造成植物低溫傷害。目前,火龍果缺乏耐低溫的品種,提高火龍果現有品種的抗寒性大都采用“低溫馴化”的方式,利用人工逐級降溫進行火龍果低溫適應鍛煉,慢慢增強其抗性,并測定滲透調節物含量、抗氧化酶活性等相關生理指標判斷其抗寒性是否提高。有研究發現,將火龍果幼苗或一年枝條逐級降溫處理后,細胞中水分和葉綠素的含量降低,過氧化物酶、超氧化物酶的活性增強,可溶性蛋白以及脯氨酸的含量均呈現升高的趨勢,抗寒性提升效果明顯(張慧君和梁亞靈,2017;Zhou et al., 2021)。此外,也有學者嘗試了物理方法,用38.5～42.4 Gy 劑量的60Co γ 輻照離體火龍果幼苗,其相對電導率和丙二醛含量均減少,抗氧化酶活性與可溶性糖等滲透調節物質含量均增加,火龍果抗寒性得以提高(鄧仁菊等,2018)。

施加外源天然物質能提高抗氧化酶活性和滲透調節物含量,緩解細胞氧化損傷,是提高植物抗寒性較為高效且安全的方法(Aghdam et al., 2019;Tang et al.,2021)。水楊酸(salicylic acid,SA)作為植物內的一種酚類化合物,不僅參與調節植物的種子萌發、生長、結果和衰老等多種生理生化過程,而且作為啟動植物體防御機制的信號分子,能激活植物免疫機制、抵抗外源病原體,緩解生物和非生物脅迫引起的傷害(Miura &Tada, 2014)。0.5、1 mmol·L-1SA處理能夠通過提高玉米植株的光合作用和抗氧化酶活性,從而提高其抗寒性(Ning et al., 2022)。0.5 mmol·L-1外源SA噴施處理提高了低溫脅迫下鐵皮石斛幼苗超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、過氧化物酶和抗壞血酸過氧化物酶的活性及根系活力(陳明輝等,2017)。0.1～0.3 mg·L-1外源SA處理有利于提高低溫下紅景天幼苗葉片葉綠體膜的Ca2+-ATP酶和Mg2+-ATP酶的活性,增強植株光合作用,同時,SA通過提高植株抗氧化酶活性,有效緩解膜脂過氧化,降低丙二醛含量,減輕低溫脅迫對植物細胞的傷害(Ma et al., 2016)。

在浙江及更高緯度的地區,如何讓火龍果安全越冬是栽培成功的關鍵。以浙江省寧波市為例,12—1月的平均氣溫為3.8 ℃,5 ℃以下冷害會造成火龍果嫩枝發黃干枯直至整株死亡,極大地影響火龍果的品質及產量。尋找低成本、安全有效、操作方便的外源誘導劑,是緩解低溫脅迫、提高火龍果的抗冷性的解決途徑。外源物質與火龍果抗冷性相關的研究較少,僅有1篇外源噴施硝酸鈣可以提高火龍果幼苗抗低溫能力(王立娟等,2021)的報道,而外源SA處理是否可以提高火龍果抗冷性以及不同SA濃度的效果是否存在差異等尚不清楚。本研究以火龍果幼苗為材料,開展4 ℃低溫脅迫處理,分析外源 SA對火龍果幼苗冷害癥狀的調節效果,闡明不同濃度外源 SA對低溫脅迫下火龍果幼苗的抗氧化酶活性、滲透調節物等生理指標的影響,以期獲得提高火龍果幼苗抗冷性的外源 SA適宜濃度,為火龍果抗冷性栽培提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料

火龍果品種為‘紫紅龍’,來源于寧波綠苑火龍果種植基地,結果枝為3年生枝條,生長狀況良好,枝條平直、粗壯、呈深綠色,自然成熟果實呈圓形,果皮和鱗片呈紅色,果肉紫紅色,平均單果重330 kg,種子黑色。

1.2 實驗方法

1.2.1 低溫脅迫試驗 參考孫玉珺等(2018)的方法?；瘕埞N子經0.5%次氯酸鈉溶液消毒5 min后,無菌水洗凈,25 ℃催芽7 d,將萌發(以種子露白,胚根長度≥2 mm為準)時間一致的幼苗播種至基質(營養土和蛭石配比為1∶1)中進行光照培養,培養溫度25 ℃,光照時間12 h,光照強度250 μmol·m-2·s-1,相對濕度80%～85%。每個育苗盆種15株幼苗。待火龍果幼苗光照生長至38 d時,開始以下處理,每種處理各25盆。

(1)SA處理組:對幼苗葉面及葉背分別噴施濃度為0.1、0.3、0.5、0.7 mmol·L-1的SA溶液(組號分別為SA1、SA2、SA3、SA4),每隔12 h噴施1次,共噴施4次,每株每次噴施量為1 mL,處理48 h后,于4 ℃低溫脅迫12 d,其間,0、3、6、9、12 d 時各取5盆,觀察、統計并測定各項生理生化指標。

(2)低溫對照(CS)組:噴施等量蒸餾水,其他同SA處理組。

(3)常溫對照(CK)組:噴施等量蒸餾水,于25 ℃常溫培養,其他同SA處理組。

1.2.2 生理生化指標測定 相對電導率(relative electrical conductivity, REC)、可溶性糖(soluble sugar, SS)和可溶性蛋白(soluble protein, SP)的含量測定分別采用浸泡法(曹群陽等,2022)、蒽酮比色法(李合生,2000)、考馬斯亮藍G-250染色法(張志良和瞿偉菁,2003)進行;丙二醛(malondialdehyde, MDA)、脯氨酸(proline, Pro)的含量和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、過氧化物酶(peroxidase, POD)、過氧化氫酶(catalase, CAT)、谷胱甘肽 S-轉移酶(glutathipne S-transferase, GST)的活性測定參照試劑盒說明書。每個處理各項指標均重復3次,各項生理指標重量單位均以鮮重(g)表示。

1.2.3 石蠟切片制作及形態觀察 幼苗形態及葉片表面顯微結構觀察:分別于低溫脅迫第0、第3、第6、第9、第12天上午8:00對幼苗形態進行拍照記錄,并使用光學顯微鏡觀察葉片表面顯微結構,每個處理重復3次。

葉片橫切面顯微結構觀察:分別于低溫脅迫第0、第3、第6、第9、第12天上午8:00取樣,在距火龍果幼苗莖部2 mm處用手術刀切取葉片,立即投入FAA固定液(90 mL 70%乙醇+5 mL冰醋酸+5 mL福爾馬林)中,參考張珍珠等(2021)的方法進行石蠟切片制作,每個處理重復3次。

1.2.4 數據分析 采用Excel 2019統計軟件對試驗數據進行整理,SPSS 25.0軟件(Duncan法)進行方差分析,Origin 9.0 軟件繪圖,不同字母表示各試驗差異顯著(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 外源SA對低溫脅迫下火龍果幼苗寒害癥狀的影響

由圖1可知,按葉片表觀及細胞形態將火龍果幼苗葉片低溫冷害癥狀的等級劃分為0級、Ⅰ級和Ⅱ級。0級癥狀的葉片肥厚、飽滿、光滑、呈現綠色(圖1:A);葉綠素均勻分布、細胞邊緣清晰、氣孔明顯(圖1:D);角質層完整、細胞排列緊密、水分充足(圖1:G)。Ⅰ級癥狀的葉片發軟下垂、水化、失綠發黃(圖1:B);少量葉綠素被分解、細胞邊緣較模糊、表皮皺縮不明顯(圖1:E);角質層變薄、部分角質層破損、細胞輕微失水(圖1:H)。Ⅱ級癥狀的葉片發蔫發軟、干癟下垂、失綠變白、表皮皺縮(圖1:C);大量葉綠素被分解、細胞邊緣極其模糊、表皮皺縮嚴重(圖1:F);角質層嚴重破損、細胞失水變形破損嚴重、排列紊亂、細胞間隙變大(圖1:I) 。低溫脅迫期間,SA處理組幼苗出現Ⅰ級冷害癥狀和Ⅱ級冷害癥狀的株數百分率均明顯少于CS組;SA處理組中,SA2出現Ⅰ級冷害癥狀和Ⅱ級冷害癥狀的株數百分率最少(圖2)。低溫脅迫第6、第9、第12天,與CS組相比,SA2處理組0級冷害癥狀幼苗株數百分率分別增加了26.76%、92.65%、284.76%。這表明SA噴施處理能有效緩解火龍果幼苗的冷害癥狀,SA2處理濃度效果最好。

A. 0級冷害癥狀的幼苗; B. Ⅰ級冷害癥狀的幼苗; C. Ⅱ級冷害癥狀的幼苗; D. 0級冷害癥狀的幼苗葉片顯微結構; E. Ⅰ級冷害癥狀的幼苗葉片顯微結構; F. Ⅱ級冷害癥狀的幼苗葉片顯微結構; G. 0級冷害的幼苗葉片橫切面顯微結構; H. Ⅰ級冷害癥狀的幼苗葉片橫切面顯微結構; I. Ⅱ級冷害癥狀的幼苗葉片橫切面顯微結構; 1. 氣孔; 2. 皺縮的表皮; 3. 角質層; 4. 表皮細胞; 5. 維管組織; 6. 儲水組織。A. Seedlings with Grade 0 chilling injury; B. Seedlings with Grade Ⅰ chilling injury; C. Seedlings with Grade Ⅱ chilling injury; D. Leaf microstructure of seedlings with Grade 0 chilling injury; E. Leaf microstructure of seedlings with Grade Ⅰ chilling injury; F. Leaf microstructure of seedlings with Grade Ⅱ chilling injury; G. Leaf cross-section microstructure of seedlings with Grade 0 chilling injury; H. Leaf cross-section microstructure of seedlings with Grade Ⅰ chilling injury; I. Leaf cross-section microstructure of seedlings with Grade Ⅱ chilling injury; 1. Stomata; 2. Wrinkled epidermis; 3. Stratum corneum; 4. Epidermal cells; 5. Vascular tissue; 6. Water storage tissue.圖1 低溫脅迫下3個冷害癥狀等級的火龍果幼苗形態和葉片顯微結構Fig. 1 Morphology and leaf microstructure of pitaya seedlings with three chilling injury grades under low temperature stress

2.2 外源SA對低溫脅迫下火龍果幼苗葉片REC和MDA含量的影響

由圖3可知,低溫脅迫3～12 d的CS組葉片中REC和MDA含量均顯著高于常溫培養CK組,并且低溫脅迫時間越長,CS組葉片中REC和MDA的含量越高。低溫脅迫3 d后,SA處理組葉片中REC和MDA含量均低于CS組,并且隨著SA濃度的增加先降后升;SA2組葉片中REC和MDA含量均顯著低于其他SA處理組。這表明SA噴施處理能顯著降低低溫脅迫下火龍果幼苗葉片的REC和MDA含量,SA2處理效果最好。

橫坐標除CK組為25 ℃常溫培養時間外,其余組均為低溫處理時間,不同字母表示各試驗組間差異顯著(P<0.05),下同。The abscissa is the time of low temperature stress except for the CK group, which is the incubation time at 25 ℃. The same below.圖3 SA對低溫脅迫下火龍果幼苗葉片相對電導率和丙二醛含量的影響Fig. 3 Effects of SA on REC and MDA content in leaves of pitaya seedlings under low temperature stress

2.3 外源SA對低溫脅迫下火龍果幼苗葉片抗氧化酶活性的影響

由圖4可知,CS組葉片中CAT、GST、SOD的活性分別在低溫脅迫3、6、9 d開始顯著低于常溫培養CK組;CS組葉片中POD活性在脅迫第3、第12天顯著低于CK組。隨著低溫脅迫時間的延長,CS組火龍果幼苗葉片中SOD、POD、GST的活性先升后降,CAT活性一直下降。

圖4 SA對低溫脅迫下火龍果幼苗葉片SOD、POD、CAT和GST活性的影響Fig. 4 Effects of SA on SOD, POD, CAT and GST activities in leaves of pitaya seedlings under low temperature stress

低溫脅迫3 d后,SA處理組葉片中SOD、POD、CAT和GST的活性均高于CS組,并且隨著SA濃度的增加均先升后降;SA2組SOD、GST的活性均顯著高于其他SA處理組,SA1組POD活性顯著高于其他SA處理組,SA3組CAT活性顯著高于其他SA處理組。這表明SA噴施處理能顯著提高低溫脅迫下火龍果幼苗葉片的SOD、POD、CAT和GST的活性,SA2處理對提高SOD和GST的活性效果最好,SA1與SA3處理分別對提高POD與CAT的活性效果最好。

2.4 外源SA對低溫脅迫下火龍果幼苗葉片滲透調節物質含量的影響

由圖5可知,低溫脅迫3～9 d,CS組葉片中SS、Pro的含量均顯著高于常溫培養CK組;低溫脅迫3～12 d,CS組SP含量均顯著低于CS組。隨著低溫脅迫時間的延長,火龍果幼苗葉片中SS和Pro的含量均先升后降,SP含量呈“N”型變化。

圖5 SA對低溫脅迫下火龍果幼苗葉片SS、Pro和SP含量的影響Fig. 5 Effects of SA on SS, Pro and SP contents in leaves of pitaya seedlings under low temperature stress

低溫脅迫3 d后,SA處理組葉片中SS、SP和Pro的含量均高于CS組,并且隨著SA濃度的增加,SS和Pro的含量均先升后降,SP含量一直上升;SA2組SS、Pro的含量均顯著高于其他SA處理組;SA4組SP含量均顯著高于其他SA處理組。這表明SA噴施處理能顯著提高低溫脅迫下火龍果幼苗葉片中SS、Pro和SP的含量,SA2處理對提高SS和Pro的含量效果最好,SA4處理對提高SP含量效果最好。

3 討論

火龍果種子萌發后,在莖發育完全之前的幼苗期,葉為植株提供營養和水分,是感受溫度、光照等環境條件變化的重要器官(龍海燕和鄧倫秀,2019)。葉橫切面顯微結構顯示,火龍果幼苗葉片由角質層、表皮細胞、維管組織、儲水組織構成。角質層是疏水性脂質保水層, 在植物響應和適應各脅迫中起關鍵作用(Bernard &Joubès, 2013)。本研究低溫脅迫導致火龍果幼苗葉片的角質層變薄,細胞失水大于吸水,葉肉各組織結構受損,葉片出現發軟下垂等現象;隨冷害程度加深,細胞膜選擇透性增加,內容物大量外滲,各組織細胞邊界不清晰,葉綠體嚴重破壞、葉綠素含量下降,葉片出現明顯發軟下垂、皺縮變白等現象,這與胡椒(伍寶朵等,2018)、番木瓜(王小媚等,2016)、油菜(何俊平等,2017)等的研究結果相一致。適宜濃度的外源SA可以緩解冷害引起的火龍果幼苗葉片細胞損傷,減少Ⅰ級和Ⅱ級冷害癥狀火龍果幼苗的百分率,其原因可能是SA通過增強細胞壁機械強度、改變細胞膜流動性、調節細胞內滲透壓等途徑維持細胞結構完整,其作用機理需要進一步深入研究。

各種非生物脅迫會導致植物細胞內積累大量活性氧,如O2-和H2O2,活性氧易引起膜脂過氧化、蛋白質氧化和DNA損傷,從而影響許多細胞功能(Gill &Tuteja, 2010)。MDA是膜脂過氧化的產物之一,可作為反映質膜傷害程度的重要指標(程秋如等,2022)。本研究低溫脅迫下火龍果幼苗葉片中MDA大量積累,細胞內電解質大量外滲,REC顯著上升,而外源SA噴施處理可降低葉片MDA含量和REC,與Zhang等(2021)的研究結果相似。原因可能在于,低溫脅迫打破了細胞代謝過程中氧自由基反應和脂質過氧化反應之間的平衡導致質膜受損,質膜由彈性液晶態轉變為固體凝膠態,流動性和通透性下降,細胞內電解質滲出。而外源SA能提高質膜中不飽和脂肪酸的含量和脂肪酸不飽和指數,顯著緩解低溫導致的質膜損傷,以保持細胞的整體結構(張翔等,2020)。需注意的是,要選擇合適濃度的外源SA,才能達到較好的抗冷效果,低濃度SA能清除活性氧,抑制膜脂過氧化,保證細胞膜代謝的穩定性和結構的完整性,而高濃度SA可能會影響細胞膜的正常功能,對細胞產生毒害作用。

為了減少細胞受到的氧化損傷,植物具有調控活性氧代謝平衡的抗氧化防御系統,包括抗氧化酶和非酶類抗氧化物,以提高植物的抗逆性(Hasanuzzaman et al., 2020)。與植物抗逆性相關的抗氧化酶類有SOD、POD、CAT、GST等,SOD是植物細胞抗氧化酶防御系統的第一道防線,將O2-轉化為H2O2,CAT和POD把H2O2分解為H2O和O2,GST則催化H2O2生成氧化型谷胱甘肽和H2O (張雪等,2017;Elsayed et al., 2019)。本研究發現,低溫脅迫對火龍果幼苗葉片CAT活性抑制作用最明顯,而SOD、POD、GST的活性則出現先揚后抑的現象。原因可能在于4 ℃低溫脅迫并不能激發火龍果幼苗葉片中所有抗氧化酶的防御功能,只有SOD、POD、GST能正響應低溫信號,增加其活性以抵御氧化損傷;但長時間的低溫會造成大量活性氧不能被及時清除,體內抗氧化系統發生紊亂,激發的酶活性又被逐漸抑制,植株只能表現出短期的抗冷性。本研究中,較低濃度的外源SA處理促進SOD、POD、CAT和GST的活性,但較高濃度的SA促進效果不明顯,且增強這4種酶活的最佳SA濃度不同,這與冬小麥的研究結果相似(Wang et al., 2021)。這說明SA濃度對抗氧化酶活性的影響較大,推測與抗氧化酶的活性調節機制有關,低溫脅迫下SA誘導抗氧化系統是一種級聯反應,脫落酸(ABA)、細胞溶質Ca2+、活性氧(ROS)等第二信使參與其中,其作用可能具有組織特異性和劑量依賴性。

SS、SP和Pro是植物體內重要的滲透調節物質,在植物響應逆境脅迫時迅速積累,以增大細胞液濃度,維持細胞膜的滲透平衡,增強細胞的保水能力,緩解逆境脅迫對植物的損傷。SS、SP和Pro的積累可以提高植物的抗寒性,如葡萄幼苗、菠菜和西洋杜鵑等(余麗玲等,2014;Shin et al., 2018;Li & Wang, 2021),是衡量植株抗寒能力的重要指標。有研究發現,SA通過酶促反應促進植物體內SS和Pro含量的積累(Khan et al., 2013;趙欣等,2022)。本研究中,外源SA均提高了火龍果幼苗葉片SS和Pro的含量,可能與糖代謝酶、Pro生物合成酶的活性增強有關;SS和Pro的含量隨著SA濃度的增加呈先上升后下降趨勢,說明SA濃度可能會影響兩種物質的相關酶促反應,低濃度SA更利于加快酶促反應、增加SS和Pro的含量,可能與SA信號轉導途徑中的轉錄因子、基因表達調控有關。

浙江地區冬季經常出現大幅降溫之后的快速升溫,火龍果植株可能會對低溫冷害的反應表現出滯后性,受到低溫冷害幾天內植株形態并無異樣,但在溫度升高時,枝條水漬狀、發黃等冷害特征就會逐漸顯現。因此,在實際栽培過程中,外施水楊酸對于火龍果在低溫時及回暖后的抗冷性均需進一步驗證評價,同時,可配合覆膜、水肥管理等措施,以達到更好的御冷效果。

4 結論

4 ℃低溫脅迫下外源SA處理能減少火龍果幼苗呈現Ⅰ級和Ⅱ級冷害癥狀的百分率,降低MDA含量和REC,提高葉片滲透調節物質含量和抗氧化酶活性,緩解幼苗受到的氧化損傷,增強植株的抗寒能力。SA濃度對低溫脅迫下火龍果幼苗不同理化指標的影響明顯,4 ℃低溫脅迫下火龍果幼苗抗冷性的較適宜SA濃度為0.3 mmol·L-1,可在火龍果越冬育苗中推廣應用。